Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58347

⸱

4 października 2018

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, School of Medicine, University of Nevada, 2Department of Pharmacology, Larner College of Medicine, University of Vermont

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Streszczenie

Aktywność elektryczna komórek w tkankach może być monitorowana za pomocą technik elektrofizjologicznych, ale zazwyczaj ograniczają się one do analizy pojedynczych komórek. Ponieważ wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia (Ca2+) w cytozolu często występuje z powodu aktywności elektrycznej lub w odpowiedzi na niezliczone inne bodźce, proces ten można monitorować poprzez obrazowanie komórek obciążonych fluorescencyjnymi barwnikami wrażliwymi na wapń. Jednak trudno jest zobrazować tę reakcję w pojedynczym typie komórki w całej tkance, ponieważ barwniki te są pobierane przez wszystkie typy komórek w tkance. W przeciwieństwie do tego, genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) mogą być wyrażane przez pojedynczy typ komórki i fluoryzować w odpowiedzi na wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2 +, umożliwiając w ten sposób obrazowanie sygnalizacji Ca2 + w całych populacjach poszczególnych typów komórek. Tutaj stosujemy użycie GECI GCaMP3 / 6 do mysiego połączenia nerwowo-mięśniowego, trójdzielnej synapsy między neuronami ruchowymi, mięśniami szkieletowymi i końcowymi / perisynaptycznymi komórkami Schwanna. Pokazujemy przydatność tej techniki w klasycznych preparatach tkankowych ex vivo. Za pomocą rozdzielacza optycznego wykonujemy obrazowanie dynamicznych sygnałów Ca2+ o podwójnej długości fali i statycznej etykiety połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) w podejściu, które można łatwo dostosować do jednoczesnego monitorowania dwóch specyficznych dla komórki GECI lub genetycznie kodowanych wskaźników napięcia (GEVI). Na koniec omówimy procedury używane do tworzenia przestrzennych map intensywności fluorescencji. Razem, te techniki optyczne, transgeniczne i analityczne mogą być wykorzystane do badania aktywności biologicznej różnych subpopulacji komórek w NMJ w wielu różnych kontekstach.

Wprowadzenie

NMJ, podobnie jak wszystkie synapsy, składa się z trzech elementów: presynaptycznego zakończenia pochodzącego z neuronu, postsynaptycznego neuronu/komórki efektorowej i perisynaptycznej komórki glejowej1,2. Podczas gdy podstawowe aspekty transmisji synaptycznej zostały po raz pierwszy zademonstrowane w tym synapse3, wiele aspektów tego procesu pozostaje nieznanych, częściowo ze względu na ekspresję tych samych cząsteczek przez odrębne elementy komórkowe tej synapsy. Na przykład receptory zarówno nukleotydu purynoadeninowego ATP, jak i acetylocholiny (ACh), które są współuwalniane przez neurony ruchowe w NMJ kręgowców, są wyrażane przez mięśnie, komórki Schwanna i neurony ruchowe, komplikując w ten sposób interpretację wszelkich efektów funkcjonalnych wywieranych przez te substancje (np. uwolnienie lub odpowiedź nadajnika, wytwarzanie siły mięśniowej)4. Co więcej, chociaż trójdzielne składniki NMJ są proste w porównaniu z, na przykład, neuronami w ośrodkowym układzie nerwowym, które często wykazują wiele wejść synaptycznych, nie jest jasne, czy neurony ruchowe, komórki mięśniowe czy komórki Schwanna różnią się w odpowiedzi na bodźce w oparciu o ich wewnętrzną heterogeniczność (np. pochodzenie embrionalne, podtyp włókna, morfologia). Aby rozwiązać każdy z tych problemów, korzystne byłoby jednoczesne śledzenie odpowiedzi wielu komórek w obrębie jednego elementu synaptycznego, a także jednoczesne śledzenie takiej odpowiedzi w którymkolwiek z pozostałych oddzielnych elementów. Konwencjonalne strategie wykorzystujące barwniki chemiczne do pomiaru sygnalizacji wapniowej nie mogą osiągnąć tych dwóch celów, ponieważ barwnik stosowany w kąpieli jest pobierany przez wiele typów komórek po nałożeniu na tkankę, a barwnik ładowany wewnątrzkomórkowo może być używany tylko do wizualizacji pojedynczych lub małych kohort komórek. Tutaj, wykorzystując transgeniczne myszy eksprymujące GECI zaprojektowane do pomiaru specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej, wraz ze specyficznymi narzędziami do obrazowania i oprogramowania5, demonstrujemy pierwszy z tych dwóch ogólnych celów i omawiamy, w jaki sposób dodanie nowych narzędzi transgenicznych pomogłoby osiągnąć drugi. Technika ta będzie przydatna dla każdego, kto jest zainteresowany śledzeniem dynamiki wapnia lub innych zdarzeń sygnalizacji komórkowej, które można zaobserwować za pomocą kodowanych genów czujników optycznych w wielu populacjach komórek w tym samym czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Hodowla zwierząt i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz IACUC na Uniwersytecie Nevady.

