Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena stresu komórkowego i stanu zapalnego w dyskretnych jądrach mózgu wydzielających oksytocynę u nowonarodzonego szczura przed i po pierwszym karmieniu siarą

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58341

⸱

14 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, Columbia University, 2Department of Pathology & Cell Biology, Columbia University Medical Center, 3Department of Psychiatry, Division of Molecular Imaging and Neuropathology, New York State Psychiatric Institute, 4EB Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolowania jąder mózgowych w mózgu noworodka szczura w połączeniu z pierwszym karmieniem siarą. Technika ta pozwala na badanie stresu związanego z niedoborem składników odżywczych w mózgu, modulowanego przez sygnalizację enterocytów.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest wyizolowanie bogatych w receptory oksytocyny jąder mózgu noworodka przed i po pierwszym karmieniu siarą. Ekspresję białek, o których wiadomo, że reagują na stres metaboliczny, mierzono w izolatach jąder mózgowych przy użyciu Western blot. Dokonano tego, aby ocenić, czy niedobór składników odżywczych w organizmie wywołany stresem metabolicznym wywołał stres neuronalny. Wcześniej wykazaliśmy, że niedobór składników odżywczych u noworodków wywołuje stres metaboliczny w jelitach. Ponadto oksytocyna siary moduluje reakcję komórkową na stres, stan zapalny i markery autofagii w kosmkach jelitowych nowonarodzonych szczurów przed i po pierwszym karmieniu. W jądrach mózgu nowonarodzonych [jądro przewodu pokarmowego (NTS)] mierzono markery białkowe związane ze stresem retikulum endoplazmatycznego [białko immunoglobuliny wiążące białka białka ER (BiP), eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 2A (eIF2a) i kinazę białkową kinazy eIF2a R (p-PKR)], a także dwa białka sygnalizujące stan zapalny [czynnik jądrowy κB (NF-kB) i inhibitor κB (IkB)], mierzono w jądrach mózgu noworodków [jądro drogi samotnej (NTS)], jądro przykomorowe (PVN), jądro nadwzrokowe (SON), kora (CX), jądra prążkowia (STR) i jądro przedwzrokowe przyśrodkowe (MPO)] przed pierwszym karmieniem (niezagruntowane siarą) i po rozpoczęciu karmienia (zaszczepione siarą). Ekspresja BiP / GRP78 i p-eIF2a była regulowana w górę w niezagruntowanej i w dół w zagruntowanej tkance NTS. NF-kB był zatrzymany (wysoki) w cytoplazmie CX, STR i MPO, podczas gdy NF-kB był niższy i niezmieniony w NTS, PVN i SON w obu warunkach. Zbiorcze wyniki BiP i p-eIF2 są zgodne z reakcją na stres. eIf2a był fosforylowany przez kinazę zależną od dsRNA (P-PCR) w SON, CX, STR i MPO. Jednak w NTS (i w mniejszym stopniu w PVN) eIf2a był fosforylowany przez inną kinazę, niedepresyjną kinazę kontrolną 2 (GCN2). Mechanizmy modulujące stres obserwowane wcześniej w enterocytach jelitowych noworodków wydają się być odzwierciedlone w niektórych obszarach mózgu bogatych w OTR. NTS i PVN mogą wykorzystywać inny mechanizm fosforylacji (przy niedoborze składników odżywczych) niż inne regiony i być odporne na wpływ niedoboru składników odżywczych. Podsumowując, dane te sugerują, że reakcje mózgu na stres związany z niedoborem składników odżywczych są równoważone przez sygnalizację z enterocytów przygotowanych siarą.

