Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

18.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58323

⸱

23 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine, University of Cincinnati, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 4Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Streszczenie

Hepatocyty są komórkami miąższowymi wątroby i realizują wiele funkcji metabolicznych, w tym syntezę i wydzielanie białek niezbędnych dla homeostazy energetycznej systemu. Hepatocyty pierwotne wyizolowane z mysiej wątroby stanowią cenne narzędzie biologiczne do zrozumienia właściwości funkcjonalnych lub zmian zachodzących w wątrobie. W niniejszym artykule opisano metodę izolacji i hodowli pierwotnych hepatocytów myszy poprzez wykonanie dwuetapowej techniki perfuzji kolagenazy i omówiono ich wykorzystanie do badania metabolizmu białek. Wątroba dorosłej myszy jest sekwencyjnie perfundowana glikolem etylenowym i kwasem tetraoctowym (EGTA) i kolagenazą, a następnie izoluje hepatocyty za pomocą buforu gradientu gęstości. Te izolowane hepatocyty są żywotne na płytkach hodowlanych i zachowują większość cech obdarzonych hepatocytami. Te hepatocyty mogą być wykorzystywane do oceny metabolizmu białek, w tym powstającej syntezy białek z odczynnikami nieradioaktywnymi. Pokazujemy, że izolowane hepatocyty są łatwo kontrolowane i charakteryzują się wyższą jakością i stabilnością objętościową syntezy białek związanej z metabolizmem energetycznym dzięki wykorzystaniu chemoselektywnej reakcji ligacji z metodą wykrywania białka tetrametylorodaminy (TAMRA) i analizami western blot. Dlatego metoda ta jest cenna dla badania powstającej syntezy białek wątrobowych związanych z homeostazą energetyczną. Poniższy protokół przedstawia materiały i metody izolacji wysokiej jakości pierwotnych hepatocytów myszy i wykrywania powstającej syntezy białek.

Wprowadzenie

Białko jest ważnym elementem odżywczym i około 50% suchej masy ludzkiego ciała składa się z białek, które mają kilka biologicznych cech i funkcji1. W związku z tym synteza białek jest jednym z najbardziej energochłonnych zdarzeń, a zmiana metabolizmu białek jest silnie związana z rozwojem chorób, w tym chorób metabolicznych2,3,4. W wątrobie biosynteza białek odpowiada za około 20–30% całkowitego zużycia energii5,6. Ponadto białka funkcjonują nie tylko jako pasywne lub budulcowe wątroby, ale także jako aktywne czynniki pośredniczące w sygnałach wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo w celu regulacji metabolizmu ogólnoustrojowego7. Na przykład, obniżony poziom albuminy surowicy, która jest syntetyzowana i wydzielana przez wątrobę i najobficiej występujące białko w osoczu8, zwiększa ryzyko rozwoju cukrzycy typu 29,10,11, podczas gdy wyższe stężenie albuminy surowicy chroni przed rozwojem zespołu metabolicznego12. Ponadto zaburzenie lub zaburzenie działania wydzielniczych lub błonowych białek wątrobowych, które modulują homeostazę cholesterolu, w tym lipoprotein, LDLR i LRP1, może prowadzić do rozwoju insulinooporności, hiperlipidemii lub miażdżycy13. Dlatego identyfikacja molekularnych mechanizmów patofizjologicznych, które są zaangażowane w zaburzenia metabolizmu białek w wątrobie i związane z tym powikłania metaboliczne, może być przydatna do odkrywania nowych podejść farmakologicznych do opóźniania początku lub leczenia chorób metabolicznych, takich jak insulinooporność, cukrzyca i niealkoholowe stłuszczenie wątroby.