1. Przygotowanie przepony i nerwów przeponowych od myszy transgenicznych

  1. Kup transgeniczne myszy i startery oligonukleotydowe, aby genotypować te myszy.
    Uwaga: Startery są wymienione na stronie "Informacje" dla każdej z tych myszy.
    1. Wyhoduj mysz w wieku od 3 do 6 miesięcy z ekspresją jednej kopii odpowiedniego transgenicznego/knock-in allelu Cre-driver i zerowymi kopiami warunkowego allelu GCaMP3/6 z drugą myszą w tym samym wieku z ekspresją jednej lub dwóch kopii warunkowego allelu GCaMP3/6 i zerowymi kopiami allelu Cre-driver.
    2. Genotyp szczeniąt i oznaczanie tych, które mają zarówno allele Cre, jak i warunkowe GCaMP3/6 - będą one odtąd nazywane podwójnie transgenicznymi myszami (np. Myf5-Cre, warunkowe GCaMP3)6.
      Uwaga: W ten sposób wszystkie dane będą pochodzić od myszy wyrażających jedną kopię zarówno alleli Cre, jak i warunkowych GCaMP3/6. Jest to szczególnie ważne, gdy dodaje się inne zmutowane myszy (np. nokauty) do tych krzyżówek.
  2. Kiedy podwójnie transgeniczne myszy są w odpowiednim wieku (np. 0 lub 5 dzień po urodzeniu [P0 lub P5] lub dorosły), należy poddać myszy eutanazji poprzez odcięcie im głów nożyczkami (dla myszy młodszych niż P10) lub umieszczenie ich w komorze inhalacyjnej izofluranu – gdy nie reagują już na szczypanie ogona parą kleszczy, Są gotowi do poświęcenia.
  3. Poświęć zwierzę przez ścięcie nożyczkami.
  4. Przekrój poprzeczny w poprzek całego zwierzęcia tuż pod wątrobą i tuż nad sercem i płucami za pomocą nożyczek do irydektomii.
  5. Wypreparuj wątrobę, serce i płuca, uważając, aby utrzymać długość nerwu przeponowego, która jest wystarczająco długa, aby można ją było wciągnąć do elektrody ssącej (tj. 1 - 2 cm).
    Uwaga: Lewy nerw przeponowy można zidentyfikować jako biały fragment tkanki, który wchodzi do przyśrodkowej części lewej przepony. Nie wolno go przecinać podczas usuwania płuc. Prawy nerw przeponowy biegnie w kawałku powięzi, który zawiera również żyłę główną górną i jest cieńszy i bielszy niż żyła główna. Razem oba przenikają do prawej przepony przyśrodkowej.
  6. Następnie usuń klatkę piersiową i kręgosłup, z wyjątkiem cienkiego grzbietu wokół przepony.
  7. Umieścić membranę i próbkę nerwu przeponowego w probówce do mikrodymu z roztworem Krebsa-Ringera z 1 μg/ml 594-αBTX na 10 minut w ciemności.
    Uwaga: To stężenie 594-αBTX znakuje receptory ACh (AChR) bez blokowania ich funkcji (obserwacja osobista).