Wprowadzenie

W przeciwieństwie do naszego rozumienia wczesnego rozwoju mózgu zachodzącego w ciągu kilku dni do tygodni po porodzie, stosunkowo niewiele wiadomo o niezliczonych dynamicznych zmianach zachodzących w pierwszych godzinach życia u szczurów. Kluczowym wyzwaniem był mały rozmiar mózgu noworodka szczura i zapotrzebowanie na zaawansowane technologicznie narzędzia do izolowania dyskretnych obszarów mózgu lub pojedynczych komórek. Badania często oceniają transkrypcję genów, a nie translację1,2, co nie daje pewnego zrozumienia poziomów funkcjonalnych aktywowanych cząsteczek sygnałowych. Inni badają ekspresję za pomocą immunohistochemii w celu odniesienia się do regionów mózgu, co nie pozwala na ilościowe określenie poziomów ekspresji3. Żadne dotychczasowe badanie nie dotyczyło aktywacji szlaków sygnałowych związanych z pierwszym pokarmem siary szczurów w dyskretnych regionach mózgu, co wymaga szybkiej izolacji i poświęcenia oraz pomiaru ekspresji białek i fosforylacji białek przy użyciu Western blot. Podczas gdy mikrodysekcja mózgu jest przeprowadzana na starszych i większych mózgach, nie zidentyfikowaliśmy odniesienia do wykonania niejednokomórkowego uderzenia w mózg w mózgu P0. W artykule przedstawiono protokół izolacji ograniczonych obszarów mózgu noworodka przy użyciu stosunkowo mało zaawansowanej technologicznie techniki uderzenia i procedury Western blotting do pomiaru ekspresji białek w stosunkowo małych próbkach. Protokół ten może być odpowiedni dla pytań badawczych, które wymagają oceny ekspresji białek i modyfikacji potranslacyjnych (np. fosforylacji) w stosunkowo ograniczonych regionach małych mózgów dowolnego gatunku, pod warunkiem, że użytkownik może wizualnie zidentyfikować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania za pomocą atlasu i rozpoznawalnych punktów orientacyjnych.

Ta technika została opracowana w celu zrozumienia zmian zachodzących w mózgu w wyniku pierwszego pokarmu siary u noworodków, która jest bogata w oksytocynę (OT). OT jest od dawna znana ze swojej zdolności do stymulowania upływu mleka i skurczu macicy. Jednak obecnie wiadomo, że OT odgrywa szeroki zakres ról w regulacji wielu funkcji i zachowań organizmu4. Na przykład OT przeciwdziała stresowi i stanom zapalnym w połączeniu z adaptacyjnymi zachowaniami afiliacyjnymi5, opóźnia opróżnianie żołądka i spowalnia pasaż jelitowy. Receptory OT (OTR) zostały zidentyfikowane w neuronach jelitowych i nabłonku jelitowym6,7,8. Skutki żołądkowo-jelitowe OT są szczególnie ważne dla niemowlęcia we wczesnym okresie poporodowym. Na przykład karmienie piersią wiąże się z dostarczaniem znacznych ilości OT do jelita noworodka9,10, a dane pokazują, że OTR jest silnie nadeksprymowany w kosmkach dwunastnicy w okresie ssania mleka8.

Eksperymenty in vitro z użyciem linii komórek jelitowych wykazały na poziomie komórkowym, że oksytocyna moduluje ważne cząsteczki w szlaku sygnalizacji stresu11,12 i odgrywa rolę regulacyjną w translacji białek12. Badania te sugerują, że składniki mleka, w tym egzogenna oksytocyna pochodząca od matki, są ważne w odpowiedzi białkowej u noworodków w celu zmniejszenia stresu komórkowego13.

Badania in vivo i ex vivo wykazały, że colostrum OT moduluje komórkową reakcję na stres, stan zapalny i markery autofagii w kosmkach jelitowych nowonarodzonych szczurów. Nowonarodzone enterocyty cierpią na znaczny stres komórkowy po swojej stronie świetlnej, gdy jelito jest jednocześnie wystawione na mikrobiotę matki w siarze14,15 i liczne białka, w tym hormony, takie jak OT9,10,16.

Zbadano wpływ OT na mózg17. Jednak mechanizmy sygnalizacji OT wykazane w jelitach we wczesnym okresie poporodowym nie zostały zbadane w mózgu. W niniejszej pracy zastosowano metodę izolowania dyskretnych jąder mózgu w pniu mózgu i podwzgórzu noworodka szczura za pomocą elektroforezy do profilowania izolowanych obszarów mózgu. Ogólnym celem tej metody jest uchwycenie stanu sygnalizacji komórkowej w obszarach mózgu jak najbliżej urodzenia, przed i po pierwszym ssaniu mleka, w tkance mózgowej o najniższym wskaźniku glejowym/neuronalnym. Uzasadnieniem dla rozwoju tej techniki jest to, że pozwala ona na szybką izolację ograniczonych, mikroskopijnych obszarów mózgu u nowonarodzonych szczeniąt z bardziej jednorodnym zbiorem neuronów do badań ex vivo przy użyciu zautomatyzowanej metodologii Western blot, oferując bardzo spójne wyniki na stosunkowo małych wypreparowanych próbkach. Wadą wcześniejszych prac jest bardziej gruba sekcja (wycinki mózgu lub cały mózg) i starsze zwierzęta18,19. Mózgi młodych szczeniąt są niezwykle dynamiczne, a po urodzeniu występują fale różnicowania glejowego. Aby zbadać zmiany w mózgu, na które wpłynęło pierwsze karmienie młodych, konieczne jest badanie ograniczonych jąder neuronalnych z odtwarzalną sekcją.

