Artykuł metodologiczny

Analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z analogiem tymidyny EdU

DOI:

10.3791/58339

⸱

22 października 2018

 ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do identyfikacji fazy S i analizy dynamiki cyklu komórkowego w hermafrodytycznej linii zarodkowej C. elegans przy użyciu analogu tymidyny EdU. Ta metoda nie wymaga transgenów i jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza cyklu komórkowego u eukariontów często wykorzystuje morfologię chromosomów, ekspresję i/lub lokalizację produktów genowych wymaganych w różnych fazach cyklu komórkowego, lub włączenie analogów nukleozydów. Podczas fazy S polimerazy DNA wprowadzają analogi tymidyny, takie jak EdU lub BrdU, do chromosomalnego DNA, oznaczając komórki do analizy. W przypadku C. elegans analog nukleozydu EdU jest podawany robakom podczas regularnej hodowli i jest zgodny z technikami immunofluorescencyjnymi. Linia zarodkowa C. elegans jest potężnym systemem modelowym do badań szlaków sygnałowych, komórek macierzystych, mejozy i cyklu komórkowego, ponieważ jest przezroczysta, genetycznie łatwa, a profaza mejotyczna i różnicowanie komórkowe / gametogeneza zachodzą w sposób podobny do montażu liniowego. Te cechy sprawiają, że EdU jest doskonałym narzędziem do badania dynamicznych aspektów mitotycznie cyklicznych komórek i rozwoju linii zarodkowej. Protokół ten opisuje, jak skutecznie przygotować bakterie EdU, karmić je hermafrodytami C. elegans typu dzikiego, preparować gonady hermafrodytów, barwić w celu włączenia EdU do DNA, barwieć przeciwciałami w celu wykrycia różnych markerów cyklu komórkowego i rozwoju, obrazować gonadę i analizować wyniki. Protokół opisuje zmiany w metodzie i analizie pomiaru wskaźnika fazy S, wskaźnika fazy M, czasu trwania G2, czasu trwania cyklu komórkowego, szybkości wnikania mejotycznego i szybkości progresji profazy mejozycznej. Metodę tę można dostosować do badania cyklu komórkowego lub historii komórek w innych tkankach, stadiach, tłach genetycznych i warunkach fizjologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W rozwoju zwierząt, setki, tysiące, miliony, miliardy, a nawet biliony podziałów komórkowych są potrzebne do uformowania dorosłego organizmu. Cykl komórkowy, zestaw zdarzeń komórkowych składających się z G1 (przerwa), S (synteza), G2 (przerwa) i M (mitoza) definiuje serię zdarzeń, które są wykonywane przy każdym podziale komórki. Cykl komórkowy jest dynamiczny i najlepiej doceniać go w czasie rzeczywistym, co może być trudne technicznie. Techniki przedstawione w tym protokole pozwalają na wykonanie pomiarów faz i czasu cyklu komórkowego na podstawie nieruchomych obrazów.

Znakowanie analogami nukleozydów, takimi jak 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) lub 5-bromo-2'-deoksyurydyna (BrdU) jest złotym standardem do identyfikacji fazy S w badaniach dynamiki cyklu komórkowego w dorosłej hermafrodycie Caenorhabditis elegans (C. elegans) linii zarodkowej1,2,3,4,5. Zarówno EdU, jak i BrdU mogą być stosowane w prawie każdym tle genetycznym, ponieważ nie opierają się na żadnym konstrukcie genetycznym. Wizualizacja BrdU wymaga ostrej obróbki chemicznej w celu wystawienia antygenu na barwienie przeciwciałami anty-BrdU, co często jest niezgodne z oceną innych markerów komórkowych uwidocznionych przez współbarwienie z dodatkowymi przeciwciałami. W przeciwieństwie do tego, wizualizacja EdU zachodzi przez chemię kliknięcia w łagodnych warunkach, a zatem jest zgodna z współbarwieniem przeciwciał6,7.

Specyfika etykiety jest jasna, ponieważ jądra zawierają analogi tymidyny (5-etynylo-2'- deoksyurydyny) do DNA tylko podczas fazy S. Wizualizacja odbywa się w tkance utrwalonej. Etykieta EdU jest niewidoczna sama w sobie, dopóki barwnik lub fluorofor zawierający azydek nie zareaguje kowalencyjnie z alkinem w EdU za pomocą katalizowanej miedzią chemii kliknięć8. Znakowanie EdU może dostarczyć natychmiastowych informacji o tym, które jądra są w fazie S, przy użyciu krótkiego impulsu znakowania. EdU może również dostarczać dynamiczne informacje, wykorzystując pogoń impulsową lub ciągłe etykietowanie; Na przykład w eksperymencie z pogonią za impulsami etykieta jest rozcieńczana przy każdym podziale komórki lub rozmnażana w miarę postępu rozwoju komórek niedzielących się.

Hermafrodytowa linia zarodkowa C. elegans jest potężnym modelowym systemem do badań szlaków sygnałowych, komórek macierzystych, mejozy i cyklu komórkowego. Dorosła linia zarodkowa jest spolaryzowaną linią montażową z komórkami macierzystymi znajdującymi się na dystalnym końcu, po której następuje wejście i progresja przez profazę mejotyczną, skoordynowaną z etapami gametogenezy bardziej proksymalnie (ryc. 1). Na bliższym końcu oocyty dojrzewają, ulegają owulacji i zapłodnieniu oraz rozpoczynają embriogenezę w macicy9,10,11. Obszar o średnicy komórki ~20 w pobliżu dystalnej komórki końcowej, który obejmuje mitotycznie cykliczne komórki macierzyste linii zarodkowej, komórki progenitorowe i mejotyczne komórki fazy S, ale nie komórki w mejotycznej profazie, nazywa się strefą progenitorową2,4,9,12. Błony komórkowe zapewniają niepełną separację między jądrami w dystalnej linii zarodkowej, ale komórki strefy progenitorowej przechodzą mitotyczne cykle komórkowe w dużej mierze niezależnie. Mediana czasu trwania cyklu komórkowego mitotycznego komórek strefy progenitorowej linii zarodkowej u młodych dorosłych hermafrodytów wynosi ~6,5 godziny; Faza G1 jest krótka lub nie ma jej wcale, a spoczynek nie jest obserwowany1,2,13. Różnicowanie komórek macierzystych linii zarodkowej zachodzi zasadniczo poprzez bezpośrednie różnicowanie, a zatem brak podziałów wzmacniających tranzyt4. Podczas różnicowania w stadium pachytenu około 4 z 5 jąder nie tworzy oocytów, ale zamiast tego ulega apoptozie, działając jako komórki pielęgniarskie, przekazując swoją zawartość cytoplazmatyczną rozwijającemu się oocytowi12,14,15.