2. Stymulacja i rejestracja potencjałów czynnościowych mięśni

  1. Za pomocą szpilek unieruchamionych unieruchamić membranę, przypinając ją do 6-centymetrowego naczynia pokrytego silikonowym żelem dielektrycznym i wypełnionego ~8 ml natlenionego roztworu Krebsa-Ringera i umieść go na stoliku mikroskopu. Ukrwić membranę większą ilością roztworu Krebsa-Ringera (8 ml/min) przez 30 min.
    Uwaga: Powoduje to wypłukanie niezwiązanego 594-αBTX, a także wyrównanie tkanki po rozwarstwieniu.
  2. Wykonaj elektrodę ssącą zgodnie z ustalonymi metodami7.
    1. Przy 4-krotnym powiększeniu, za pomocą mikromanipulatora, przesuń elektrodę ssącą nad lewym nerwem przeponowym i zastosuj ssanie, wyciągając cylinder strzykawki o pojemności 5 ml podłączonej do rurki przymocowanej do elektrody ssącej.
      Uwaga: Po pomyślnym wciągnięciu do elektrody ssącej nerw przeponowy jest napięty. Włącz stymulator i stymuluj nerw przeponowy, przestawiając przełącznik ręczny 1x.
    2. Upewnij się, że membrana kurczy się w odpowiedzi na stymulację 1 Hz, badając ją wzrokowo za pomocą oświetlenia w jasnym polu. Jeśli nie, wyreguluj napięcie, stopniowo obracając pokrętło napięcia, aby uzyskać impuls supramaksymalny, który można zweryfikować za pomocą wizualnego badania skurczu mięśni. Jeśli nadal nie jest widoczny, przedmuchaj nerw strzykawką i spróbuj wciągnąć go ponownie, odsysając.
  3. Wyłączyć perfuzję i dodać specyficzny dla mięśni inhibitor miozyny BHC6 lub bramkowany napięciem antagonistę kanału sodowego μ-konotoksynę8 do końcowego stężenia 100 μM.
    1. Aby uzyskać 100 μM BHC, należy odpipetować 4 μl z 200 mM zapasu w DMSO i wstępnie rozcieńczyć w 1 ml roztworu Krebsa-Ringera.
    2. Usuń 1 ml roztworu Krebsa-Ringera z naczynia.
    3. Dodaj wstępnie rozcieńczony BHC do naczynia.
      Uwaga: To wstępne rozcieńczenie pomaga zapobiec indukcji przez nierozcieńczony DMSO nieprzejściowej odpowiedzi fluorescencyjnej w komórkach wykazujących ekspresję GCaMP3.
    4. Odczekać 30 minut, a następnie włączyć perfuzję świeżego roztworu Krebsa-Ringera na kolejne 20 - 30 minut.
  4. Przygotuj elektrodę rejestrującą.
    1. Zakładając rękawice, umieść szkło z włókna borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej (OD) 1 mm i średnicy wewnętrznej (ID) 0,4 mm w ściągaczu do mikropipet i dokręć pokrętła, aby zacisnąć je na miejscu. Zamknij drzwiczki ściągacza.
    2. Za pomocą ściągacza P-97 zaprogramuj następujące ustawienie: ciepło na 900, ciągnięcie na 120, prędkość na 75, czas na 250, ciśnienie na 500 i bez dodatkowych pętli.
      Uwaga: Rezystancja (R) jest mierzona za pomocą oprogramowania sterującego wzmacniacza: oprogramowanie do akwizycji danych potwierdza rezystancję, rozwiązując wzór V = IR. Sterownik programowy przepuszcza znany prąd (I) (zwykle 1 nA) przez elektrodę i mierzy zmianę napięcia (V), umożliwiając nam w ten sposób rozwiązanie R.
    3. W przypadku membran embrionalnych należy upewnić się, że rezystancja jest bliska 60 MΩ, a w przypadku starszych membran 10 - 20 MΩ. Załaduj elektrodę rejestrującą 3 M KCl.
  5. Przy 10-krotnym powiększeniu opuść elektrodę do mięśnia, używając drugiego mikromanipulatora po przeciwnej stronie stolika jako elektrody stymulującej.
  6. Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych, poczekaj, aż spoczynkowy potencjał błonowy zmieni się z 0 na -65 mV lub poniżej.
  7. Stymulować przy 1 Hz i sprawdzić obecność potencjału czynnościowego mięśni, sprawdzając, czy istnieje duży potencjał, który wykazuje umiarkowane przeregulowanie (potencjał, który wzrasta powyżej 0 mV, gdy zaczyna się od -65 mV lub poniżej). Nie należy mylić artefaktu stymulacji z potencjałem czynnościowym.
    Uwaga: Potencjały są znacznie dłuższe w czasie trwania (~5 ms) niż artefakty stymulacji.

