Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Summary

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Abstract

Zambrion myszy po implantacji ulega poważnym zmianom kształtu po rozpoczęciu gastrulacji i morfogenezy. Cechą charakterystyczną morfogenezy jest tworzenie przejściowych organizatorów, węzła i płytki struny grzbietowej, z komórek, które przeszły przez prymitywną smugę. Prawidłowe tworzenie tych centrów sygnalizacyjnych jest niezbędne do rozwoju planu ciała, a techniki ich wizualizacji są bardzo interesujące dla biologów zajmujących się rozwojem myszy. Węzeł i płytka struny grzbietowej leżą na brzusznej powierzchni gastrulujących zarodków myszy około 7,5 dnia rozwoju embrionalnego (E). Węzeł jest strukturą w kształcie miseczki, której komórki posiadają pojedynczą smukłą rzęskę. Właściwa subkomórkowa lokalizacja i rotacja rzęsek w jamie węzłowej decyduje o asymetrii lewo-prawo. Komórki płytki struny grzbietowej również posiadają pojedyncze rzęski, choć krótsze niż komórki węzłowe. Płytka struny grzbietowej tworzy strunę grzbietową, która działa jako ważny organizator sygnalizacji dla somitogenezy i wzorców neuronalnych. Ponieważ komórki węzła i płytki struny grzbietowej są przejściowo obecne na powierzchni i posiadają rzęski, można je uwidocznić za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Wśród innych technik stosowanych do wizualizacji tych struktur na poziomie komórkowym jest immunofluorescencja całego wierzchowca (WMIF) z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białkom, które są silnie eksprymowane w węźle i płytce strunowej grzbietowej. W tym raporcie opisujemy nasze zoptymalizowane protokoły wykonywania SEM i WMIF węzła i płytki struny grzbietowej w rozwijających się zarodkach myszy, aby pomóc w ocenie kształtu tkanki i organizacji komórkowej w zarodkach ze zmutowanymi zarodkami typu dzikiego i gastrulacji.

Introduction

Gastrulacja i towarzyszące jej ruchy morfogenetyczne są kluczowe dla kształtowania zarodka myszy¹. Zmiany w kształcie i organizacji komórek podczas morfogenezy dyktują informacje o położeniu w celu regulowania losu komórki, a także pozwalają powstałym szlakom sygnałowym precyzyjnie wykonywać swoje funkcje w celu dywersyfikacji nowo powstałych listków zarodkowych¹. Tworzenie przejściowych struktur organizacyjnych i centrów sygnalizacyjnych, takich jak węzeł i struna grzbietowa, jest niezbędne do realizacji programu rozwojowego². Biolodzy rozwojowi wykorzystali różne techniki do badania morfogenezy tych struktur, z których najbardziej godną uwagi jest wykorzystanie reporterów komórkowych i obrazowania na żywo ex vivo w celu śledzenia dynamiki zachowania komórkowego i subkomórkowego^2,3,4. W tym raporcie skupiamy się na opisaniu szczegółów naszych zoptymalizowanych protokołów dla dwóch z tych technik: skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i immunofluorescencji całej góry (WMIF), które były i nadal odgrywają zasadniczą rolę w badaniu morfogenezy węzła i płytki struny grzbietowej, prekursora struny grzbietowej.

Węzeł embrionalny myszy to miseczka komórek w kształcie łzy, która znajduje się na brzusznej powierzchni zarodka myszy wokół wczesnych do późnych etapów fałdowania głowy podczas gastrulacji i morfogenezy (dzień embrionalny, E7.5-E8)^2,5,6,7. Płytka struny grzbietowej morfologicznie emanuje z przodu z węzła³. Każda komórka w węźle i płytce struny grzbietowej charakteryzuje się pojedynczą rzęską, która wystaje na zewnątrz, która jest dłuższa w komórkach węzłowych, ale której długość zmienia się w zależności od etapu rozwoju². Wykazano, że rotacja rzęsek w dole węzła jest ważna dla sygnalizacji, która określa asymetrię lewo-prawo⁴. Płytka struny grzbietowej jest prekursorem struny grzbietowej, centrum sygnalizacyjnego, które jest ważne dla tworzenia wzorów sąsiednich somitów i leżącej nad nią cewy neuronowej³.