Synteza białek jest ściśle związana ze statusem energii komórkowej (np. wytworzenie jednego wiązania peptydowego podczas etapu wydłużania syntezy białek wymaga 4 wiązań fosfodiestrowych14) i jest regulowana przez szlaki molekularne, które wykrywają między- i wewnątrzkomórkową dostępność składników odżywczych15,16. Kinaza białkowa aktywowana AMP (AMPK) jest jednym z wewnątrzkomórkowych czujników energii, które utrzymują homeostazę energetyczną17. Gdy AMPK jest aktywowany, gdy poziom energii komórkowej staje się niższy, AMPK i jego docelowe substraty działają w celu stymulowania szlaków katabolicznych i hamowania procesów anabolicznych, w tym syntezy białek18,19. W regulacji syntezy białek pośredniczy fosforylacja wielu czynników translacyjnych i białek rybosomalnych20. Warto zauważyć, że ssaczy cel kompleksu rapamycyny 1 (mTORC1), głównego czynnika napędzającego syntezę białek, jest jednym z głównych celów AMPK21. Aktywacja szlaku mTORC1 zwiększa wzrost i proliferację komórek poprzez stymulację translacji białek i autofagii20,21. Dlatego logiczne jest, że aktywacja AMPK może hamować syntezę białek za pośrednictwem mTORC122. Rzeczywiście, aktywacja AMPK przeciwdziała i bezpośrednio fosforyluje mTORC1 na resztę treoniny 2446 (Thr2446), prowadząc do jej inaktywacji23 i zahamowania biosyntezy białek24. Co więcej, AMPK może pośrednio hamować funkcję mTORC1 poprzez fosforylację i aktywację kompleksu stwardnienia guzowatego 2 (TSC2) 25, który jest regulatorem kaskady sygnalizacyjnej mTORC1. Krótko mówiąc, rozregulowanie tych szlaków w wątrobie jest często związane z rozwojem chorób metabolicznych i dlatego istnieje pilna potrzeba ustanowienia skutecznych narzędzi eksperymentalnych w celu zbadania roli tych szlaków w regulacji metabolizmu energii i białek w hepatocytach.

Istnieje większe podobieństwo między funkcjonalnymi właściwościami izolowanych pierwotnych hepatocytów i hepatocytów in vivo niż w przypadku in vitro linii komórkowych pochodzących z wątroby26,27,28. Wykazano, że pierwotne ludzkie hepatocyty mają 77% podobieństwo do biopsji wątroby, podczas gdy komórki HepG2, które są dobrze zróżnicowanymi komórkami raka wątroby i są szeroko stosowane do badania funkcji wątroby, wykazują mniej niż 48% w kontekście profili ekspresji genów29. Dlatego wykorzystanie pierwotnych hepatocytów, a nie unieśmiertelnionych komórek hodowlanych, ma kluczowe znaczenie w badaniu funkcji i fizjologii wątroby, a dostępnych jest kilka protokołów izolacji i hodowli pierwotnych hepatocytów, zwłaszcza od szczurów30,31. Podczas gdy hepatocyty szczurów są przydatne przy stosunkowo wyższej wydajności komórek, hepatocyty myszy mają większy potencjał w wielu aspektach naukowych ze względu na szeroką dostępność myszy modyfikowanych genetycznie. Istnieje jednak kilka wyzwań technicznych związanych z izolacją zdrowych i licznych hepatocytów pierwotnych od myszy w celu oceny komórkowej i molekularnej: po pierwsze, wprowadzenie kaniuli w celu perfuzji wątroby za pomocą odczynników buforowych jest bardzo trudne do wykonania ze względu na małą i cienką żyłę wrotną myszy lub żyłę główną dolną; po drugie, dłuższy czas manipulacji komórkami podczas izolacji może spowodować zmniejszenie liczby i jakości komórek; Po trzecie, nieenzymatyczne metody mechanicznego rozdzielania mogą powodować poważne uszkodzenia i powodować niską wydajność żywotnych izolowanych hepatocytów pierwotnych32,33. W latach osiemdziesiątych XX wieku wprowadzono technikę perfuzji kolagenazy do izolowania hepatocytów z wątroby zwierząt34. Metoda ta opiera się na perfuzji kolagenazy w wątrobie35,36,37, infuzja wątroby roztworem chelatora wapnia38,39, trawienie enzymatyczne i mechaniczna dysocjacja miąższu wątroby35. W pierwszym etapie wątroba myszy jest perfundowana wolnym buforem wapnia [Ca2+] zawierającym chelator [Ca2+] (kwas etylenodiaminotetraoctowy, EDTA). W drugim etapie wątroba myszy jest perfundowana buforem zawierającym kolagenazę w celu hydrolizy interakcji między macierzą komórkową a zewnątrzkomórkową. W przeciwieństwie do buforu użytego w kroku pierwszym, obecność jonów [Ca2+] w buforze drugiego etapu jest wymagana do efektywnej aktywności kolagenazy, po czym strawiona wątroba musi być dalej delikatnie i mechanicznie oddzielona za pomocą kleszczy między torebką wątrobową a tkanką miąższową. Na koniec tkanka łączna jest usuwana przez filtrowanie, a następnie odwirowanie oddziela żywotne hepatocyty zarówno od komórek niemiąższowych, jak i od nieożywionych hepatocytów za pomocą bufora gradientu gęstości40,41,42. W niniejszym badaniu pokazujemy zmodyfikowaną dwuetapową technikę perfuzji kolagenazy w celu wyizolowania pierwotnych hepatocytów z wątroby myszy w celu analizy syntezy białek.