Oprócz oznaczania komórek w fazie S analogami nukleozydów, można zidentyfikować komórki w mitozie i mejozie za pomocą barwienia przeciwciałami. Jądra w mitozie są immunoreaktywne na przeciwciało anty-fosfohistonu H3 (Ser10) (zwane pH3)7,16. Jądra w mejozie są immunoreaktywne na przeciwciało anty-HIM-3 (mejotyczne białko osi chromosomu)17. Jądra w strefie progenitorowej można zidentyfikować na podstawie braku HIM-3, obecności nukleoplazmatycznego REC-818, lub obecności WAPL-119. Intensywność WAPL-1 jest najwyższa w gonadzie somatycznej, wysoka w strefie progenitorowej i niska we wczesnych profazach mejotycznych19. Możliwych jest kilka pomiarów cyklu komórkowego z kilkoma wariantami protokołu: I) identyfikacja jąder w fazie S i pomiar wskaźnika fazy S; II) Zidentyfikuj jądra w fazie M i zmierz wskaźnik fazy M; III) określenie, czy jądra znajdowały się w mitotycznej czy mejotycznej fazie S; IV) zmierzyć czas trwania G2; V) zmierzyć stopień zaawansowania faz G2+M+G1; VI) zmierzyć szybkość wnikania mejotycznego; VII) oszacować tempo progresji mejotycznej.

Można wykonać wiele pomiarów cyklu komórkowego na podstawie zaledwie kilku rodzajów eksperymentów w laboratorium mokrym. Poniższy protokół opisuje 30-minutowe znakowanie impulsowe poprzez karmienie dorosłych hermafrodytów C. elegans bakteriami znakowanymi EdU i wspólne znakowanie komórek fazy M poprzez barwienie przeciwciałem anty-pH3 i komórek strefy progenitorowej przez barwienie przeciwciałem anty-WAPL-1. Do dodatkowych pomiarów wymagane są jedynie zmiany w czasie trwania paszy EdU (krok 2.5), rodzaju zastosowanych przeciwciał (krok 5) i analizach (krok 8.3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie bakterii znakowanych EdU

  1. Wyhoduj kulturę starterową MG1693. Escherichia coli (E. coli) MG1693 jest nosicielem mutacji w thyA.
    1. Wyrzuć E. coli MG1693 z zamrożonego bulionu glicerolowego na 120 mm bulionu lizogennego (LB) na szalce Petriego. Hodowla w temperaturze 37 °C przez noc.
    2. Zaszczepić z dwóch pojedynczych kolonii E. coli MG1693 do dwóch zduplikowanych probówek o pojemności 4 ml płynnego LB. Kultura w temperaturze 37 °C dla ~16 h.
      UWAGA: MG1693 dobrze rośnie w LB bez suplementacji tyminą lub tymidyną.
  2. Hoduj E. coli MG1693 w minimalnej ilości pożywki uzupełnionej EdU.
    1. Kolbę stożkową o pojemności 500 ml należy przeznaczyć w autoklawie.
    2. Użyj sterylnej techniki, aby dodać 5 ml 20% glukozy, 50 μl 10 mg/ml tiaminy, 120 μl 5 mM tymidyny, 100 μl 1 M MgSO4, 200 μL 10 mM EdU, 100 ml buforu M9 i 4 ml świeżo wyhodowanej przez noc kultury MG1693.
      UWAGA: Końcowe stężenie EdU wynosi 20 μM w tej kulturze1,7. To stężenie prowadzi do uszkodzenia DNA i zatrzymania cyklu komórkowego, jeśli zostanie zastosowane bezpośrednio do komórek ssaków w culture20. Jednak tylko część tego EdU jest włączona do E. coli, a zatem dostępna dla C. elegans. Nie ma dowodów na zatrzymanie cyklu komórkowego i nie ma zmian w wielkości strefy progenitorowej lub wskaźniku fazy M po leczeniu EdU młodych dorosłych hermafrodytów.
    3. Hodowla przez noc, ale nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  3. Skoncentrować E. coli znakowaną EdU i nałożyć na agarowe szalki Petriego M9.
    1. Wstępnie schłodzić wirówkę stołową do temperatury 4 °C.
    2. Użyj sterylnej techniki, aby przenieść kulturę do 2–4 sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
    3. Odwirować kultury w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut w celu osadzenia E. coli znakowanej EdU.
      UWAGA: Supernatant zawierający EdU należy usunąć zgodnie z lokalnymi i instytucjonalnymi wytycznymi.
    4. Zawiesić granulki z 4 ml świeżego M9. Użyć sterylnej końcówki do pipety o pojemności 1 ml lub sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Ponowne zawieszenie granulek może potrwać kilka minut.
    5. Użyj tej samej pipety do nałożenia i rozprowadzenia ~ 8 kropli ponownie zawieszonej E. coli MG1693 znakowanej EdU do środka szalek Petriego o temperaturze pokojowej 60 mm M9 agar. Jedna partia daje ~16 szalek.
    6. Pozostaw naczynia do wyschnięcia na kilka godzin lub na noc w temperaturze pokojowej, a następnie zamknij każde naczynie paskiem folii laboratoryjnej. Naczynia można przechowywać w temperaturze 15 °C przez ~2 tygodnie i w temperaturze 4 °C przez ~2 miesiące. Użyj tej samej partii naczyń EdU do każdego zestawu eksperymentów.