Karmienie mlekiem jest zwykle analizowane pod kątem jego immunologicznego i odżywczego wpływu na zdrowie lub ekspresję genów (na przykład w enterocytach20,21), podczas gdy jego wpływ na obszary mózgu podczas rozwoju mózgu jest rzadko badany. Wpływ tranzytu mleka w jelitach na funkcjonowanie mózgu analizowano w odniesieniu do przekaźnika błędnego receptorów cholecystokininy jelitowej do jąder pnia mózgu, ale nie do wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych22. Istnieje obszerna literatura na temat podatności rozwijającego się mózgu noworodka na niedożywienie matek w czasie ciąży23, ale sygnały stresu i stanu zapalnego nie są poruszane. Co ważne, obecna metoda wykorzystuje zjawisko u noworodków szczurów w dniu zero, które izoluje bodźce siary pochodzące z krwi od przekaźnika nerwu błędnego bodźców trzewnych. Jest to tak zwany okres hiporeaktywności stresowej charakteryzujący się niedojrzałym obwodem podwzgórza jądra tractus solitarius (NTS) bezpośrednio po urodzeniu24,25, który ogranicza sygnały NTS, jądra przykomorowego (PVN) i jądra nadwzrokowego (SON) do bodźców krwionośnych.

Ta metoda jest przydatna do analizy wielu szlaków sygnałowych i względnie ograniczona do komórek neuronalnych, pod warunkiem, że tkanka mózgowa zostanie pobrana w dniu pourodzeniowym 0 u szczurów, niezależnie od tego, czy matki zostały poddane jakiemukolwiek leczeniu w czasie ciąży, czy nie. Mioty mogą być analizowane pod kątem wpływu karmienia siarą w porównaniu z sygnalizacją przed karmieniem. Porównując sygnały między obszarami mózgu o niskiej i bogatej wydajności białka, metoda ta umożliwia kapilarne określenie całkowitego białka prążków polipeptydowych w naczyniach włosowatych przebiega równolegle do immunologicznej kwantyfikacji antygenów białkowych. Metoda ta umożliwia ilościowe porównanie, przy użyciu dowolnych jednostek, wyników uzyskanych przez to samo przeciwciało bez standardowych krzywych ilościowych i przez odniesienie do całkowitego białka na kapilarnę. Porównywanie wyników uzyskanych przez różne przeciwciała jest możliwe tylko przy użyciu ilościowych krzywych wzorcowych.

Ta metoda pozwoliła na ocenę dwukierunkowej sygnalizacji zachodzącej między jelitami a mózgiem, która może wpływać na funkcjonowanie obu narządów26. Związek między oksytocyną a spożyciem pokarmu, który był szeroko badany w ostatnich latach27, potwierdza związek między zwiększoną sygnalizacją oksytocyny a dostępnością składników odżywczych. Badania te wspierają również odwrotną koncepcję, że deficyty energii są połączone ze zmniejszeniem sygnalizacji oksytocyny w podwzgórzu.

Wcześniejsze badania wpływu OT na aktywność mózgu wykazały, że indukowane zapalenie jelit wywołało transkrypcję cFos w podwzgórzu PVN, ciele migdałowatym i korze gruszkowatej, która była oporna na wagotomię28. Jednak ogólnoustrojowa infuzja OT z sekretyną zmniejszyła odpowiedź mózgu cFos na sprowokowaną reakcję zapalną w jelitach28. Sugerowało to, że efekt egzogennego OT był realizowany przez drogi inne niż przekaźniki błędne, prawdopodobnie za pośrednictwem przenoszonych przez krew cząsteczek sygnałowych przenoszonych przez obszar postrema6,29.