Radioznakowanie białek jest powszechnie używane do ilościowego określania poziomów ekspresji, szybkości obrotu i określania biologicznej dystrybucji białek43 ze względu na wysoką czułość wykrywania radioaktywności44. Jednak użycie izotopów promieniotwórczych wymaga ściśle kontrolowanych warunków i procedur badawczych45. Opracowano alternatywne metody nieradioaktywne, które zyskują coraz większą popularność. Reakcja chemoselektywnej ligacji z metodą wykrywania białka tetrametylorodaminy (TAMRA) jest jedną z nich i opiera się na chemoselektywnej reakcji między grupami azydkowymi i alkinowymi46, które można wykorzystać do analizy zdarzeń komórkowych, takich jak wykrywanie powstającej syntezy białek i podklas glikoprotein zmodyfikowanych grupą azydkową. W celu powstającej syntezy białek, L-azydohomoalanina (L-AHA, aminokwas modyfikowany azydkiem) może być metabolicznie włączona do białek i wykryta za pomocą metody wykrywania białek TAMRA47. Stosując ten test w pierwotnych hepatocytach myszy, pokazujemy, że powstające tempo syntezy białek jest ściśle związane z dostępnością ATP z aktywacji mitochondriów i AMPK (Figura 1).

Podsumowując, wykorzystanie pierwotnych hepatocytów myszy jest kluczowe dla badania metabolizmu białek i energii, a ilościowe określenie powstającej syntezy białek jest cenne dla uzyskania wglądu w fizjologiczną rolę szlaków istotnych dla rozwoju i leczenia chorób związanych z hepatocytami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół zawiera użycie myszy laboratoryjnych. Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez komitety ds. opieki nad zwierzętami Centrum Medycznego Szpitala Dziecięcego w Cincinnati.

1. Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy

  1. Przygotowania przed izolacją
    1. Przygotować 450 ml buforu gradientu gęstości 40%, jak opisano w Tabeli 1 i utrzymywać w temperaturze 4 °C (15 ml/mysz).
    2. Przygotować 500 ml pożywki Williamsa zgodnie z opisem w Tabeli 1 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować 500 ml DMEM zgodnie z opisem w Tabeli 1 i trzymać na lodzie (30 ml / mysz).
    4. Przygotować 500 ml buforu HBSS (-) zgodnie z opisem w Tabeli 1 i przechowywać w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej (40 ml/mysz).
    5. Przygotować 500 ml buforu HBSS (+) z 0,3 mg/ml kolagenazy typu X, jak opisano w Tabeli 1, z 30-minutową inkubacją w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej (40 ml/mysz).
    6. Ustawić pompę perfuzyjną, umieszczając rurkę do podawania dożylnego (IV) w poprzek pedału nożnego zatrzasku i sprawdzając przepływ roztworu płuczącego bez pęcherzyków powietrza.
    7. Rozgrzać grzałkę rurową w temperaturze 42 °C.
    8. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  2. Znieczulenie i perfuzja
    1. Wyczyść obszary robocze i pompę.
    2. Wypłucz rurkę dożylną podłączoną do pompy, dokładnie przepuszczając 70% etanolu przez 10 minut.
    3. Usuń resztki etanolu z rurki dożylnej podłączonej do pompy, całkowicie spłukując DDW przez 10 minut.
    4. Przetrzyj nożyczki i kleszcze 70% etanolem.
    5. Umieść mysz w plastikowym pojemniku z siatkowym dnem i z 2 ml gazy nasączonej izofluranem pod siatką, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu.
    6. Ocenia głębokość znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca
      7. ).
    7. Wyjmij mysz, gdy osiągnie żądaną głębokość znieczulenia.
      UWAGA: Czas indukcji znieczulenia nie powinien przekraczać 1 minuty.
    8. Skonstruuj stożek nosowy za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml z wkładką nasączoną izofluranem o pojemności 1 ml wciśniętą do końca probówki.
    9. Kontroluj głębokość znieczulenia, zbliżając lub oddalając stożek nosa od nozdrzy myszy.
    10. Umieść mysz na platformie roboczej brzuszną stroną skierowaną do góry.
    11. Rozpyl 70% etanolu na okolice brzucha myszy, a następnie otwórz jamę brzuszną, wykonując duże poprzeczne nacięcie skóry właściwej i otrzewnej za pomocą ostrych nożyczek i kleszczy zębatych.
    12. Następnie wykonaj pionowe cięcie warstw brzusznych, aż wszystkie narządy jamy brzusznej zostaną całkowicie odsłonięte, używając ostrych nożyczek i kleszczy zębatych.
    13. Przesuwaj jelito cienkie i grube w kierunku lewej strony myszy za pomocą autoklawowanej końcówki bawełnianej, aż wątroba, żyła wrotna i żyła główna dolna (IVC) zostaną wyraźnie odsłonięte.
    14. Wprowadzić cewnik 24 G do IVC tuż przy rozwidleniu prawej żyły nerkowej, ostrożnie, bez podawania rąk, aby uniknąć uszkodzenia IVC i krwawienia.
      UWAGA: Jeśli podczas wprowadzania cewnika do kroplówki dojdzie do krwawienia, należy spróbować wprowadzić nowy cewnik do żyły wrogiej.
    15. Wyjmij igłę cewnika i kontroluj położenie kaniuli, aby uniknąć wydostania się z IVC, a następnie połącz kaniulę 24 G z rurką perfuzyjną za pomocą łącznika.
      UWAGA: Unikaj obecności pęcherzyków powietrza przed rozpoczęciem perfuzji.
    16. Rozpocznij perfuzję wątroby ciepłym HBSS (-) o szybkości przepływu 4 ml/min i szybko odetnij żyłę śledzionową, aby odprowadzić krew wewnętrzną za pomocą nożyczek.