Ze względu na atrybuty lokalizacji (powierzchnia), kształt (kubek) i posiadanie odrębnych zewnętrznych struktur komórkowych (rzęsek), SEM jest tradycyjnie używany do wizualizacji węzła i płytki struny grzbietowej oraz badania ich powstawania i struktury^2,7. SEM jest również używany do badania zmian w strukturze samego węzła lub rzęsek na jego komórkach w mutacjach, które wpływają na gastrulację, morfogenezę, a także tworzenie rzęsek^8,9,10. SEM to technika, która wykorzystuje skupioną wiązkę elektronów do badania topologicznej ultrastruktury zewnętrznej powierzchni materiałów takich jak próbki biologiczne¹¹. Próbka jest zwykle utrwalana, suszona, a następnie napylana metalami w celu obserwacji pod skaningowym mikroskopem elektronowym, jak opisaliśmy w kroku 1.

WMIF to technika barwienia służąca do wizualizacji produktów genów, takich jak białka, w trzech wymiarach (3D). WMIF tkanek, narządów, a nawet całych organizmów dostarcza informacji przestrzennych o rozkładzie sygnału i kształcie powstałej struktury w 3D. Technika opiera się na utrwaleniu próbki, a następnie barwieniu jej fluorescencyjnymi koniugatami. Zarodki myszy ~ E7,5 są małe i przezroczyste, dlatego idealnie nadają się do protokołów WMIF do wizualizacji węzła i płytki struny grzbietowej. Na przykład czynnik transkrypcyjny Barchyury (T) ulega ekspresji w jądrach węzła i płytki struny grzbietowej, a w mniejszym stopniu w prążku pierwotnym, wokół E7,5-E8 rozwoju embrionalnego, a dobrze działające przeciwciała przeciwko T firmy WMIF są dostępne na rynku i umożliwiają procedurę barwienia. Komórki węzła i płytki struny grzbietowej charakteryzują się również zwężonymi powierzchniami wierzchołkowymi, które są skierowane na zewnątrz, a zatem mogą być barwione falloidyną sprzężoną z fluorescencją w celu oznaczenia F-aktyny w zwężeniach wierzchołkowych. Używając tych odczynników jako przykładów, kombinacja barwienia T i F-aktyny przez WMIF zapewnia reprezentację węzła i płytki struny grzbietowej w 3D u gastrulatujących zarodków myszy, jak pokazujemy w kroku 2 ⁸. Jednak markery rzęsek, takie jak ARL13B lub acetylowana tubulina, a także inne markery węzła i płytki struny grzbietowej, takie jak FOXA2, mogą być również używane do wykonywania WMIF na rozwijających się zarodkach myszy^3,4.

Wykazaliśmy, że białko 1 (STRIP1) oddziałujące z prążkowiem jest niezbędne do prawidłowego gastrulacji i morfogenezy u zarodka myszy8. STRIP1 jest kluczowym składnikiem kompleksów fosfataz i kinaz oddziałujących z prążkowiem (STRIPAK), które my i inni zaangażowaliśmy w organizację cytoszkieletu aktynowego^8,12. Główną wadą zarodków z mutacją Strip1 jest tworzenie mezodermy osiowej (węzeł i płytka struny grzbietowej) oraz wydłużenie przednio-tylnej osi ciała. Użyliśmy SEM i WMIF do analizy węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach z mutacją typu dzikiego (WT) i Strip1, jak pokazujemy w reprezentatywnych wynikach i odpowiednich rysunkach.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiedzialne władze w Nadrenii Północnej-Westfalii (LANUV-NRW).