2. Karmienie C. elegans EdU

  1. Zsynchronizuj populację przez czasowe składanie jaj, alkaliczną obróbkę podchlorynem, a następnie wylęg do pożywki S z cholesterolem lub wybierając odpowiedni etap21. Wyhoduj zwierzęta do pożądanego etapu (tutaj, 24 godziny po L4) na pożywce do wzrostu nicieni wysiewanej E. coli OP50 w temperaturze 20 °C.
    UWAGA: Przygotuj 50–100 zwierząt na eksperyment, ponieważ niektóre mogą nie przeprowadzać dobrze sekcji, a inne zostaną utracone w procesie mycia i przenoszenia.
  2. Pozwól szalkom EdU ogrzać się do 20 °C (lub temperatury wymaganej do eksperymentu).
  3. Umyj zwierzęta z szalek NGM za pomocą M9 lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do probówki o pojemności 1,5 ml. Pozwól zwierzętom na chwilę się uspokoić za pomocą grawitacji lub krótkiego wirowania w mikrowirówce.
  4. Usunąć supernatant i umyć zwierzęta 1-2 razy ~1 ml M9 lub PBS. Usunąć supernatant.
  5. Użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść zwierzęta w maleńkiej kropli M9 lub PBS na środek trawnika EdU. Odczekać kilka minut, aż ciecz zostanie wchłonięta, a następnie inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut (w przypadku bezpośredniego pomiaru fazy S) lub dłużej (w celu zmierzenia historii fazy S), w zależności od potrzeb.
    UWAGA: Sygnał EdU jest wykrywalny w jądrach linii zarodkowej już po 15 minutach karmienia EdU1.
  6. Zmyj robaki z naczynia EdU za pomocą ~2 ml M9 lub PBS do szklanego naczynia preparacyjnego.

3. Sekcja i utrwalenie linii zarodkowej C. elegans

UWAGA: Ten protokół do preparacji, utrwalania i barwienia przeciwciał hermafrodytowej linii zarodkowej C. elegans jest prawie identyczny z tym opublikowanym przez Gervaise i Arur (2016)22, z wyjątkiem tego, że szklane probówki o pojemności 1 ml mogą być odwirowane, aby przyspieszyć etapy mycia, a wyciągnięta szklana pipeta Pasteura może być użyta do skuteczniejszego usuwania płynu ze szklanych probówek o pojemności 1 ml.

  1. Umyj i wypreparuj linie zarodkowe C. elegans.
    1. Pozwól zwierzętom osiąść na dnie naczynia preparacyjnego, zakręć, aby zebrać zwierzęta w środku i użyj długiej pipety Pasteura, aby usunąć PBS. Umyj 1-2 razy ~2 ml PBS.
    2. Dodać 2 ml PBS i 4 μl 100 mM lewamizolu, aby unieruchomić zwierzęta. Ponownie zakręć naczyniem, aby zebrać zwierzęta na środku naczynia.
      UWAGA: Unieruchomienie może trwać od kilku sekund do kilku minut. Całkowite unieruchomienie nie jest konieczne do pomyślnego rozwarstwienia. Niektórzy ludzie odnoszą większe sukcesy podczas sekcji niecałkowicie unieruchomionych zwierząt.
    3. Wypreparuj zwierzęta za pomocą pary igieł 25G 5/8", przecinając głowę (mniej więcej między dwiema opuszkami gardłowymi) lub ogon. Uważaj, aby nie przeciąć pętli linii zarodkowej. Jelito i linia zarodkowa powinny "wyskoczyć" z jamy ciała pod wpływem ciśnienia wewnętrznego, ale pozostać przyczepione. Ten protokół jest podobny do wcześniej opublikowanego Gervaise and Arur (2016)22.
      UWAGA: Utrzymuj czas sekcji na poziomie ~5 minut, na pewno nie więcej niż 15 minut. Dłuższy czas preparacji może spowodować utratę sygnału barwienia przeciwciał (Sudhir Nayak, komunikacja osobista), a głód w PBS może wpłynąć na fizjologię zwierząt. Nauczenie się szybkiej i dokładnej analizy może wymagać trochę praktyki.
    4. W razie potrzeby zamieszaj, aby zebrać wypreparowane zwierzęta w środku i użyj długiej pipety Pasteura, aby usunąć jak najwięcej PBS.
  2. Napraw i odwodnij tkanki
    1. Dodać 2 ml 3% paraformaldehydu (PFA) do roztworu PBS. Przykryj naczynie luźno folią laboratoryjną i przechowuj na ławce lub w szufladzie przez 10 min.
      UWAGA: Rozmrozić roztwór PFA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej przed rozwarstwieniem linii zarodkowych.
      UWAGA: Roztwór PFA jest umiarkowanie toksyczny i prawdopodobnie rakotwórczy i teratogenny. Opary wydzielające się z roztworów paraformaldehydu są łatwopalne. Nosić rękawice nitrylowe. Rozcieńczyć PFA od 16% do 3% w dygestorium chemicznym. Podczas pracy poza wyciągiem należy przykryć wszystkie pojemniki.
    2. Ostrożnie przenieść gonady do czystej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml.
    3. Dodaj ~ 3 ml PBSTw (PBS z 0,1% Tween-20) do naczynia, w którym znajdowały się gonady, aby pomóc odzyskać pozostałe gonady i rozcieńczyć roztwór PFA.
    4. Wirować w wirówce klinicznej przy 870 x g przez ~1 min. Młodsze lub mniejsze zwierzęta wymagają dłuższego czasu wirowania niż starsze lub większe zwierzęta.
    5. Za pomocą długiej szklanej pipety przenieść supernatant do zlewki z niepożądanym materiałem w celu ostatecznego wyrzucenia do butelki z niechcianym materiałem w kapturze chemicznym.
    6. Dodać 2 ml wysokogatunkowego metanolu schłodzonego do temperatury -20 °C. Szczelnie przykryć probówkę wirówkową folią laboratoryjną.
      UWAGA: Stosowanie świeżego, wysokiej jakości metanolu ze złotą etykietą jest niezbędne do prawidłowej morfologii niektórych przeciwciał.
      UWAGA: Metanol jest wysoce łatwopalną cieczą i parą, która jest toksyczna w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Nosić rękawice i odpowiednie środki ochrony osobistej. Użyj zamrażarki odpowiedniej do małych ilości materiałów łatwopalnych.
    7. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę, nawet przez noc lub nawet kilka miesięcy.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Nawadnianie linii zarodkowych