      UWAGA: Jeśli kaniulacja się powiedzie, wątroba zacznie blednąć z powodu wstecznej dystrybucji buforu z IVC do żył wątrobowych. Żyła wrotna jest utworzona przez połączenie żył śledziony i żył krezkowych górnych; Dlatego przecięcie żyły śledziony jest całkiem bezpieczne, ponieważ jest ona duża i dystalna od wątroby.
    17. Kontynuować perfuzję z 35 ml ciepłego HBSS (-).
      UWAGA: Wątroba stanie się blada, jeśli perfuzja jest odpowiednia, a mysz nadal żyje pod narkozą na tym etapie.
  3. Trawienie i ekstrakcja
    1. Perfone wątrobę myszy ciepłymi 35 ml HBSS (+), w tym kolagenazy typu X, przy szybkości przepływu 4 ml / min.
    2. Co kilka minut zaciskaj żyłę śledzionową za pomocą kleszczy przez ~10 s, aby cała objętość HBSS (+) mogła dyfundować do wszystkich anatomicznych części wątroby.
      UWAGA: Wątroba zaczyna puchnąć po zaciśnięciu żyły śledziony z powodu przekrwienia bufora.
    3. Wlać 5 ml przygotowanego ciepłego HBSS (+) z kolagenazą typu X do 100 mm szalki Petriego pod koniec procesu perfuzji.
    4. Przed zatrzymaniem pompy odetnij perfundowaną wątrobę od reszty ciała, aby uniknąć cofania się krwi do wątroby, usuń pęcherzyk żółciowy kleszczami, a następnie delikatnie przetrzyj wątrobę ręcznikiem papierowym, aby usunąć krew.
    5. Przenieść wątrobę na szalkę Petriego, która zawiera 5 ml przygotowanego ciepłego HBSS (+) i delikatnie wyjąć kapsułkę wątrobową za pomocą kleszczyków z prostą końcówką.
      UWAGA: Torebka wątroby to cienka warstwa tkanki łącznej otaczająca wątrobę.
    6. Tkankę miąższową należy dokładnie rozprowadzić za pomocą kleszczy. Dodaj 15 ml zimnego DMEM na szalkę Petriego.
      UWAGA: Pożywka stanie się mętna z powodu komórek miąższowych, jeśli wątroba jest dobrze trawiona.
    7. Delikatnie potrząśnij rozdartą wątrobą, aby uwolnić pozostałe komórki miąższowe do pożywki i dodaj kolejne 15 ml zimnego DMEM do szalki Petriego, aby uzyskać resztę komórek.
    8. Przenieść DMEM z rozpuszczoną wątrobą przez sitko do komórek 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w lodzie.
  4. oczyszczanie
    1. Odwirować zawiesinę komórek o sile 60 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację próżniową i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM.
    2. Dodać zawieszony osad jako cienką warstwę na wierzchu bufora gradientu gęstości 40% i odwirować przy 800 x g przez 10 minut bez hamulca w temperaturze 4 °C.
    3. Ostrożnie usunąć supernatant, w tym górną warstwę (DMEM) i środkową warstwę (martwe lub niemiąższowe), ale nie dolną warstwę (Osad: pierwszorzędowe hepatocyty miąższowe).
    4. Ponownie zawiesić komórki pierwotne za pomocą 2-3 ml pożywki Williama E i przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia martwych komórek na ściance probówki.
    5. Dodać 7-8 ml pożywki William's E, delikatnie wymieszać i odwirować w temperaturze 800 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
    6. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację próżniową, a następnie ponownie zawiesić osad z 10, 20 lub 30 ml pożywki E Williama (w zależności od wielkości osadu).
    7. Policz komórki przy użyciu automatycznego licznika komórek.
    8. Wysiewać pożywkę E Williama, przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny, a następnie zastąpić podłoże 10% pożywką FBS DMEM z Anti-Anti w celu usunięcia martwych lub nieprzyłączonych komórek i do inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C.
    9. Następnego dnia pierwotne hepatocyty myszy są gotowe do użytku eksperymentalnego.