1. Skaningowa mikroskopia elektronowa węzła embrionalnego myszy

1. Poświęć ciężarną samicę myszy w ~ E7,5 (stadium 2-4 somitów) przez zwichnięcie szyjki macicy. Szczegółowe wyjaśnienie wraz ze schematami kroków 1.1 - 1.7 jest dostępne w podręcznikach laboratoryjnych zarodków myszy¹³.
2. Otwórz brzuch przez skórę i krezki i usuń macicę za pomocą nożyczek i cienkich kleszczy.
3. Krótko opłucz macicę w wodzie destylowanej i umieść ją na małej, czystej szalce Petriego (6 cm) zawierającej 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
4. Pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą cienkich kleszczy usuń mięśnie macicy, aby uwolnić poszczególne deciduae lub miejsca implantacji.
5. Przytrzymaj każdą deciduę jedną parą kleszczy i użyj drugiej pary, aby wykonać podłużne nacięcie na całej grubości między czerwoną częścią (przyszłe łożysko) a białą częścią (gdzie znajduje się zarodek). Wykonaj powierzchowne perforacje pionowo wzdłuż białej części decidua przylegającej do nacięcia. Rozsuń decidua poziomo na dwie połówki i ostrożnie zgarnij zarodek w białej części decidua.
6. Przenieść zarodek na nową szalkę Petriego (35 mm) ze świeżym, sterylnie przefiltrowanym PBS. Powtórzyć tę czynność dla wszystkich zarodków.
7. Usuń błonę Reicherta, stosunkowo nieprzezroczystą błonę otaczającą zarodek, z każdego zarodka, drażniąc ją jak skarpetę, zaczynając od stożka ektołożyskowego (czerwonawe miejsce implantacji). Do genotypowania należy na tym etapie pobrać mały kawałek (~ 0,1 mm²) woreczka żółtkowego.
8. Pod kapturem chemicznym i przy użyciu odpowiednich rękawiczek ochronnych przenieś zarodki do utrwalacza klasy EM składającego się z 2,5% aldehydu glutarowego w sterylnie przefiltrowanym PBS w probówce do mikrowirówki (1,5 ml) w temperaturze pokojowej. Utrwalić zarodki przez noc w temperaturze 4 °C.
9. Ostrożnie wyjąć utrwalacz aldehydu glutarowego z probówki, nie dotykając zarodków, i wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady. Umyj zarodki trzy razy w sterylnie przefiltrowanym PBS, każdy przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
10. Odwodnić zarodki w serii etanolowej przez 5 minut każdy: 50%, 70%, 85% i trzy razy w 100% lub absolutnym etanolu. Przechowywać zarodki w temperaturze -20 °C w etanolu lub przejść bezpośrednio do następnego etapu.
11. Przenieś zarodki w etanolu do koszy w celu suszenia w punkcie krytycznym (CPD) w suszarce do punktów krytycznych. Napełnij komorę etanolem, aby całkowicie przykryć kosze.
12. Wymienić etanol, ostrożnie przepłukując ciekłym CO₂ dziesięć razy w temperaturze 10 °C. Po ostatnim etapie odcedzić ciekły CO₂ do momentu, aż komora będzie wypełniona do połowy. Podgrzewać do 40 °C, aż ciśnienie osiągnie 80 barów (punkt krytyczny), a ciekły CO₂ zmieni się w gaz. Odczekaj 10 minut, a następnie powoli zdmuchnij gaz przez około 45 minut.
13. Jako łatwiejszą alternatywę dla CPD do suszenia, dodaj heksametyldisilazan (HMDS) w stosunku 1:1 do zarodków w etanolu przez 30 minut. Następnie przenieś zarodki do czystego gogli HMDS na 30 minut. Wyjmij zarodki z płynu za pomocą pipety i pozostaw je do wyschnięcia na 30 minut.
    UWAGA: Obie metody suszenia sprawdziły się równie dobrze w naszych dłoniach.
14. Za pomocą cienkiej szczoteczki zamontuj wysuszone zarodki stroną brzuszną (węzłem) do góry na kikutu SEM z dwustronną taśmą.
15. Włóż kikuty z zarodkami do maszyny do napylania w celu powlekania cząstek złota, która jest preferowana do ładowania długich, cienkich rzęsek. Nałożyć warstwę 120-150 A; Czas zależy od prądu, który będzie się różnił w zależności od próbki.
16. Umieść pokryte kikuty z zarodkami w mikroskopie SEM, zastosuj próżnię i obserwuj komórki węzła embrionalnego i płytki struny grzbietowej z rzęskami w powiększeniach od 1000X do 15 000X.