  1. Napełnij szklaną probówkę wirówkową do góry PBSTw, aby rozcieńczyć metanol i ponownie nawodnić gonady. Wirować w wirówce klinicznej przy 870 x g przez ~1 min.
  2. Za pomocą długiej szklanej pipety Pasteura przenieść supernatant do zlewki z niepożądanym materiałem w celu ostatecznego wyrzucenia do butelki z niechcianym materiałem w kapturze chemicznym.
  3. Przemyć gonady 3 razy za pomocą ~5 ml PBSTw, wirując w wirówce klinicznej przy 870 x g przez ~1 minutę za każdym razem. Usunąć supernatant.
  4. Przepłukać małą probówkę ze szkła borokrzemianowego o pojemności 1 ml i długą szklaną pipetę Pasteura za pomocą PBSTw.
  5. Dodaj ~700 μL PBSTw i użyj długiej szklanej pipety Pasteura, aby przenieść gonady do małej probówki. Użyj kilku dodatkowych kropli PBSTw, aby upewnić się, że wszystkie gonady zostały przeniesione.
  6. Wirować w wirówce klinicznej o stężeniu 870 x g przez ~1 min. Za pomocą długiej, szklanej pipety Pasteura usuń jak najwięcej płynu, nie naruszając gonad. Pozostawić nie więcej niż 50 μl.
    UWAGA: Jeśli wykrywanie przeciwciał nie jest konieczne, przejdź do kroku 6.

5. Wykrywanie antygenów za pomocą przeciwciał

  1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 30% surowicy w PBS. W niniejszym przykładzie przeciwciało anty-WAPL-1 rozcieńcza się w stosunku 1:2,000, a przeciwciało anty-pH3 rozcieńcza się w stosunku 1:500. Odwirować świeżo rozmrożoną surowicę przez 10 minut w mikrodyfie o temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia cząstek stałych. Użyć supernatantu, który może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Użyj odpowiedniej surowicy, aby dopasować organizm gospodarza do przeciwciał drugorzędowych (stosuje się tutaj surowicę kozią). Fakultatywny etap blokujący może zostać dodany przed dodaniem przeciwciał pierwszorzędowych.
  2. Nałożyć 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na każdą małą szklaną probówkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 godziny
    UWAGA: Czas inkubacji różni się w zależności od przeciwciała. W przypadku niektórych przeciwciał wystarczą 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dłuższe inkubacje (np. przez noc) są możliwe, ale mogą zwiększyć tło.
  3. Napełnij probówki do góry PBSTw i odwiruj w wirówce klinicznej o stężeniu 870 x g przez ~1 min.
  4. Przemyć gonady 3 razy za pomocą ~1 ml PBSTw. Inkubować przez ~5 minut na przemycie, aby nadmiar przeciwciała pierwszorzędowego mógł dyfundować do pomycia. Za pomocą długiej, szklanej pipety Pasteura usuń jak najwięcej płynu, nie naruszając gonad. Pozostaw nie więcej niż 50 μl.
  5. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 30% surowicy koziej w PBS. W tym przykładzie koza-anty-królik-594 i koza-anty-mysz-647 są rozcieńczane w stosunku 1:400,
    UWAGA: Ostrożnie wybierz przeciwciała drugorzędowe, aby upewnić się, że barwniki różnią się od barwnika w zestawie EdU. W niniejszym przykładzie zestaw EdU zawierał barwnik wzbudzający o długości fali 488 nm.
  6. Nałożyć 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego na każdą małą szklaną probówkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej 2 godz.
    UWAGA: Czas inkubacji różni się w zależności od przeciwciała. W przypadku niektórych przeciwciał drugorzędowych wystarczy 1 godzina w temperaturze pokojowej. Dłuższe inkubacje (np. przez noc) są możliwe, ale mogą zwiększyć tło.
  7. Przemyć gonady 3 razy za pomocą ~1 ml PBSTw. Inkubować przez ~ 5 minut na płukanie, aby nadmiar przeciwciał drugorzędowych mógł dyfundować do przemłukiwania. Za pomocą długiej, szklanej pipety Pasteura usuń jak najwięcej płynu, nie naruszając gonad. Pozostawić nie więcej niż 50 μl.
    UWAGA: Gonady można przechowywać w 100 μl PBS po tym kroku, jeśli to konieczne, chociaż może to zmniejszyć sygnał. Usuń PBS przed kontynuowaniem.

6. Wykonaj reakcję kliknięcia EdU, aby wykryć EdU

UWAGA: Przeprowadzenie reakcji kliknięcia EdU przed etapami barwienia przeciwciał (wykonaj Krok 6 przed Krokiem 5) jest możliwe, w zależności od użytych przeciwciał7. Jednak odczynniki click mogą zakłócać działanie niektórych antygenów (np. przeciwciało REC-8 jest wrażliwe na utrwalanie i przenikanie). Przedstawiona tutaj kolejność daje jasne barwienie przeciwciał za pomocą zastosowanych między innymi przeciwciał REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, FLAG i CYE-1.