3. Obrazowanie fluorescencji próbki

  1. Przy 20-krotnym powiększeniu zlokalizuj pasmo płytki końcowej w środku mięśnia, szukając NMJ znakowanych 594-αBTX pod wzbudzeniem światłem zielono-żółtym (550 nm). Przełącz się na wzbudzenie światłem niebieskim (470 nm), aby zobrazować odpowiedzi Ca2+ w mięśniach, neuronach ruchowych lub komórkach Schwanna.
  2. W razie potrzeby skonfiguruj rozdzielacz obrazu z filtrami pasmowoprzepustowymi i dichroicznym filtrem jednokrawędziowym do obrazowania o podwójnej długości fali.
  3. W celu obliczenia maksymalnej fluorescencji (Fmax) wykazywanej przez tkankę wykazującą ekspresję GCaMP3/6, należy dodać 12 μl 3 M chlorku potasu (KCl) do preparatów diafragmy 6.
    1. Wykonuj eksperymenty z paskiem jasności na pasku tabeli przeglądowej ustawionym na 110% poziomu, przy którym tkanka wykazująca ekspresję GCaMP3/6 wykazuje nasycenie przy 20-krotnym powiększeniu, bez kategoryzacji w odpowiedzi na KCl.
  4. Nagrywaj z szybkością 20 klatek na sekundę, aby nie przegapić żadnych szybkich wydarzeń.
  5. Stymulować stymulacją nerwów przez 1 - 45 s 20 - 40 Hz, dostarczając ciąg impulsów za pomocą elektrody ssącej lub dodać farmakologicznych agonistów przez kąpiel lub perfuzję i zebrać dynamiczne odpowiedzi fluorescencyjne Ca2+ w jednym podtypie komórki wraz ze statycznym sygnałem NMJ 594-αBTX.
    Uwaga: Jeśli specyficzne tkankowo czerwone lub dalekie myszy GECI lub GEVI staną się dostępne do użytku w NMJ, można je wykorzystać do zebrania dwóch dynamicznych sygnałów odzwierciedlających dwa odrębne elementy komórkowe w NMJ.
  6. Po zakończeniu obrazowania lub eksperymentów elektrofizjologicznych, ponieważ osiągnięto pożądane wyniki, należy przepuścić wodę przez linie perfuzyjne i zassać wodę 2x - 3x przez elektrodę ssącą, aby upewnić się, że sole nie gromadzą się.