2. Immunofluorescencja całego węzła myszy i płytki struny grzbietowej

1. Używając lodowatego PBS z 0,05% Tween 20 (PBSTw), wykonaj kroki 1.1-1.7 powyżej, aby usunąć zarodki w E7.75 i umieść je w PBSTw na szalce Petriego o średnicy 35 mm na lodzie.
2. Pod kapturem chemicznym i przy założeniu odpowiedniej ochrony (rękawice) przenieś zarodki do utrwalającego roztworu 4% paraformaldehydu w PBS w probówce do mikrowirówki. Utrwalić zarodki przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Ostrożnie wyjmij utrwalacz paraformaldehydu z tubki, nie dotykając zarodków i wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na odpady. Umyj zarodki trzykrotnie w PBS zawierającym 0,2% Triton X-100 (PBSTr) przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej. Wykonaj wszystkie etapy mycia i następnej inkubacji na wytrząsarce do nutacji.
4. Usunąć ostatnie płukanie i dodać roztwór blokujący zawierający PBSTr z 10% surowicą inaktywowaną termicznie (z gatunku gospodarza przeciwciała drugorzędowego). Blokować od 2 godzin do nocy (lub dłużej) na nutatorze w temperaturze 4 °C.
5. Usunąć blokadę i dodać ~ 1 ml pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w roztworze blokującym, na przykład przeciwciała anty-T w rozcieńczeniu 1:500. Inkubować przez noc (lub dłużej) na nutatorze w temperaturze 4 °C.
6. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i zachowaj je do późniejszego wykorzystania, dodając azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% (1 μl 20% zapasu na 1 ml roztworu przeciwciała). Przeciwciało może być ponownie użyte ~ 10 razy. Przepłukać zarodki dwukrotnie PBSTr, a następnie przepłukać je trzykrotnie przez 30 minut każdy na nutatorze w temperaturze 4 °C.
7. Zastąp płukanie przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorescencją, przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza, rozcieńczonym w stosunku ~ 1:1000 przez noc (lub dłużej) na nutatorze w temperaturze 4 °C.
8. Usunąć przeciwciało wtórne i przepłukać dwukrotnie PBSTr, a następnie przemyć trzy razy przez 30 minut PBSTr.
9. Zastąp ostatnie pranie PBSTr zawierającym falloidynę sprzężoną z fluorescencją w proporcji 1:500, w celu wybarwienia F-aktyny, i 1:1000 DAPI, w celu wybarwienia jąder, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Spłukać dwukrotnie w PBSTr i raz umyć PBSTr przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
11. Zastąp PBSTr PBS i pozostaw zarodki na lodzie. Przygotować czyste, dodatnio naładowane szkiełka podstawowe (60 x 24 mm) i szkiełka nakrywkowe (24 x 24 mm) oraz wodne podłoża mocujące na bazie glicerolu, na przykład 90% glicerolu w 1xPBS i odczynnika zapobiegającego blaknięciu, w celu zamontowania zarodków.
12. Umieść dwa kawałki przezroczystej taśmy w odległości ~ 15 mm od siebie na przezroczystej części szkiełka. Stworzy to wystarczającą ilość przestrzeni 3D (w wymiarze Z), która pozwoli na spłaszczenie zarodków, ale nie ich całkowite zgniecenie.
13. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie przesunąć zarodki za pomocą przeciętej pipety P200 (aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na przeniesienie zarodka i nie uszkodzić go) do szkiełka.
14. Za pomocą cienkich kleszczy wykonaj dwa pełne nacięcia po bocznych stronach woreczka żółtkowego, aby rozwinąć zarodek. Umieść zarodek stroną brzuszną (węzeł i płytka struny grzbietowej) do góry (grzbietem cewy nerwowej w dół na szkiełku).
15. Dodać 50 μl pożywki montażowej na zarodek. Umieść 4-5 zarodków na szkiełku. Dodaj odrobinę podłoża montażowego po stronie szkiełka nakrywkowego, która najpierw dotknie szkiełka nakrywkowego (górna lub dolna strona), a następnie umieść go okrakiem na dwóch kawałkach taśmy i powoli opuść na zarodki za pomocą cienkich kleszczyków lub wygiętej cienkiej igły, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.
16. Wyczyść nadmiar mediów montażowych za pomocą chłonnej chusteczki. Uważaj, aby nie przesunąć szkiełka nakrywkowego w tym procesie.
17. Używając dużej ilości lakieru do paznokci, uszczelnij boki szkiełka nakrywkowego, nie przesuwając go.
18. Obserwuj pod skaningowym mikroskopem konfokalnym.