W tym badaniu, szlaki sygnalizacji stresu komórkowego, które wcześniej zaobserwowano w jelitach, zostały ocenione w mózgu. Postawiono hipotezę, że składniki mleka mogą chronić lub opóźniać wpływ stanu zapalnego na przepuszczalność jelit dla drobnoustrojów i innych metabolitów, a co za tym idzie, wpływ na funkcjonowanie mózgu. Wyraźne antagonistyczne różnice w sygnalizacji IkB i BiP stwierdzone w kosmkach, przed i po primingu przez colostrum13, sugerują, że mózgi noworodków, wciąż w trakcie rozwoju, mogą wyczuwać te indukowane siarą sygnały jelitowe.

Zmierzono markery białek sygnalizacyjnych używane w poprzednich eksperymentach jelitowych, które są związane ze stresem retikulum endoplazmatycznego. Należą do nich białko opiekuńcze ER BiP, czynnik inicjujący translację eIF2a (który służy jako integrator odpowiedzi na stres30), kinaza eIF2a p-PKR i dwa białka sygnalizujące stan zapalny (NF-kB i jego inhibitor, IkB).

Wybrano sześć regionów mózgu na podstawie ich zdolności u dorosłych do wydzielania lub reagowania na OT. NTS, zlokalizowany w górnym rdzeniu, jest pierwszym przekaźnikiem wejścia trzewnego i odbiera bezpośrednią sygnalizację z neuronów czuciowych nerwu błędnego w jelitach31 i prawdopodobnie cytokin krwiopochodnych, toksyn i hormonów za pośrednictwem sąsiedniego obszaru-postrema32. PVN, jądro nadwzrokowe (SON), jądra prążkowia (STR), kora mózgowa (CX) i przyśrodkowe jądro przedwzrokowe (MPO) odbierają sygnalizację z jelita za pośrednictwem NTS.

Wyniki pokazały, że reakcja na stres komórkowy w okresie bezpośrednio po urodzeniu przed zaszczepieniem siary i bezpośrednio po pierwszym karmieniu jest inna w NTS w porównaniu do PVN i SON. Sygnalizacja w CX, STR i MPO również różniła się od sygnalizacji PVN i SON. Wyraźne funkcje ochronne OT, jak wykazano wcześniej, modulują stres komórkowy i stan zapalny w jelitach, są prawdopodobnie wyczuwane przez niektóre obszary mózgu. Podsumowując, dane wskazują, że na poziomie komórkowym, w ciągu pierwszych godzin po urodzeniu, mózg reaguje na stres metaboliczny związany z niedoborem składników odżywczych. Dane pokazują również, że zakres i kierunek modulujących efektów karmienia siarą jest zależny od regionu i że w niektórych regionach odzwierciedlają one efekty OT wykazane wcześniej w jelitach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Columbia oraz Instytut Psychiatryczny Stanu Nowy Jork.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Zamów ciężarne szczury z czasem od sprzedawcy.
  2. Obserwuj ciężarne szczury w czasie, obserwując ich rosnące odwłoki w ciągu kilku tygodni po ich przybyciu, a następnie szukając młodych w oczekiwanym terminie porodu, sprawdzając klatkę co 2 godziny, aż do rozpoczęcia porodu.
  3. Usuń młode ręką w rękawiczce za ogon przed pierwszym karmieniem w przypadku młodych bez przygotowania (brak białego mlecznego brzucha jest widoczny podczas oglądania odwłoka) lub po pierwszym karmieniu dla młodych zaszczepionych (w którym to momencie biały brzuch będzie widoczny na ich brzuchu), jak opisano na osi czasu (Rysunek S1).
    Uwaga: Pierwsza karma siarą jest określana jako gruntowanie młodego; W ten sposób szczenię jest niezagruntowane do pierwszego karmienia, po którym jest zagruntowane siarą.
  4. Szybko odetnij głowę nieznieczulonemu szczeniakowi za pomocą ostrych, czystych nożyczek chirurgicznych.
  5. Usuń mózg, przecinając skórę wzdłuż linii środkowej i górnej powierzchni czaszki do nosa. Następnie, za pomocą kleszczy, delikatnie podważ kość, aby odsłonić mózg (Ryc. 1A) i zlokalizuj bregmę, zaznaczając ją długopisem, gdy płytki kostne są usuwane (Ryc. 1B).
  6. Szybko umieść cały mózg w formie mózgu z polimetakrylanu metylu w temperaturze pokojowej w celu przekrojenia koronalnego w temperaturze pokojowej (Rysunek 1C).
  7. Niezwłocznie uformuj plastry o grubości 500 μm za pomocą świeżej żyletki. Ułóż plastry rostralnie do ogona na szalce Petriego, aby zachować orientację sekcji (Rysunek 2).
  8. Szybko dodać sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF; 1,0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118,6 mM NaCl, 3,0 mM KCl, 203,3 mM MgCl2-6H 2O) bez glukozy i inkubować plastry przez 60 minut w temperaturze 28-30 °C, ciągle mieszając na wytrząsarce orbitalnej, aby metabolicznie i różnicowo rzucić wyzwanie tkankom niezagruntowanym w porównaniu z tkankami zagruntowanymi
    9. siarą.
  9. Zidentyfikuj jądra mózgu, które są wymagane do uderzenia, korzystając z atlasu mózgu33 i anatomicznych punktów orientacyjnych na sekcji tkanki. Umieść ten plasterek z interesującymi go jądrami na szalce Petriego i przenieś go do mikroskopu preparacyjnego.
  10. Po wizualizacji szybko wybij 4 z 6 różnych jąder za pomocą narzędzia do rdzeniowania, wybierając rozmiar, aby najlepiej przebić dane jądro i konsekwentnie między próbkami (Rysunek 2).
    Uwaga: Pozostały wycinek mózgu będzie miał teraz otwór, z którego usunięto tkankę mózgową. W tym badaniu wycięliśmy następujące jądra, korzystając z poniższych współrzędnych. Wszystkie współrzędne przednie/tylne (A/P) pochodzą z Bregmy (z wyjątkiem NTS, który odnosi się do Calamus Scriptorius). Wszystkie współrzędne grzbietowe/brzuszne (D/V) pochodzą z powierzchni kory (z wyjątkiem NTS, który pochodzi z powierzchni rdzenia). Następujące współrzędne obejmują A/P, przyśrodkowe/boczne (M/L) i D/V w mm: 1) jądro samotnego przewodu (NTS, A/P, 0,4 do 0,8; L, ± 0,2; D/V, 0,3 (od powierzchni rdzenia), 2) jądro przykomorowe (PVN, -0,8; ± 0,2; 0), 3) jądro nadwzrokowe (SON, -1,1; ± 1,4; 4,3), 4) kora (CX, obszar kory częściowej 1, -2,8; ± 1,5; 0,6), 5) jądra prążkowia (STR, -0,0; ± 1,6; 1,8), oraz 6) jądro przedwzrokowe przyśrodkowe (MPO, -0,6; ± 0,2; 4,2).
  11. Szybko zanurzyć wybite jądra w 0,06 ml lodowatego buforu do ekstrakcji białek zawierającego inhibitory proteazy i inhibitory fosfatazy na 60 minut (patrz krok 2.3).

