Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58351

⸱

7 stycznia 2019

 ,  , 
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Streszczenie

W swoim fizjologicznym środowisku, komórki ssaków są często poddawane mechanicznym i biochemicznym obciążeniom, które skutkują uszkodzeniem błony plazmatycznej. W odpowiedzi na te uszkodzenia złożone mechanizmy molekularne szybko ponownie uszczelniają błonę plazmatyczną, aby przywrócić jej funkcję barierową i utrzymać przetrwanie komórek. Pomimo 60 lat badań w tej dziedzinie, nadal brakuje nam dogłębnej wiedzy na temat maszyn do ponownego zamykania komórek. W celu zidentyfikowania składników komórkowych, które kontrolują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej lub leków, które mogą poprawić ponowne uszczelnianie, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków hodowanych na mikropłytkach. Jako system modelowy do uszkodzenia błony komórkowej, komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory listeriolizyny O (LLO), która tworzy duże pory białkowe o średnicy 30-50 nm w błonach zawierających cholesterol. Zastosowanie wielotrybowego czytnika mikropłytek z kontrolowaną temperaturą pozwala na szybkie i czułe pomiary spektrofluorometryczne w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek za pomocą mikroskopii jasnego pola i fluorescencji. Analiza kinetyczna intensywności fluorescencji emitowanej przez nieprzepuszczalny dla błony fluorochrom wiążący kwas nukleinowy odzwierciedla zakres zranień i ponownego uszczelnienia błony na poziomie populacji komórek, co pozwala na obliczenie skuteczności ponownego uszczelniania komórek. Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym pozwala na zliczenie komórek, które konstytutywnie wyrażają fluorescencyjną chimerę białka jądrowego histonu 2B, w każdym dołku mikropłytki, aby uwzględnić potencjalne zmiany w ich liczbie i pozwala na ostateczną identyfikację odrębnych populacji komórek. Ten wysokoprzepustowy test jest potężnym narzędziem, które ma poszerzyć naszą wiedzę na temat mechanizmów naprawy błon poprzez badania przesiewowe w kierunku genów gospodarza lub egzogennie dodanych związków, które kontrolują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej.

Wprowadzenie

Komórki ssaków są poddawane stresowi mechanicznemu, osmotycznemu i biochemicznemu, co skutkuje utratą integralności błony plazmatycznej. Bez szybkiego i skutecznego ponownego uszczelnienia uszkodzone komórki szybko uległyby zaprogramowanej lub martwiczej śmierci. Od lat sześćdziesiątych XX wieku wysiłki zmierzające do zrozumienia procesu ponownego uszczelniania błony komórkowej były motywowane niszczycielskimi konsekwencjami związanymi z jej dysfunkcjami. Rzeczywiście, choroby takie jak dystrofia mięśniowa obręczowo-kończynowa, cukrzyca i zespół Chediaka-Higashiego zostały powiązane z niedostateczną naprawą błony plazmatycznej z powodu mutacji w genie kodującym dysferlinę, produkcji zaawansowanych produktów końcowych glikacji i defektów w lizosomalnym regulatorze transportu CHS1, odpowiednio1,2,3,4,5,6. Jednak do tej pory nasza wiedza na temat ponownego uszczelniania membran jest nadal ograniczona7. Wstępne badania wykazały, że ponowne uszczelnienie błony jest inicjowane przez napływ zewnątrzkomórkowego Ca2+ przez uszkodzoną błonę plazmatyczną8,9,10. Od tego czasu zaproponowano kilka wzajemnie wykluczających się mechanizmów zależnych odCa2+ w celu ponownego uszczelnienia komórek. Hipoteza łatki zakłada, że w pobliżu rany pęcherzyki wewnątrzkomórkowe łączą się ze sobą i z uszkodzoną błoną plazmatyczną, działając jak łata11,12,13,14. Drugi model sugeruje, że zależna od wapnia egzocytoza lizosomów w miejscu rany uwalnia enzym lizosomalny kwas sfingomielinazę, który przekształca sfingomielinę w ceramid w zewnętrznej płatku błony komórkowej. Ta nagła zmiana składu lipidów powoduje endocytozę uszkodzonego regionu wywołaną ceramidami15,16,17. Wreszcie, trzeci proponowany mechanizm obejmuje rolę endosomalnego kompleksu sortującego wymaganego do transportu (ESCRT) w promowaniu tworzenia pęcherzyków skierowanych na zewnątrz, które wyrastają z błony komórkowej18. W tych modelach zidentyfikowano tylko ograniczony zestaw białek, a ich mechanizm musi zostać dokładniej wyjaśniony.