2. Test reakcji ligacji chemoselektywnej do wykrywania powstającej syntezy białek

  1. Znakowanie metaboliczne
    1. (Obróbka wstępna) Przemyć pierwotne hepatocyty dwukrotnie ciepłym PBS w temperaturze 37 °C i dodać pożywkę DMEM wolną od metioniny przez 30 minut, aby wyczerpać cytoplazmatyczne rezerwy metioniny.
      UWAGA: L-azydohomoalanina, jest aminokwasem i analogiem metioniny, zawiera ugrupowanie azydo, które może być włączone do białek podczas biosyntezy białek komórkowych, tak że zubożenie cytoplazmatycznej metioniny zwiększy karmienie i włączenie L-azydohomoalaniny do nowo zsyntetyzowanych białek hodowanych pierwotnych hepatocytów.
    2. (Leczenie) Przemyć pierwotne hepatocyty dwukrotnie ciepłym PBS w temperaturze 37 °C i dodać pożywkę DMEM bez metioniny z 25 μM AHA (L-azydohomoalaniną) przez 4–6 godzin.
    3. Dodaj dowolną specyficzną substancję chemiczną (np. 10 μM rotenon) do pożywki przez 4-6 godzin w obecności AHA w celu zbadania jej wpływu na powstające poziomy ekspresji białka.
    4. Po inkubacji usunąć pożywkę przez aspirację próżniową i trzykrotnie przemyć hepatocyty pierwotne zimnym PBS.
    5. Dodać 200 μl buforu do lizy do płytki i inkubować przez 15-30 minut na lodzie, następnie przechylić płytkę i pobrać cały lizat komórkowy do probówki o pojemności 1,7 ml.
      UWAGA: Należy zauważyć, że lizat komórkowy jest bardzo lepki podczas zbierania komórek.
    6. Poddaj sonikację lizatu komórkowego na lodzie przez 5 s trzykrotnie za pomocą sonografu sondowego do rozpuszczania białek i dyspersji DNA.
    7. Wirować lizat komórkowy przez 5 minut, odwirować lizat komórkowy przy 21,130 x g przez 10 minut w temperaturze 4 o°C, a następnie przenieść klarowny supernatant do nowej probówki. Zmierz stężenie białka dwukrotnie.
      UWAGA: Na tym etapie próbki białka mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez dwa tygodnie, jeśli nie zostaną natychmiast wykorzystane.
  2. Znakowanie powstającego białka modyfikowanego azydem
    1. Przygotować składniki (A+B), dodając 60 μl składnika (A) do składnika (B).
      UWAGA: Roztwór zmienia kolor na jasnoróżowy po dodaniu składnika (A) do (B).
    2. Przygotować (D) i (E) zgodnie z protokołem.
    3. Weź 20–40 μg lizatu komórkowego i dodaj 50 μl 2x bufor reakcyjny (składnik A+B), a następnie dostosuj objętość do 80 μl, dodając DDW i wiruj przez 5 s.
    4. Dodać 5 μl CuSO4 (składnik C) i wirować przez 5 s.
    5. Dodać 5 μl buforu reakcyjnego dodatek 1 (świeżo przygotowany składnik D), następnie wirować przez 5 s i odczekać 3 minuty.
    6. Dodać 10 μl odtworzonego buforu reakcyjnego dodatku 2 (składnik E), następnie wirować przez 5 s i obracać próbki przez 20 minut w temperaturze 4 °C za pomocą maszyny wieloobrotowej.
      UWAGA: Roztwór zmienia kolor na jasnopomarańczowy po dodaniu składnika (E). Próbki należy chronić przed światłem podczas obracania.
    7. Dodaj 300 μl metanolu i wiruj przez 5 s, dodaj 75 μl chloroformu i wiruj przez 5 s, następnie dodaj 200 μl DDW i wiruj przez 5 s.
    8. Odwirować próbki w temperaturze 21,130 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut, następnie odrzucić wodny supernatant i pozostawić osad.
    9. Dodaj 250 μl metanolu do probówki, wiruj i ponownie wiruj przez 5 minut w temperaturze 21 130 x g.
    10. Odrzucić supernatant, a następnie przykryć próbki niestrzępiącą się chusteczką i pozostawić granulki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Analiza PAGE i western blotting
    1. Rozpuścić granulat w 20 μl buforu ładującego bez β-merkaptoetanolu, wirować przez 10 minut, podgrzewać w temperaturze 70 °C za pomocą bloku grzewczego przez 10 minut. Następnie załaduj próbki do 10% żelu SDS (1,5 mm) w celu wykrycia tetrametylorodaminy (TAMRA).
    2. Wykrywanie sygnału AHA za pomocą skanera laserowego o zmiennym trybie pracy w celu precyzyjnego określenia ilościowego powstających białek.
    3. Myj żel z DDW przez 15 minut.
    4. Następnie zabarwić 10% żel SDS szybkim i czułym odczynnikiem Coomassie-dye przez 15–60 minut, aby wykryć całkowite białka jako kontrolę.
    5. Odbarwiaj żel za pomocą DDW przez 1-2 godziny i uzyskaj obraz za pomocą obrazowania fluorescencyjnego UV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja pierwotnych hepatocytów mysich daje wydajność wynoszącą około 20 x 106 łącznie komórek/mysz. Histologicznie żywe i przytwierdzone pierwotne hepatocyty mają kształt wieloboczny lub typowy sześciokąt z wyraźnie zarysowaną granicą błonową po 24 h inkubacji (Rysunek 2).