  1. Przygotuj koktajl click EdU8 świeży, dodając następujące składniki do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Ważna jest kolejność dodawania. Chronić przed światłem i utrzymywać wszystkie odczynniki na lodzie. Receptura ta wystarcza na jedną próbkę (100 μl); Pomnóż przepis w razie potrzeby.
    1. Do dodatku buforowego dodać 2 ml ultraczystej wody. To sprawia, że 10x dodatek buforowy, który należy rozcieńczyć do 1x bezpośrednio przed użyciem.
    2. Dodaj 8,5 μl 10x buforu do 76,5 μl ultraczystej wody. Dobrze wymieszaj.
    3. Dodać 4 μl 100 mMCuSO4 (może być oznaczony jako składnik E). Dobrze wymieszaj.
    4. Dodać 0,25 μl barwnika Azide o długości 488 nm. Musi być rozmrożony w temperaturze pokojowej, ponieważ jego rozpuszczalnik, dimetylosulfotlenek, jest stały w temperaturze 4 °C. Dobrze wymieszać i chronić przed światłem.
    5. Zmieszać 9 μl ultraczystej wody z 1 μl dodatku buforowego w nasadce probówki. Odpipetuj z nakrętki, aby dodać do pozostałego koktajlu i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół.
  2. Wykonaj reakcję kliknięcia EdU.
    1. Dodaj ~100 μL koktajlu click EdU do gonad w małej tubce. Przykryj folią laboratoryjną i inkubuj przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przemyć raz 100 μl reakcyjnego buforu do płukania.
    3. Umyj gonady 4 razy za pomocą ~1 ml PBSTw. Inkubuj przez ~15 minut na pranie, aby nadmiar składników koktajlu EdU mógł dyfundować do pomycia. Za pomocą długiej, szklanej pipety Pasteura usuń jak najwięcej płynu, nie naruszając gonad. Pozostaw nie więcej niż 50 μl.

7. Barwienie DNA i przygotowanie preparatów

  1. Dodaj 1 kroplę (~ 25 μL) pożywki do mocowania zapobiegającego blaknięciu z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, używanym do wizualizacji DNA) do gonad. Odczekaj kilka minut, aby mógł się osiąść i wymieszać z gonadami.
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować rozcieńczenie DAPI w stosunku 1:1 000 (z 0,1 mg/ml) w PBS przez 5 minut, a następnie 20 μl 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO) w 90% glicerolu lub innym pożywce zapobiegającej blaknięciu.
  2. Przygotuj dużą 2,5% podkładkę z agarozy na standardowym szklanym szkiełku mikroskopowym.
  3. Użyj nowej, czystej, bezpyłowej, długiej szklanej pipety Pasteura, aby przenieść gonady do podkładki agarozowej. Utrzymuj cały płyn i gonady na wąskim dnie pipety, aby zminimalizować utratę gonad.
    UWAGA: Gonady przyklejone do małej szklanej rurki lub w długiej szklanej pipecie Pasteura można "uratować" poprzez przepłukanie PBSTw, zebranie płynu w naczyniu preparacyjnym i wybranie rzęsą poszczególnych zwierząt na szkiełko.
  4. Użyj rzęsy (lub pętli cienkich włosów) przyklejonej do wykałaczki, aby rozprowadzić gonady na podkładce agarozowej i usunąć cząsteczki kurzu.
  5. Nałożyć prostokątne szklane szkiełko nakrywkowe. Opuść powoli z jednej strony, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Użyj chusteczki do usunięcia nadmiaru roztworu, zapobiegając w ten sposób swobodnemu przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Wybierz szkiełka nakrywkowe, które pasują do mikroskopu, który będzie używany. Dobrze sprawdzają się szkiełka nakrywkowe #1 i #1,5.
  6. Pozostawić szkiełka do osiadania i lekko wyschnąć przez noc w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Pomaga to lekko spłaszczyć gonady. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Opcjonalnie: Uszczelnij krawędzie szkiełka lakierem do paznokci lub innym uszczelniaczem do szkiełek. Uszczelnienie najpierw narożników, a następnie boków, zapobiega przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego.