Tutaj opisujemy test o wysokiej przepustowości, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej w przylegających komórkach ssaków poddanych uszkodzeniu, w którym pośredniczy rekombinowana listeriolizyna O (LLO)19. LLO jest toksyną tworzącą pory (PFT) wydzielaną przez fakultatywny wewnątrzkomórkowy patogen Listeria monocytogenes20,21,22 i należy do nadrodziny MACPF/CDC (kompleks ataku błonowego, perforyna i cytolizyna zależna od cholesterolu). MACPF to białka tworzące pory ssaków zaangażowane w obronę immunologiczną, podczas gdy CDC to toksyny bakteryjne wytwarzane głównie przez patogeny Gram-dodatnie, które uszkadzają komórki gospodarza, promując ich patogenny styl życia23. CDC są syntetyzowane jako rozpuszczalne w wodzie monomery lub dimery, które wiążą się z cholesterolem obecnym w błonie komórkowej i oligomeryzują się w kompleks preporowy do 50 podjednostek. Kompleks prepore następnie przestawia się, aby wprowadzić β-nici w poprzek dwuwarstwy lipidowej, tworząc β-beczkowy por o średnicy 30-50 nm24,25,26,27. Te duże pory umożliwiają strumienie jonów i małych składników komórkowych do i z komórki; Jednak niektóre badania sugerują, że powstają również pory o mniejszych rozmiarach28,29,30. Wśród CDC LLO wykazuje unikalne właściwości, w tym nieodwracalną agregację zależną od pH i temperatury, co sprzyja analizom o wysokiej przepustowości31,32. LLO można dodać do pożywki do hodowli komórkowej w temperaturze 4 °C, która pozwala na jego wiązanie z komórkami, ale nie na tworzenie kompleksu porów. Inicjacja tworzenia porów może być następnie zsynchronizowana poprzez podniesienie temperatury do 37 °C, co pozwala na efektywną dyfuzję cząsteczek toksyn w płaszczyźnie błony w celu utworzenia oligomerów i przebudowę konformacyjną zaangażowaną w tworzenie porów. Dlatego po zmianie temperatury kinetyka uszkodzenia komórek będzie zależeć od ilości toksyny związanej z błoną plazmatyczną. Co ważne, rozpuszczalny LLO (niezwiązany z błoną plazmatyczną) szybko i nieodwracalnie agreguje się, gdy temperatura osiągnie 37 °C, co łagodzi konieczność wypłukiwania niezwiązanych cząsteczek toksyny i ogranicza zakres uszkodzeń błony w czasie. Wreszcie, ponieważ LLO wiąże się z cholesterolem i tworzy pory w błonach bogatych w cholesterol, test ten jest podatny na szeroki zakres komórek ssaków. Ważne jest, aby pamiętać, że LLO wpływa na sygnalizację komórkową gospodarza głównie poprzez tworzenie porów, z kilkoma wyjątkami, w których może wystąpić sygnalizacja komórkowa niezależna od porów33,34,35,36,37,38,39. Dlatego nie można wykluczyć, że aktywność sygnalizacyjna LLO może wpływać na proces naprawy błony.

Ten test bezpośrednio ocenia stopień zranienia komórek, mierząc inkorporację nieprzeznaczonego dla komórki fluorochromu (np. jodku propidyny), który pasywnie wnika do uszkodzonych komórek i staje się wysoce fluorescencyjny, gdy połączy się z kwasami nukleinowymi. W związku z tym fluorochrom może być utrzymywany w pożywce do hodowli komórkowych przez cały czas trwania eksperymentu, co pozwala na analizę zranień komórek w czasie rzeczywistym. Intensywność fluorescencji barwnika wiążącego kwas nukleinowy będzie rosła wraz ze stężeniem toksyny i dla danego stężenia toksyny będzie rosła z czasem, aż uformują się wszystkie pory, a komórki zostaną w pełni naprawione lub do osiągnięcia nasycenia. Napływ zewnątrzkomórkowego Ca2 + przez pory błonowe jest warunkiem sine qua non ponownego uszczelnienia. W związku z tym skuteczność ponownego zamykania można pośrednio udowodnić, porównując zranienie komórek w pożywce hodowlanej zawierającej Ca2+ (warunek dopuszczający naprawę) z nawinięciem w pożywce wolnej od Ca2+ (warunek ograniczający naprawę). Ponieważ intensywność fluorescencji barwnika wiążącego kwas nukleinowy jest wprost proporcjonalna do stężenia komórek w każdym dołku, ważne jest, aby zasiać komórki w tym samym stężeniu we wszystkich studzienkach. Ważne jest również, aby zliczyć komórki w każdym dołku przed i po teście, aby upewnić się, że nie dojdzie do oderwania komórek, ponieważ unoszące się, zagregowane komórki mogą zaciemniać odczyty fluorescencji, co może skomplikować interpretację danych. Aby zliczyć komórki, w tym teście użyto komórek wyrażających histon zlokalizowany jądrowo 2B-GFP (H2B-GFP). Wielomodowe czytniki mikropłytek z kontrolowaną temperaturą łączą szybkie, wysokoprzepustowe pomiary intensywności fluorescencji (przy użyciu płytki 96- lub 384-dołkowej) z obrazowaniem mikroskopowym żywych komórek w temperaturze 37 °C. Te ostatnie mogą być używane do wyliczania liczby komórek i obserwowania ostatecznego tworzenia się odrębnych populacji komórek.