2. Ekstrakcja białka

  1. Przygotuj roztwór do ekstrakcji białek za pomocą zestawu do lizy białek (tabela materiałów) w dniu poprzedzającym spodziewany poród młodych.
  2. Rozmrozić (na lodzie) zamrożony (-20 °C) wodny roztwór inhibitorów proteazy i fosfatazy z zestawu buforowego do lizy i umieścić na lodzie bufor do lizy i roztwór DMSO inhibitorów proteazy/fosfatazy.
  3. Dodaj 1,85 ml buforu do lizy do czystej, lodowatej probówki o pojemności 15 ml. Następnie dodać 0,1 ml wodnego roztworu inhibitorów i 0,05 ml inhibitorów rozpuszczonych w DMSO. Na koniec zakręć i krótko wymieszaj probówkę i utrzymuj ją w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  4. Oznaczyć 24 czyste probówki do mikrowirówek (każda po 0,5 ml) do procedury lizy. Wyznacz 12 probówek na mózg dla grupy niezaszczepionej siarą (U) [6 lewych (L) i 6 prawych (R) jąder mózgu] i oznacz zgodnie z akronimem jąder, stroną i stanem (np. NTS-L-U, NTS-R-U itp.). Oznacz drugą grupę 12 probówek dla próbek zagruntowanych siarą.
  5. Oznaczyć dwa dodatkowe zestawy probówek, jak to opisano w kroku 2.4, dla podstawowych ekstraktów białkowych (przy użyciu probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml) i dla pierwszego zestawu do przygotowania próbki (przy użyciu probówek o pojemności 0,5 ml). Przechowuj te probówki w dwóch oddzielnych, oznakowanych pudełkach do zamrażania (każde przeznaczone na 100 probówek). Jedno pudełko będzie używane dla próbek niezagruntowanych, a drugie dla próbek zagruntowanych.
  6. Rozmrozić roztwór do lizy na lodzie w dniu porodu młodych, a podczas inkubacji wycinków mózgu w ACSF, podajcie 0,06 ml roztworu do lizy do probówek do procedury lizy (od kroku 2.4), dodaj stemple jądrowe i inkubuj w lodzie przez 60 minut.
  7. Odwirować inkubowane zlizowane jądra przez 30 minut w schłodzonej miniwirówce z prędkością 14000 obr./min (10 000 x g) i ostrożnie odessać 0,055 ml supernatantu za pomocą odpowiednio ustawionej pipety. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonych probówek podstawowych o pojemności 1,5 ml (z kroku 2.5) i umieścić je na lodzie. Przed zamrożeniem (w temperaturze -20 °C) probówek z białkiem należy przenieść 0,012 ml supernatantu do wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 0,5 ml w celu przygotowania pierwszej próbki (od kroku 2.5) i pozostawić je na lodzie.