Results

Aby zbadać tworzenie się węzła w zmutowanych zarodkach WT i Strip1 w ~ E7.5, użyliśmy SEM zgodnie z opisem w Kroku 1 i pokazanym w Rysunek 1⁸. Ultrastrukturalne szczegóły topologii zewnętrznej za pomocą SEM były dość pouczające i od razu stało się jasne, że w przeciwieństwie do węzła w kształcie dołu u zarodków WT, zmutowane zarodki miały spłaszczony i nieregularny węzeł. Większe powiększenie zarodków uwidoczniło charakterystyczne rzęski na komórkach węzłów, które jednoznacznie je zidentyfikowały. Pozorna mniejsza gęstość rzęsek u mutanta może być spowodowana utratą struktury i krzywizny dołu węzłowego lub mniejszą liczbą komórek węzłowych. Płytka struny grzbietowej, która wydaje się emanować z węzła, była również nieregularna u zmutowanych zarodków. Można je było rozpoznać po krótszych rzęskach. Dlatego SEM był ważny dla ujawnienia defektów morfogenezy węzłów w mutantach Strip1⁸. Użyliśmy również SEM w poprzednich badaniach, aby pokazać brak rzęsek w węźle embrionalnym mutantów, które nie miały centrioli, które stanowią szablon dla cilia⁹.

Aby zbadać defekty tworzenia się mezodermy osiowej w zarodkach zmutowanych Strip1 na poziomie komórkowym, użyliśmy WMIF, jak opisano w Kroku 2 i pokazano w Rysunek 2. Stosując tę technikę, węzeł i płytkę struny grzbietowej można było łatwo zidentyfikować za pomocą barwienia F-aktyną i T. Komórki węzła WT i płytki struny grzbietowej mają zwężone domeny wierzchołkowe, w których F-aktyna została wzbogacona, a barwienie jądra T było widoczne. Płytka struny grzbietowej rozciągała się rostralnie w WT, ale była krótka i nieregularna u mutanta. Dane wykazały, że organizacja F-aktyny jest nieprawidłowa w różnych listkach zarodkowych zmutowanych zarodków, w tym w osiowej mezodermie⁸. W związku z tym projekt WMIF odegrał zasadniczą rolę w badaniu wad w tworzeniu węzłów i płytek strunowych w zarodkach z mutacją Strip1.

Rysunek 1. Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawnia defekty w morfogenezie węzłów w zarodkach myszy z mutacją Strip1. (Góra) Analizy SEM zmutowanych brzusznych węzłów embrionalnych i płytek struny grzbietowej WT i Strip1 (Noto)⁸. Przykład obrazu zarodka WT w małym powiększeniu jest pokazany po lewej stronie. (Na dole) Większe powiększenia środka węzłów pokazane na górze, odsłaniające długie monorzęski wystające z komórek węzłowych. Przednia strona jest na górze we wszystkich panelach. Podziałka skali: 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Immunofluorescencja całego wierzchowca pokazuje nieprawidłowy węzeł i płytkę struny grzbietowej na poziomie komórkowym w zarodkach z mutacją Strip1. (Góra) Brzuszne renderowanie 3D (oprogramowanie Volocity) WMIF na zmutowanych zarodkach WT i Strip1 przy użyciu kombinacji barwienia falloidyną sprzężoną fluorescencyjnie (F-aktyna) i przeciwciałem T (zielony). (Na dole) Więcej przykładów barwienia pokazanych powyżej, skupiających się na węźle z większym powiększeniem i z uwzględnieniem DAPI. Przednia strona jest na górze we wszystkich panelach. Podziałka skali: 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tej pracy pokazujemy, jak wykonać SEM i WMIF w celu wizualizacji węzła embrionalnego myszy i płytki struny grzbietowej. Niewielki rozmiar gastrulatujących zarodków myszy ~ E7,5 i obecność tych struktur na powierzchni sprawiają, że idealnie nadają się do badania przy użyciu technik opisanych ^2,7,8. Dostępność dobrych przeciwciał, takich jak markery T i rzęsek, dostarcza doskonałych informacji 3D przy użyciu WMIF na temat struktury, organizacji i tworzenia tych niezbędnych organizatorów embrionalnych⁸.