8. Obrazowanie i analiza konfokalna

  1. Zobrazuj dystalną gonadę za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego z wirującym dyskiem, wyposażonego w źródło światła o wysokiej energii, obiektywy planapochromatyczne i kamerę mikroskopową o wysokiej wydajności. Rejestruj obrazy z zachowaniem odstępów 1 μm lub mniejszych między stosami osi Z. Zwróć uwagę na moc lasera, czułość i czas ekspozycji dla wszystkich kanałów.
    1. Zastosowanie: wzbudzenie linii laserowej 405 nm z filtrem emisyjnym 485 nm (W60) dla DAPI, wzbudzenie linii laserowej 488 nm z filtrem emisyjnym 527 nm (W55) dla EdU, wzbudzenie liniowe lasera 561 nm z filtrem emisyjnym 615 nm (W70) dla WAPL-1 oraz wzbudzenie liniowe lasera 640 nm z filtrem emisji 705 nm (W90) dla pH 3,
      UWAGA: Intensywność sygnału i intensywność tła będą się różnić. Podobnie wymagane czasy ekspozycji będą się różnić, być może nawet 10-krotnie.
  2. Użyj wtyczki Cell Counter plug-in23 w Fiji24,25, aby ręcznie policzyć każde jądro. Oznacz każde pojedyncze jądro zgodnie z obecnością i brakiem pH3, EdU i WAPL-1. Użyj klas jąder opisanych w Tabeli 1 i Rysunek 2, ponieważ ułatwią one wszystkie obliczenia opisane poniżej.
    UWAGA: Wykwalifikowani eksperymentatorzy mogą dokładnie policzyć wszystkie jądra na obrazie 3D bez podwójnego liczenia lub pomijania jakichkolwiek jąder. Alternatywnie, można policzyć każde jądro w każdej płaszczyźnie z, a skrypt Marks-to-Cells R3 może być użyty do usunięcia jąder zliczonych wielokrotnie.
  3. Oblicz liczbę komórek i częstotliwości z powyższych liczb w zależności od rodzaju wymaganego pomiaru cyklu komórkowego. Typy jąder są zdefiniowane w Tabeli 1 i Rysunek 2. Obliczenia podsumowano w tabeli 2.
    1. (Wariant I) Aby zidentyfikować jądra w fazie S, należy karmić zwierzęta EdU przez 30 minut. Wszystkie jądra oznaczone etykietą EdU są jądrami fazy S. Aby to obliczyć, weź sumę jąder A i C, patrz tabela 1 i Rysunek 2.
      UWAGA: W 30-minutowym impulsie EdU u dorosłych hermafrodytów typu dzikiego, wszystkie jądra znakowane EdU są znakowane markerami strefy progenitorowej1.
    2. Aby zmierzyć strefę progenitorową, wybarwić ją markerem strefy progenitorowej, takim jak przeciwciało REC-8 lub WAPL-1. Strefa progenitorowa jest tutaj zdefiniowana jako wszystkie nukleoplazmatyczne immunoreaktywne jądra linii rozrodczej REC-818 lub WAPL-1. Aby to obliczyć, zsumuj wszystkie jądra immunoreaktywne WAPL-1 (A+B+C+D, patrz tabela 1 i rysunek 2).
      UWAGA: WAPL-1 oznacza również DTC i jądra gonad somatycznych, które nie powinny być liczone. Jądra somatyczne są łatwe do zidentyfikowania na podstawie niezwykle intensywnego sygnału WAPL-1, położenia nieco poza linią zarodkową i morfologii jąder typu "jajko sadzone".
    3. Aby zmierzyć wskaźnik fazy S, wykonaj 30-minutowy eksperyment EdU i umieść go w koznaku z przeciwciałem REC-8 lub WAPL-1. Wskaźnik fazy S definiuje się jako proporcję strefy progenitorowej, która znajduje się w fazie S. Aby to obliczyć, policz wszystkie jądra fazy S, a następnie podziel przez całkowitą liczbę jąder strefy progenitorowej (A+C / A+B+C+D, patrz tabela 1 i rysunek 2).
    4. (Wariant II) Aby zidentyfikować jądra w fazie M, wybarwić przeciwciałem pH3. Wszelkie jądra immunoreaktywne pH3 są jądrami fazy M. Działa to niezależnie od czasu trwania kanału EdU. Aby to obliczyć, weź sumę jąder A i B, patrz tabela 1 i rysunek 2.
      UWAGA: WAPL-1 oznacza również DTC i jądra gonad somatycznych, które nie powinny być liczone. Jądra somatyczne są łatwe do zidentyfikowania na podstawie niezwykle intensywnego sygnału WAPL-1, położenia nieco poza linią zarodkową i morfologii jąder typu "jajko sadzone".
    5. Aby zmierzyć indeks fazy M, należy go znakować jednocześnie przeciwciałami pH3 i REC-8 lub WAPL-1. Wskaźnik fazy M definiuje się jako proporcję strefy progenitorowej, która znajduje się w fazie M. Aby to obliczyć, policz wszystkie jądra fazy M, a następnie podziel przez całkowitą liczbę jąder strefy progenitorowej (A+B / A+B+C+D, patrz tabela 1 i rysunek 2).
    6. (Wariant III) Jądra w mitotycznej i mejotycznej fazie S znakowane EdU. Aby odróżnić te dwie populacje, określ, czy po fazie S nastąpiła mitoza czy mejoza. Aby określić, czy jądra są w mitotycznej czy mejotycznej fazie S, podawaj EdU przez 4 godziny i koznakuj pH3 (marker fazy M) i HIM-3 (białko osi chromosomu mejotycznego) przez barwienie przeciwciałami. Zapisz jądra, które wykazują zarówno EdU, jak i pH3 (typ A, patrz tabela 1 i rysunek 2) jako mitotyczną fazę S, podczas gdy jądra, które wykazują zarówno EdU, jak i HIM-3 (typ E, patrz tabela 1 i rysunek 2) jako mejotyczną fazę S.
    7. (Wariant IV) Oblicz czas trwania fazy G2.
      UWAGA: Faza G2 oddziela fazę S od fazy M. Chociaż nie zgłoszono żadnego markera oznaczającego G2 w linii zarodkowej C. elegans, można obliczyć czas trwania fazy G2, łącząc dane z kilku eksperymentów, które oznaczają fazę M (w momencie rozbioru) i fazę S (rozpoczynającą się kilka godzin przed rozbiorem). Komórka, która wyświetla zarówno markery fazy M, jak i fazy S, ukończyła fazę G2 w trakcie eksperymentu. Komórka, która wyświetla tylko marker fazy M, a nie marker fazy S, nie była w fazie S podczas eksperymentu.