3. Przygotowanie próbki do pomiaru białka w kapilarze

  1. Użyj zestawu i przygotuj odczynniki do separacji zgodnie ze wskazówkami producenta. Dodać 0,003 ml odczynnika master-mix do każdej z 12 próbek w 0,5 ml znakowanych probówkach (z kroku 2.5) na lodzie, które zawierają 0,012 ml ekstraktów białkowych.
  2. Włączyć blok grzewczy do 95 °C i dodać 0,004 ml odczynnika przygotowanego w kroku 3.1 do biotynylowanej drabinki o masie cząsteczkowej (MW) w probówce z 0,016 ml wody dejonizowanej. W celu denaturacji drabinki i próbek, należy umieścić rurkę drabinkową i 12 próbek niezagruntowanych ekstraktów białkowych w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C na 5 minut i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Powtórzyć kroki od 2.0 do 3.2, od ekstrakcji białka do przygotowania próbki, dla jąder wybitych od szczurów zagruntowanych siarą.

4. Przygotowanie do elektroforezy

  1. Rozmrozić odczynnik do znakowania biotyną (przechowywany w zamrażarce w temperaturze -80 °C) na stole i przygotować zestaw do wykrywania białek na lodzie w temperaturze 4 °C, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta.
  2. Wymieszaj 0,15 ml luminolu z 0,15 ml nadtlenku i załaduj 0,01 ml do 25 dołków (rząd E, dołki 1-25) płytki do zautomatyzowanej maszyny zachodniej. Załadować 0,008 ml Streptawidyny-HRP z zestawu do studzienek D1 do D25
  3. Załadować 0,01 ml roztworu rozcieńczalnika przeciwciał do studzienek C1 do C25 i B1.
  4. Odwiruj 24 próbki białka i rurki drabinkowe krótko (2-3 sekundy) w miniwirówce, aby zebrać odparowaną wodę z nakrętek probówek.
  5. Załadować 0,003 ml 12 niezagruntowanych próbek do studzienek od A2 do A13, 0,003 ml 12 próbek zagruntowanych siarą do studzienek A14 do A25 i 0,005 ml biotynylowanej drabinki do studzienki A1.
  6. Pozostaw rząd F pusty i załaduj 0,45 ml buforu do mycia do każdej z 5 komór w każdym z 3 rzędów poniżej rzędu F. Przykryj płytkę plastikową pokrywką, aby uniknąć parowania podczas pozostałych procedur.
  7. Krótko zmieszać rozmrożony odczynnik do znakowania biotyny i dodać 0,15 ml odczynnika do wyznaczonej probówki; następnie dodać do niego 0,15 ml całkowitego środka do rozpuszczania białka i wymieszać je do uzyskania jednorodności.
  8. Zdjąć pokrywę z płytki i załadować 0,01 ml środków 1 i 2 do studzienek od B2 do B25. Przykryć płytkę i odwirować ją przez 10 minut przy 1 000 x g, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z różnych roztworów. Użyj pustej płytki w wirówce, aby uzyskać równowagę.