4. Eksport i analiza danych za pomocą mapy odchyleń standardowych intensywności fluorescencji (SDiu16)

  1. Nagrywaj sekwencje obrazów nagrane jako 16-bitowe stosy TIFF i ładuj je do żądanego systemu analizy danych obrazowania w celu analizy.
  2. W menu pliku 8d oprogramowania wybierz Stos obrazów zainteresowania i kliknij, aby załadować.
    1. Po załadowaniu filmu przeskanuj czas, aby zidentyfikować sekcję, która nie ma komórkowej aktywności fluorescencyjnej.
      Uwaga: Ten region zostanie użyty do utworzenia próbki tła.
    2. Przytrzymaj Shift i kliknij, aby narysować pole obszaru zainteresowania (ROI) w obszarze zidentyfikowanym jako próbkowy obszar tła.
    3. Po utworzeniu pola naciśnij spację, aby wygenerować wykres zmiany aktywności w tle.
    4. Kliknij prawym przyciskiem myszy ślad i wybierz wybraną opcję, aby wyświetlić opcję Zrzuć ROI jako tekst, aby utworzyć ślad jako plik tekstowy współrzędnych xy.
  3. Wracając do interesującego Cię filmu, zeskanuj ponownie, aby zidentyfikować region czasu, w którym występuje interesująca aktywność.
    1. Za pomocą środkowego przycisku myszy wybierz ten region czasu w żółtym polu czasu.
    2. Kliknij wideo prawym przyciskiem myszy i wybierz Stack OPS, a następnie opcję mapy statystyk 5.
      Uwaga: Spowoduje to wygenerowanie mapy odchyleń standardowych (mapy SD) w lewym oknie.
    3. Kliknij mapę SD, a następnie naciśnij ] 19x, aby zastosować odpowiednią kolorową mapę cieplną.
    4. Kliknij prawym przyciskiem myszy mapę SD i wybierz opcję Załaduj i zapisz STM, co spowoduje wyświetlenie opcji Zapisz stm jako tiff, aby zapisać mapę SD.
    5. Następnie naciśnij [ 19x, aby powrócić do mapy kolorów w skali szarości.
    6. Naciśnij C, a następnie D, aby wyświetlić narzędzia do mapowania zagęszczenia. Używając lewego i środkowego przycisku myszy, dostosuj próg, aby uwzględnić całą aktywność fluorescencyjną pokazaną na mapie SD.
    7. Naciśnij C, aby zamknąć narzędzia zagęszczenia, zachowując ustawienia progu.
    8. Kliknij prawym przyciskiem myszy mapę SD i wybierz Cząstki STM, a następnie Znajdź PTCLS.
      Uwaga: Pozwoli to zidentyfikować poszczególne komórki wyrażające aktywność fluorescencyjną.
    9. Ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy mapę SD i wybierz opcję Utwórz ROI cząstek.
      Uwaga: Spowoduje to nałożenie wybranych komórek na oryginalny film, który Cię interesuje.
    10. Trzymając wciśnięty Shift, kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny z teraz zidentyfikowanych wskaźników ROI cząstek w oryginalnym filmie.
    11. Wybierz znacznik ROI i zmierz int w ROI.
      Uwaga: Spowoduje to wygenerowanie indywidualnych wykresów aktywności fluorescencyjnej dla każdego zidentyfikowanego zwrotu z inwestycji w interesującym Cię filmie. Można je zapisać, klikając prawym przyciskiem myszy dowolny z nich i wybierając Różne, a następnie Zrzuć ROI jako tekst.
  4. Aby uzyskać szczegółową logikę leżącą u podstaw tych operacji, zobacz plik kodu źródłowego9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Użyteczność tego podejścia wykazują liczne przykłady zmian intensywności fluorescencji, wywoływanych wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ w określonych typach komórek połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ). Wyniki te przedstawiono w formie przestrzennych map intensywności fluorescencji, które wskazują lokalizację reagujących komórek oraz intensywność ich odpowiedzi, co pozwala na ocenę liczby komórek reagujących oraz stopnia reakcji każdej z nich na konkretny bodziec. Na pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj podajemy kilka przykładów pomiaru odpowiedzi Ca2 + w określonych komórkach w nienaruszonej tkance nerwowo-mięśniowej przy użyciu myszy z ekspresją GECI. Aby pomyślnie przeprowadzić te eksperymenty, konieczne jest, aby nie uszkodzić nerwu przeponowego podczas sekcji. Aby zobrazować odpowiedzi Ca2+ w komórkach Schwanna przy niskiej lub dużej mocy (tj. 20X lub 60X), konieczne jest użycie BHC lub μ-konotoksyny w celu zablokowania ruchu. W przypadku obrazowania odpowiedziCa2+ w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta funduszami z National Institutes of Health (NIH) GM103554 i GM110767 do (T.W.G.) oraz z National Center for Research Resources 5P20RR018751 i National Institute of General Medical Sciences 8P20 GM103513 (do G.W.H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myf5-CreJax#007893Napędzają ekspresję komórek mięśniowych już w klasie E136