Ostatecznie, ten test daje użytkownikom możliwość poszerzenia swojej wiedzy na temat złożoności mechanizmów naprawy błony poprzez badania przesiewowe w poszukiwaniu cząsteczek gospodarza lub egzogennie dodanych związków, które mogą kontrolować naprawę błony. Poniższy protokół opisuje etapy eksperymentalne mające na celu zmierzenie skuteczności ponownego uszczelniania komórek wystawionych na działanie LLO i ocenę wpływu danego leku lub leczenia komórkowego na skuteczność ponownego uszczelniania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Wysiew komórek
    Uwaga: W tym protokole zastosowano ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy HeLa oraz HeLa wykazujące ekspresję Histony 2B-GFP (H2B-GFP), jednak test ten można dostosować do innych komórek ssaków19.
    1. Oddzielić komórki adherentne z kolby do hodowli komórek o powierzchni 75 cm2, przemywając je 2 mL Trypsyny-EDTA 0,25%. Zastąpić zużytą trypsynę 2 mL świeżej trypsyny-EDTA 0,25%.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C przez 5 min, aż komórki przyjmą kształt kulisty i oddzielą się od ścianek kolby.
    3. Resuspendować komórki w 8 mL pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny).
    4. Określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru, wykorzystując 10 µL zawiesiny komórkowej.
    5. Rozcieńczyć komórki w pożywce wzrostowej do stężenia 2,5 x 105 komórek/mL.
    6. Przelać zawiesinę komórkową do sterylnego pojemnika na pipety i dokładnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej 10 mL.
    7. Za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek 200 µL rozdzielić komórki HeLa (2,5 x 104 komórek/100 µL/dołek) w trzech (lub czterech) powtórzeniach na 96-dołkowej czarnej polistyrenowej płytce do hodowli tkanek o płaskim, przezroczystym dnie.
      Uwaga: Przykład układu wysiewu przedstawiono na Rysunku 1.
    8. Hodować komórki przez 24 h w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 ˚C i 5% CO2.
  2. Przygotowanie roztworów stokowych
    1. Przygotować 1 L 10-krotnego roztworu stokowego buforu M (używanego do przygotowania M1 i M2), dodając 95 g zrównoważonego roztworu soli Hanksa, 0,476 g MgCl2 (5 mM) oraz 23,83 g HEPES (100 mM) do 900 mL wody. Dostosować pH do 7,4 i uzupełnić objętość do 1 L. Sterylizować przez filtrację.
    2. Przygotować 50 mL 50-krotnego (1,25 M) roztworu stokowego glukozy, dodając 11,26 g D-(+)-glukozy do całkowitej objętości 50 mL wody. Sterylizować roztwór przez filtrację.
    3. Przygotować 50 mL 100-krotnego (120 mM) roztworu stokowego wapnia, dodając 0,666 g CaCl2 do całkowitej objętości 50 mL wody. Sterylizować roztwór przez filtrację.
    4. Przygotować 50 mL 10-krotnego (50 mM) roztworu stokowego kwasu etylenoglikolu-bis(2-aminoetyloeteru)-N,N,N’,N’,tetraoctowego (EGTA), dodając 0,951 g EGTA do 40 mL wody. Podnieść pH do 8 za pomocą NaOH, aby rozpuścić EGTA, a następnie uzupełnić objętość do 50 mL. Sterylizować roztwór przez filtrację.
    5. Dla jednej płytki 96-dołkowej przygotować odpowiednio 50 mL Pożywki 1 (M1, zawiera Ca2+), 50 mL Pożywki 2 (M2, wolnej od Ca2+) oraz 15 mL Pożywki 2 uzupełnionej o EGTA:
      1. W przypadku M1 dodać 5 mL 10-krotnego buforu M, 0,5 mL 100-krotnego CaCl2 oraz 1 mL 50-krotnej glukozy do 43,5 mL wody.
      2. W przypadku M2 dodać 5 mL 10-krotnego buforu M oraz 1 mL 50-krotnej glukozy do 44 mL wody.
      3. W przypadku M2/EGTA dodać 1,5 mL 10-krotnego buforu M oraz 1,5 mL 10-krotnego EGTA do 12 mL wody.
        Uwaga: Wszystkie roztwory zawierające jodek propidyny (PI) należy przygotować bezpośrednio przed dodaniem do komórek.