5. Elektroforeza

  1. Podczas obracania się płytki otwórz plik uruchamiania w zautomatyzowanym komputerze podłączonym do maszyny zachodniej, wskazując na stronie rozwijanej z "pliku", aby uruchomić test całkowitego białka i klikając odpowiednie miejsce.
  2. Opisz próbki według studni w komputerze. Następnie wyjmij płytkę z wirówki, zdejmij pokrywę i ostrożnie zdejmij aluminiową osłonę z komór roztworu separacyjnego.
  3. Umieść płytkę w automatycznym przyrządzie zachodnim, zdejmij pokrywę z pudełka na kapilarne wkłady, włóż wkładkę w wyznaczone miejsce i zamknij drzwiczki.
  4. Kliknij przycisk "URUCHOM", a po wyświetleniu monitu o rodzaj testu ("białko całkowite") wpisz nazwę próbek (na przykład "niezaszczepiona 2-13 i siara zagruntowana 14-25"). Kliknij "OK", a gdy pojawi się monit o aktywowaną datę uruchomienia i numer identyfikacyjny pliku uruchamiania, zanotuj czas zakończenia uruchamiania.
  5. Pod koniec biegu (170 min po starcie) otwórz drzwiczki instrumentu, wyjmij wkład kapilarny i wyrzuć go do wysypiska ostrych przedmiotów. Wyrzuć płytkę wraz z utylizacją materii biologicznej.
  6. Kliknij ikonę krzywych separacji na stronie analizy pliku uruchamiania i sprawdź, czy wszystkie próbki przebiegały prawidłowo i pokazują wiele krzywych białkowych we wszystkich naczyniach włosowatych.

6. Analiza białek sygnałowych

  1. W znakowanej probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 0,003 ml króliczego przeciwciała anty phospho-eIF2a (p-eIF2a) i zawieś je w 0,3 ml (rozcieńczenie 1:100) w rozcieńczalniku przeciwciał z odpowiedniego zestawu do wykrywania. Następnie trzymaj go na lodzie.
  2. Oznacz probówkę luminolową i dodaj 0,15 ml luminolu i 0,15 ml nadtlenku z tego zestawu modułu detekcyjnego i dozuj 0,01 ml do studzienek od E1 do E25 świeżej, zautomatyzowanej płytki zachodniej.
  3. Dozować 0,01 ml drugorzędowego przeciwciała przeciw królikowi do studzienek od D2 do D25 i dodać 0,01 ml streptawidyny-HRP z zestawu do studzienki D1.
  4. Dozować 0,01 ml przeciwciała pierwszorzędowego (od kroku 6.1) do studzienek C2 do C25 i dodać 0,01 ml roztworu rozcieńczalnika przeciwciał 2 do dołków C1 i B1 do B25.
  5. Pozostaw studzienki rzędu F puste i napełnij 0.45 ml buforu do płukania do 5 przegródek w 3 rzędach poniżej rzędu F.
  6. Krótko obracaj schłodzone próbki przez 3 s i dodaj 0,003 ml każdej próbki do rzędu A w tej samej kolejności, w jakiej zostały dodane do testu białka całkowitego, zaczynając od A2 do A25. Dodać 0,005 ml biotynylowanej drabinki MW do dołka A1 i przykryć płytkę.
  7. Odwirować płytkę, jak to opisano w kroku 4.8. Podczas obracania się płytki otwórz (w zautomatyzowanym oprogramowaniu i komputerze powiązanym z Zachodem) nowy plik uruchamiania i wskaż na stronie rozwijanej z "Plik", aby uruchomić test wielkości cząsteczki, klikając odpowiednie miejsce.
  8. Na stronie testu wpisz nazwy próbek w każdej kapilarze, a następnie wpisz nazwę przeciwciała pierwszorzędowego w przydzielonym miejscu i drugorzędowe przeciwciało przeciw królikowi poniżej.
  9. Pod koniec wirowania powtórz kroki 5.3–5.5, z wyjątkiem tego, że nazwa nadana plikowi uruchamiającemu tym razem powinna brzmieć "p-eIF2a na niezagruntowanych 2–13 i siara zagruntowanych 14–25".
  10. Po rozdzieleniu za pomocą elektroforezy należy sprawdzić plik wyjściowy pod kątem pików reaktywności immunologicznej antygenów o rozmiarach 40–43 kDa. W przypadku braku MW pików tej wielkości, kliknij prawym przyciskiem myszy poniżej krzywej i wskaż na liście rozwijanej, aby dodać MW do szczytu, co gwarantuje, że zostanie zarejestrowany rozmiar i dowolna ilość poniżej krzywej.