Aby potwierdzić, czy wyizolowane komórki są pierwotnymi hepatocytami, porównaliśmy poziomy ekspresji białka albumin...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż zaproponowano kilka nieśmiertelnych linii komórek wątroby i wykorzystano je do badania funkcji wątroby 49,50,51,52, komórkom tym na ogół brakuje ważnych i podstawowych funkcji normalnych hepatocytów, takich jak ekspresja albuminy (ryc. 3). W związku z tym powszechnie uznaje się, że wykorzystanie pierwotnych hepatocytów jest cenną opcją do badania fizjologii...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy zaznaczają, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy doktorom Joonbae Seo i Vivian Hwa za ich wkład naukowy i dyskusję. Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia (NIH) (R01DK107530). T.N. był wspierany przez PRESTO z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii. Część tego badania została wsparta grantem z NIH (P30DK078392) dla Digestive Disease Research Core Center w Cincinnati.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor HEPESFisher ScientificBP310-500
D-glukozaFisher ScientificD16-500
Kwas glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylo)-tetraoctowegoAmericanBioAB00505-00025
Antybiotyk-Antybiotyk (100x)Gibco15240-062
HBSS (10x) bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowejGibco14185-052
Dihydrat chlorku wapnia (CaCl2.2H2O)Fisher ScientificC79-500
Bufor gradientu gęstościGE Healthcare17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) o niskiej glukozie, pirogronianGibco11885-084
Hyklonpłodu bydlęcegoSH30910.03
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (1x)Gibco1897141
Williams medium E, bez glutaminyGibco12551-032
Suplement dipeptydu L-alanylo-L-glutaminyGibco35050-061
Kolagenaza typu XWako Pure Chemical Industries039-17864
Pompa perfuzyjnaCole-ParmerZestaw administracyjny Masterflex L/S
Equipment IVEXELINT29081Sprzęt
Kąpiel wodnaREVSCIRS-PB-200Sprzęt
Grzejnik rurowyFisher ScientificIsotempEquipment
EtanolDecon Lab, Inc0-39613
IzofluranPHOENIX10250
Autoklawowany Końcówki bawełnianeFisherbrand23-400-124
100 mm Szalka PetriegoTPP93100
Złącze (męski pierścień blokujący Luer)Instrument Cole-ParmerEW-4551807
Cewniki 24 GTERUMOSurflo 24Gx3/4'100
μ m Filtr (SITKA KOMÓRKOWE)VWR10199-658
15 ml probówki wirówkowe ze stożkowym dnemVWR89039-666
50 mL probówki wirówkowe ze stożkowym dnemVWR89039-658
Chemoselektywna reakcja ligacji ZESTAW DO WYKRYWANIA ANALIZY BIAŁEK, TAMRA ALKYNEInvitrogenC33370
AHA (L-azydohomoalanina)InvitrogenC10102
DMEM (bez metioniny)Gibco21013024
Dichlorowodorek L-cystynySIGMAC2526
Bufor do próbek LaemmliBioRad161-0737
proteazySIGMAP9599
Roztwór SDS (20%)BioRad161-0418
Tris-HCL (1M)Amerykański BioanalitycznyAB14044-01000
Koktajl inhibitorów fosfatazySIGMAP5726
Zestaw do pomiaru stężenia białka (albumina surowicy Bovin-BSA)BioRad500-0207
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowejTPP92006
Cyfrowy blok ciepłaVWR12621-092Sprzęt
Multi-RotatorGrant-bioSprzętPTR-60
Sonikator ultradźwiękowyCole-ParmerGE130PBSprzęt
Standardowy wytrzymały mieszalnik wirowyVWR97043-566Wyposażenie
Skaner laserowy o zmiennym trybieHealthcare Life ScienceFLA 9500Sprzęt
Odczynnik barwnikowy Coomassie-ThermoScientific24594
Mikroskop odwróconyOlympusCKX53
Sprzęt Aparat do blottingu Western Sprzęt1658004BioRad
WirówkaEppendorf5424RSprzęt
Automatyczny licznik komórekSprzęt BioRadTC20System
FluorChem Rsimple-Equipment
Przeciwciało p-Ampka (T172)Sygnalizacja komórkowa2535
Przeciwciało Total-AMPKSygnalizacja komórkowa5832
Przeciwciało albuminoweSygnalizacja komórkowa4929
Przeciwciało beta aktynySanta Cruzsc-130656
Cienkie nożyczki i kleszcze
Koktajl inhibitorów GE do białko

Bibliografia

  1. Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
  2. Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
  3. De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
  4. Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
  5. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
  6. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
  7. Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
  8. Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
  9. Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496(2012).
  10. Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
  11. Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
  12. Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
  13. Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
  14. Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
  15. Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
  16. Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
  17. Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
  18. Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
  19. Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
  20. Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
  21. Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
  22. Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
  23. Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
  24. Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
  25. Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
  26. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
  27. Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
  28. Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
  29. Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
  30. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  31. Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
  32. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
  33. Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
  34. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
  35. Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
  36. Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
  37. Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
  38. Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
  39. Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
  40. Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
  41. Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
  42. Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  43. Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
  44. Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
  45. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14(2017).
  46. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
  47. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
  48. Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
  49. Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
  50. DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
  51. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
  52. Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
  53. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja hepatocyt wperfuzja kolagenazseparacja gradientem g sto ciznakowanie nieradyjacyjnedetekcja AHAanaliza Western blotekspresja albuminykinaza bia kowa aktywowana AMP
Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.