      1. Aby obliczyć czas trwania fazy G2, podawaj EdU przez 2 godziny i kotaguj przeciwciałem pH3. Zbadaj tylko jądra, które znakują pH3 (są one w fazie M w momencie rozbioru) pod kątem obecności EdU (były one w fazie S podczas 2-godzinnego znakowania EdU przed rozbiorem). Obliczyć frakcję jąder M-fazy, które zakończyły fazę G2 (A / A + B, patrz tabela 1 i rysunek 2).
      2. Powtórz ten eksperyment z etykietą EdU na 3 godziny i ponownie z etykietą EdU na 4 godziny (i opcjonalnie na etykiecie EdU na 5 godzin). Wykreślić procent jąder dodatnich pH3, które są dodatnie EdU na osi y i czas trwania znacznika EdU na osi x, jak pokazano na rysunku 3A.
      3. Oblicz medianę czasu trwania fazy G2, łącząc punkty na wykresie i określając, gdzie linia przecina 50%, jak pokazano na rysunku 3A.
      4. Oblicz maksymalny czas trwania fazy G2, łącząc punkty na wykresie i określając, gdzie linia przecina 99%, jak pokazano na rysunku 3A.
    8. (Wariant V) Oblicz moc G2 + M + G1,
      UWAGA: W linii rozrodczej C. elegans faza G1 jest niezwykle krótka. Chociaż nie zgłoszono żadnego markera oznaczającego G1 w linii zarodkowej C. elegans, można oszacować łączny czas trwania fazy G2, M i G1, a następnie porównać ten czas z czasem fazy G2 opisanym powyżej. Maksymalny czas trwania G2 + M + G1 szacuje się na podstawie odsetka wszystkich jąder strefy progenitorowej (immunoreaktywnych WAPL-1), które pozostają EdU ujemne (nie przeszły fazy S) po znakowaniu EdU przez kilka godzin.
      1. Aby obliczyć czas trwania G2 + M + G1, podawaj EdU przez 2 godziny i współznakuj przeciwciałem REC-8 lub WAPL-1. Określ frakcję strefy progenitorowej, która przeszła fazę S w tym czasie (A+C / A+B+C+D, patrz tabela 1 i rysunek 2).
      2. Powtórz ten eksperyment z etykietą EdU na 3 godziny i ponownie z etykietą EdU na 4 godziny (i opcjonalnie na etykiecie EdU na 5 godzin). Wykreślić procent jąder dodatnich REC-8 lub WAPL-1, które są dodatnie EdU na osi y i czas trwania znacznika EdU na osi x, jak pokazano na rysunku 3B.
      3. Oblicz maksymalny czas trwania G2 + M + G1, łącząc punkty na wykresie i znajdując miejsce, w którym linia przecina 99%, jak pokazano na rysunku 3B.
        UWAGA: Możliwe jest przeprowadzenie eksperymentów w celu określenia czasu trwania G2 i G2 + M + G1 jako pojedynczego zestawu 2, 3, 4 i 5 h eksperymentów EdU poprzez jednoczesne znakowanie zarówno króliczymi przeciwciałami anty-WAPL-1, jak i mysimi przeciwciałami anty-pH3.
    9. (Wariant VI) Aby zidentyfikować jądra, które replikowały się w strefie progenitorowej, ale od tego czasu weszły w mejozę, należy karmić zwierzęta EdU przez 10 godzin i znakować je jednocześnie przeciwciałami REC-8 lub WAPL-1. Wszystkie jądra ze znacznikiem EdU znajdowały się w fazie S w ciągu tych 10 godzin. Wszystkie jądra, które nie wykazywały nukleoplazmatycznego barwienia REC-8 lub WAPL-1, znajdowały się w mejozie. Po prostu policz jądra z oznakowaniem EdU, które nie mają znakowania znacznikiem strefy progenitorowej (E, patrz tabela 1).
      UWAGA: I odwrotnie, jeśli gonady są barwione dla mejotycznego markera profazy HIM-3 przeciwciałami anty-HIM-3, policz liczbę jąder z oznakowaniem EdU, które są również dodatnie dla HIM-3.
    10. Aby obliczyć szybkość wnikania mejotycznego, wykonaj powyższy eksperyment z etykietą EdU po 5 godzinach, 10 godzinach i 15 godzinach. Wykreślić liczbę jąder, które weszły w mejozę na osi y i czas trwania etykiety EdU na osi x, jak pokazano na rysunku 3C. Następnie użyj prostej regresji liniowej, aby obliczyć nachylenie (jądra weszły w mejozę na h) od y=mx+b.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby użyć regresji liniowej do obliczenia szybkości wprowadzania mejotycznego. Błędem byłoby po prostu podzielenie liczby jąder, które weszły w mejozę, przez czas trwania znacznika EdU, ponieważ punkt przecięcia z osią y nie jest równy zeru.
    11. (Wariacja VII) Zmierz tempo progresji mejotycznej.
      UWAGA: Ponieważ EdU jest kowalencyjnie włączony do DNA, może być używany do śledzenia populacji komórek poprzez różnicowanie. Komórki, które przeszły fazę S w strefie progenitorowej, zachowują etykietę EdU, gdy wchodzą w mejozę, przechodzą mejozę i przechodzą oogenezę. Eksperyment z pogonią za pulsem z EdU może być wykorzystany do pomiaru szybkości progresji mejotycznej.
      1. Podawaj zwierzętom bakterie znakowane EdU przez 4 godziny ("impuls"). W razie potrzeby przenieś zwierzęta do nieoznakowanych bakterii OP50 ("pościg"), a następnie wypreparuj i znakuj za pomocą markera strefy progenitorowej, takiego jak REC-8 lub WAPL-1 (lub mejotycznego markera profazy, takiego jak HIM-3), jeśli jest to pożądane.