7. Przetwarzanie wyników

  1. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego dla całkowitego przebiegu białka w zautomatyzowanym pliku Western Run i podaj numer identyfikacyjny.
  2. Otwórz plik roboczy testu białka całkowitego na stronie analizy w trybie krzywej i zaznacz wszystkie piki w poszczególnych naczyniach włosowatych. Następnie skopiuj je i wklej do arkusza kalkulacyjnego i zsumuj obszary pod krzywą wszystkich pików zarejestrowanych w całej kapilarze.
  3. W osobnej kolumnie ułóż całkowitą ilość białka dla każdej kolumny z numerami naczyń włosowatych, nazwami odpowiednich jąder mózgowych i numerami identyfikacyjnymi plików uruchamiania.
  4. Otwórz arkusz kalkulacyjny dla antygenu p-eIF2a i w jednej kolumnie zapisz obszar pod krzywą z każdej kapilary obok siebie z odpowiednim numerem kapilary, nazwą jądra mózgowego i numerem identyfikacyjnym pliku przebiegu.
  5. Skopiuj kolumnę białka całkowitego (równolegle do ilości krzywej p-eIF2a) do trzeciego arkusza kalkulacyjnego i oblicz p-eIF2a:całkowite proporcje białka w trzeciej kolumnie.
  6. Zbierz wyniki z kroków od 4 do 6 dla każdego jądra mózgu, ułóż je w grupy jąder i wygeneruj wykres słupkowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne prążki immunoreaktywności w stosunku do całkowitej ilości białka wykazują, że istnieją jądra mózgu o bardzo niskiej zawartości pozyskanego białka. Wymaga to zastosowania zautomatyzowanej techniki Western blot, która charakteryzuje się wysoką czułością w porównaniu do klasycznego Western blot. Podejście to pozwala na analizę ilości białka na kapilarę czterdziestokrotnie mniejszej niż ilość białka nanoszona na jedną ścieżkę w tradycyjnych analizach Western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono technikę mikrodysekcji dyskretnych, bogatych w OTR jąder mózgowych w mózgu noworodka szczura. Powszechnie wiadomo, że neurony są wysoce wyspecjalizowane, nawet w obrębie dobrze scharakteryzowanych jąder w mózgu. To wysoce powtarzalne podejście do izolowania specyficznych jąder bogatych w OTR umożliwia solidne testowanie hipotez. Dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego Western blotting spójność i odtwarzalność wyników uległy dalszej poprawie. Chociaż ograniczeniem tej techniki pozostaje niewielka zm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Manon Ranger i Alexandrze Schulz za pomoc w przygotowaniu tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór BradfordBio Rad
Zestaw do lizy białekBiałko prosteCBS403Zestawy Bicine/CHAPS
WESBiałko prosteZestaw główny WES-Mouse 12-230 (PS-MK15), zestaw główny WES-Rabbit 12-230 (PS-MK14), WES 12-230 kDa całkowity zestaw główny białka (PS-TP07)
koniugat anty-mysi IgG HRPBiałko proste
Królik anty-fosfo-eIF2aTechnologia sygnalizacji komórkowejSER51, 9721
mysi mAb anty-PKRTechnologia sygnalizacji komórkowej2103
Królik anty-fosfo-PKRMilliporeThr451, 07-886
Królicza mAb anty-PKRTechnologia sygnalizacji komórkowej12297
mAb królika anty-GAPDHTechnologia sygnalizacji komórkowej2118
mysia mAb anty-fosfo-IKBTechnologia sygnalizacji komórkowej9246
mysia mAb anty-IKBTechnologia sygnalizacji komórkowej4814
królicza technologia sygnalizacji komórkowej anty-BiP3183
Królicza technologia sygnalizacji komórkowejanty GCN23302
MAb królika anty-fosfo-GCN2BIORBYTT899
w ciąży Szczury Sprague-DawleyCharles River Laboratories
Urządzenie do dziurkowaniaWellTech Rapid Core lub Harris Uni-Core0,35, 0,50, 0,75, 1,0, 1,20, 1,50

Bibliografia

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205(2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504(2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70(2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654(2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886(2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

M zg noworodka szczuraizolacja j der m zguWestern blottingstres retikulum endoplazmatycznegosygnalizacja zapalnaanaliza ekspresji bia ektechnika wycinania j der punchingautomatyczny system do Western blottingu
Ocena stresu komórkowego i stanu zapalnego w dyskretnych jądrach mózgu wydzielających oksytocynę u nowonarodzonego szczura przed i po pierwszym karmieniu siarą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.