Wnt1-Cre myszyJax#003829Napędza ekspresję we wszystkich  Komórki Schwanna w E13, ale nie P209
Myszy Sox10-CreJax#025807Napędzają ekspresję komórek Schwanna w starszym wieku
Warunkowe myszy GCaMP3Jax#029043Wyraża GCaMP3 w sposób specyficzny dla komórki
Warunkowe myszy GCaMP6fJax#024105Wyraża GCaMP6f w sposób
specyficzny dla komórkiBHC (3-(N-butyletanimidoyl)-4-hydroksy-2H-chromen-2-on)Hit2Lead#5102862Blokuje miozynę mięśni szkieletowych, ale nie neurotransmisję6
CF594-α-BTXBiotium#00007Etykiety klastry receptora acetylocholiny w NMJ
&mikro;-konotoksyna GIIIbPeptydy Int'l#CONO20-01000Blokuje Nav1.4 zależny od napięcia kanał sodowy8
Silikonowy żel dielektryczny; alias SylgardEllswoth Adhesives# Sil Dielec Gel .9KG Pozwala na unieruchomienie membrany za pomocą maleńkich kołków
Kołki Minutien (średnica 0,1 mm)Fine Science Tools26002-10Unieruchamia membranę na silikonowym żelu dielektrycznym
Mikroskop pionowy Eclipse FN1 NikonMBA74100Umożliwia klasyfikację i obserwację próbki
Podstawowa platforma mikroskopu stałego z ręcznym translatorem mikroskopu XY Autom8MXMScrUmożliwia przemieszczanie próbki
Mikromanipulator ręczny NarishigeM-152Posiada elektrody rejestrujące i stymulujące 
Wzmacniacz mikroelektrod Urządzenia molekularneAxoclamp 900AUmożliwia ostry wewnątrzkomórkowy zapis elektrofizjologiczny
akwizycji danych o niskim poziomie szumów MikroelektrodyUrządzenia molekularneDigidata 1550 Umożliwia akwizycję danych elektrofizjologicznych
System analizy danych mikroelektrodowychUrządzenia molekularnePCLAMP 10 StandardWykonuje analizę danych elektrofizjologicznych
Stymulator fali prostokątnejTrawaS48Stymuluje nerwy do pobudzenia mięśni
Jednostka izolacji bodźcówTrawaPSIU6Redukuje  artefakty stymulacyjne
Włókna borokrzemianowe, średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm SutterFG-GBF100-50-15Nabija na pal i rejestruje potencjały mięśniowe wywołane przez nerwy
Włókna borokrzemianowe, średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 1,17 mm SutterBF150-117-15Przedłużony i używany do elektrody ssącej
Ściągacz do mikropipetSutterP-97 Wyciąga i przygotowuje elektrody rejestrujące
1200x1200 pikseli, podświetlana kamera cMOS PhotometricsPrime 95bCzuła kamera, która umożliwia szybkie obrazowanie w wysokiej rozdzielczości
Źródło światłaLumencorSpectra XZapewnia oświetlenie z diod LED w celu obserwacji fluorescencji
  Obiektywy fluorescencyjne z korekcją nieskończoności, W.D. 2mm NikonCFI60Zapewnia duże odległości robocze do wizualizacji próbki
Oświetlacz światłowodowy z lampą halogenowąSumitaLS-DWL-NZapewnia oświetlenie do obserwacji w jasnym polu
Rozdzielacz obrazu W-View Gemini HamamatsuA12801-01Wyświetla 1 parę obrazów o podwójnej długości fali oddzielonych dichroicznym do pojedynczego aparatu
Jednopasmowe filtry pasmowo-przepustowe  (512/25-25 i 630/92-25) SemRockFF01-512/25-25; FF01-630/92-25Umożliwia obrazowanie dwuzakresowe
560 nm Jednokrawędziowy dichroiczny rozdzielacz wiązkiSem RockFF560-FDi01-25x36Lustro dichroiczne, które oddziela wiązki światła, aby umożliwić obrazowanie o podwójnej długości fali
System akwizycji danych obrazowychNikon NIS Elements - MQS31000Umożliwia akwizycję danych obrazowych
Moduł kontroli długości faliNikonMQS41220Moduł do danych obrazowych acquiytion
Moduł sprzętowy rozdzielacza emisji NikonMQS41410Moduł do pozyskiwania danych obrazowych
System analizy danych obrazowychNAVolumetry 8D5, FidżiUmożliwia analizę intensywności fluorescencji i innych danych obrazowych
myszy System

Bibliografia

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  2. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
  3. Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
  4. Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
  5. Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).
  6. Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).
  7. Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
  8. Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
  9. Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839(2018).
  10. Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

z cze nerwowo mi niowegenetycznie kodowane wska niki wapniaobrazowanie dwud ugo cifalowerozdzielacz optycznyfluorescencyjna alfa bungarotoksynastymulacja nerwu przeponowegoobrazowanie kom rek Schwannaobrazowanie kom rek mi niowych
Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.