      2. Podczas obrazowania należy zwrócić uwagę na położenie najbardziej proksymalnego jądra znakowanego EdU. Szybkość progresji mejotycznej to odległość (w średnicach komórek od końca strefy progenitorowej) przebyta przez najbardziej proksymalne jądro znakowane EdU podczas 48-godzinnego pościgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ synteza DNA jest wymagana do włączenia EdU, można wywnioskować, że jądra znakowane EdU przeszły fazę S podczas okna czasowego znakowania EdU. Jądra, które znakują się w ciągu 30 minut karmienia bakteriami znakowanymi EdU, można interpretować jako jądra w fazie S w momencie sekcji. Jądra, które znakują się w dłuższym eksperymencie ciągłego karmienia EdU, mogły zostać oznaczone wcześnie w oknie czasowym i od czasu lewej fazy S, lub mogły być znakowane w późnej części okna czasowego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie bakterii znakowanych EdU (krok 1) ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu i jest pierwszym punktem rozwiązywania problemów. Hermafrodyty młodego dorosłego typu dzikiego znakują bardzo niezawodnie w 4-godzinnym impulsie EdU, co czyni to przydatną kontrolą dla każdej nowej partii bakterii znakowanych EdU. Dodatkowo, nienaruszone bakterie znakowane EdU, które dostają się do jelita (u starszych zwierząt lub niektórych mutantów z wadami gardła/młynka) zostaną oznaczone chemią kliknięć i pojawią się jako jasna, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni centrum zapasów E. coli za MG1693; Baza robaków; Centrum Genetyki Caenorhabditis finansowane przez National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40OD010440) dla szczepów; Zach Pincus za porady statystyczne; Aiping Feng za odczynniki; Luke'owi Schneiderowi, Andrei Scharf, Sandeepowi Kumarowi i Johnowi Brennerowi za szkolenie, porady, wsparcie i pomocną dyskusję; oraz laboratoriom Kornfelda i Schedla w celu uzyskania informacji zwrotnych na temat tego manuskryptu. Praca ta była częściowo wspierana przez National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 do KK, R01 GM100756 do TS] oraz stypendium przeddoktoranckie National Science Foundation [DGE-1143954 i DGE-1745038 do ZK]. Ani National Institutes of Health, ani National Science Foundation nie odegrały żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu, analizie i interpretacji danych, ani w pisaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411dobrze rośnie w standardowym, niesuplementowanym LB
em>E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificC10337
5-etynylo-2′-deoksyurydynaSigma900584-50MGlub użyj EdU dostarczonego w zestawie
GlukozaSigmaD9434-500GD-(+)-dekstroza
Tiamina (witamina B1)SigmaT4625-5GOdczynnik klasy
TymidynaSigmaT1895-1GBioOdczynnik
Siarczan magnezu siedmiowodnySigmaM1880-1KGMgSO4, Odczynnik
Fosforan sodu, dwuzasadowy, bezwodnyFisherBP332-500GNa2HPO4
Fosforan potasu, monobasicSigmaP5379-500GKH2PO4
Chlorek amonuSigmaA4514-500GNH4Cl, odczynnik Plus
Agar bakteriologicznyUS BiologicznyC13071058
Chlorek wapnia dwuwodnySigmaC3881-500GCaCl
LB Bulion (Miller)SigmaL3522-1KGUżywany w 25g/L
LewamizolSigmaL9756-5G0,241g/10ml
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiCalbiochem Omnipur6506domowy PBS działa równie dobrze
Tween-20SigmaP1379-500ML
16% paraformaldehydu, ampułki klasy EMMikroskopia elektronowa Sciences1571010ml ampułki
100% metanolMetanol Thermo Fisher ScientificA454-1Lze złotą etykietą ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej morfologii z niektórymi przeciwciałami
Kozia surowicaGibco16210-072Lot 1671330
królika anty-WAPL-1Novus biologiczne49300002Lot G3048-179A02, używany w 1:2000
mysi klon anty-pH3 3H10Millipore05-806Lot#2680533, używany w 1:500
kozio-anty-królik IgG sprzężony Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lot 1256147, stosowany w stosunku 1:400
kozio-anty-mysie IgG-sprzężone Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lot 1511347, stosowany w 1:400
Vectashield antifade mounting medium zawierające dichlorowodorek 4',6-dimidino-2-fenyloindolu (DAPI)Vector LaboratoriesH-1200zamiast tego można użyć podłoża montażowego bez DAPI, po oddzielnym lakierze do paznokci do inkubacji DAPI
Wet n WildDTC450Bkażdy przezroczysty lakier do paznokci powinien działać
S-mediumróżnezobacz wormbook.org
dla buforu protokołu M9różnepatrz wormbook.org dla protokołu
M9 agarten sam przepis co bufor M9, ale dodaj 1,7% agaru
Pożywka do wzrostu nicieniróżnezobacz wormbook.org dla protokołu
preparacji szkła zegarkowegoCarolina Biological42300
Parafilm folia laboratoryjnaPechiney Opakowanie z tworzywa sztucznegoPM-996Folia laboratoryjna o szerokości 4 cali
szalkiśrednicy 60 mm
Długie szklane pipety Pasteura
Probówki wirówkowe 1mlMidSci Avant2926
Końcówki
Pipety
500 ml Kolba
Folia
25G Igły 5/8"BD PrecisionGlide 
5ml szklana probówka wirówkowaPyrex 
Probówki ze szkła borokrzemianowego 1ml
szkiełka szklane
nr 1 szkiełka nakrywkowe 22 x 40 mmnr 1,5 mogą pracować, również
37 & deg; C Inkubator
Wirówka
stołowa Wirówka klinicznaIEC428z 6 wahliwymi wirnikami kubełkowymi
Mini wirówka
20 & deg; Inkubator
4 & stopnie; C lodówka-20
& deg; C zamrażarka
Obserwator Z1mikroskop Zeiss
Plan Apo 63X 1,4 soczewka obiektywowa zanurzeniowa w olejuZeiss
Ultraview Vox system konfokalny z wirującą tarcząPerkinElmer System konfokalny z wirującym dyskiem firmy Nikon działa bardzo dobrze, jak opisano tutaj: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 
< różne Petriego o serologiczneErlenmyeraaluminiowa305122z wytrząsarkąC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107(2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985(2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wbudowywanie EdUindeks fazy Sindeks fazy Mczas trwania fazy G2barwienie immunofluorescencyjnesekcja gonadchemia kliklicznik kom rek Fiji

Powiązane artykuły