Ponieważ rozwój embrionalny myszy przebiega w bardzo szybkim tempie, a węzeł i płytka struny grzbietowej są tylko przejściowo obecne na powierzchni zarodka, czas ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tych eksperymentów ^2,3. Na przykład 2-4 zarodki somitowe są dobre do analizy SEM dojrzałego dołu węzłowego z długimi rzęskami. W znacznie wcześniejszych lub późniejszych zarodkach (na przykład 12 godzin przed lub po) węzeł może nie być obecny na powierzchni. WMIF jest pod tym względem nieco bardziej elastyczny, ale same struktury są również przejściowe podczas rozwoju, a czas w tym przypadku zależy od zainteresowań badaczy.

Czystość odczynników jest również niezbędna dla powodzenia tych technik, zwłaszcza w badaniu ultrastruktury za pomocą SEM. Drobne zanieczyszczenia, które przyklejają się do zarodków, zwykle skutkują ogromnymi artefaktami.

Przetestowaliśmy dwie różne metody utrwalania zarodków pod kątem SEM, jedną przy użyciu połowy utrwalacza Karnovsky'ego (2,5% aldehydu glutarowego, 2% paraformaldehydu i 0,1 M buforu kakodylowego) i prostszej 2,5% aldehydu glutarowego w 1x PBS. Wolimy używać aldehydu glutarowego i utrwalacza PBS, jak opisano w kroku 1, jednak my i inni z powodzeniem zastosowaliśmy również utrwalacz połowy Karnovsky'ego do SEM.

Porównaliśmy również dwie metody suszenia zarodków pod kątem SEM i nie znaleźliśmy różnicy w jakości próbki przy użyciu suszarki w punkcie krytycznym lub HMDS, jak opisano w kroku 1 i opisano w innym miejscu¹⁴.

W Kroku 2 przetestowaliśmy osadzanie zarodków po końcowych etapach mycia w 1% niskotopliwej agarozie zamontowanej na naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm, a następnie posypanie jej ~ 10 μL podłoża montażowego. Ta metoda osadzania działa i zachowuje oryginalną strukturę 3D zarodka i powiązanych struktur; Jednak do zobrazowania próbki wymagany jest mikroskop wielofotonowy, ponieważ zwykły mikroskop konfokalny nie może sięgać tak głęboko w nienaruszone zarodki (~ 1 mm).

Uważamy, że zastosowanie tych dwóch technik daje uzupełniające się informacje na temat struktury węzła i płytki struny grzbietowej podczas normalnego rozwoju oraz u mutantów, które wykazują defekty w tworzeniu tych struktur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1,1,3,3,3 Heksametylodylazan (HMDS)	Carl Roth	3840
Przeciwciało anty-T	R& D Systems	AF2058
Suszarka do punktów krytycznych	Blazers Union	CPD 020
DAPI	AppliChem	A4099,0005
Roztwór dialdehydu glutarowego 25%	Merck	1042390250
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
Tween 20	AppliChem	A4974,0500
Jednostka powlekająca SEM Pomoce	agarowe PS3 do mikroskopii elektronowej	Mikroskop PS3
SEM Quantum FEG 250	ThermoFisher Scientific (FEI)	Quantum FEG 250