  3. Ustawienia czytnika płytek/cytometru obrazującego
    Uwaga: Należy użyć wielofunkcyjnego czytnika płytek wyposażonego w dwie jednostki detekcyjne: spektrofluorometr i cytometr obrazujący. Ograniczyć ekspozycję na fluorescencję, aby uniknąć fotobielenia fluoroforów.
    1. Przed wykonaniem testu rozgrzać czytnik płytek do 37 °C.
    2. W trybie Settings odpowiednio skonfigurować parametry testu kinetycznego:
      1. W konfiguracji optycznej, trybach odczytu i typie odczytu wybrać odpowiednio Monochromator, FL (fluorescence) oraz Kinetic.
      2. W sekcji Wavelength Settings wybrać odpowiednio pasmo przepustowości wzbudzenia 9 nm i emisji 15 nm. W przypadku testów z użyciem jodku propidyny (PI) ustawić długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio na 535 i 617 nm.
      3. W sekcji Plate Type wybrać format płytki 96 Wells oraz predefiniowaną konfigurację płytki odpowiadającą płytce o czarnych ściankach i przezroczystym dnie.
      4. W sekcji Read Area zaznaczyć dołki, które będą analizowane podczas pomiaru kinetycznego.
      5. W sekcji PMT and Optics ustawić liczbę błysków na odczyt na 6 oraz zaznaczyć pole Read from Bottom.
      6. W sekcji Timing wpisać 00:30:00 w polu Total Run Time dla 30-minutowego testu kinetycznego oraz 00:05:00 w polu Interval.
        Uwaga: Czas odczytu pełnej płytki 96-dołkowej dla każdego punktu czasowego i jednej długości fali wynosi 30 s.
      7. Potwierdzić określone ustawienia w sekcji Settings Information po prawej stronie i wybrać OK. Nacisnąć Read, aby rozpocząć pomiar kinetyczny.
    3. W trybie Settings odpowiednio skonfigurować parametry obrazowania:
      1. W konfiguracji optycznej, trybach odczytu i typie odczytu wybrać odpowiednio Minimax, Imaging oraz Endpoint.
      2. W sekcji Wavelengths wybrać transmitted light oraz jedno lub oba pola fluorescencji odpowiadające długościom fal wzbudzenia i emisji 456/541 nm (GFP) oraz 625/713 nm (PI).
      3. Zastosować te same opcje dla Plate Type i Read Area, co w krokach 1.3.2.3 i 1.3.2.4.
      4. W sekcji Well Area Setting wybrać liczbę obszarów w obrębie dołka, które mają zostać zobrazowane.
        Uwaga: 12 obszarów odpowiada obrazowi całego dołka.
      5. W sekcji Image Acquisition Settings wybrać czasy ekspozycji dla światła przechodzącego, 541 (GFP) i 713 (PI). Dla GFP zobrazować cały dołek z czasem ekspozycji 20 ms/obraz. Dla światła przechodzącego (TL) i fluorescencji PI pozyskać pojedynczy obraz centrum każdego dołka z czasami ekspozycji odpowiednio 8 i 20 ms.
      6. Potwierdzić określone ustawienia w sekcji Settings Information po prawej stronie i wybrać OK. Czas akwizycji dla obrazowania całej powierzchni każdego dołka (12 obrazów/dołek) płytki 96-dołkowej dla jednej długości fali wynosi ok. 15 min. Nacisnąć Read, aby rozpocząć obrazowanie.
        Uwaga: Czas akwizycji pojedynczego obrazu/dołka płytki 96-dołkowej dla jednej długości fali wynosi ok. 2,5 min/płytkę. Opisane powyżej parametry odpowiadają konkretnemu sprzętowi w naszym laboratorium. Pomiary spektrofluorometryczne: lampa błyskowa ksenonowa z długościami fal wzbudzenia w przyrostach 1,0 nm (250-850 nm) z regulowanym pasmem przepustowości 9 lub 15 nm, detektor w postaci fotopowielacza o zakresie dynamicznym > 6 log i regulowanym pasmem przepustowości emisji 15 lub 25 nm. Cytometr obrazujący: źródło światła oświetlającego zdolne do generowania białego światła oraz długości fal wzbudzenia 460 nm i 625 nm z pasmem przepustowości 20 nm, filtry emisyjne centrowane odpowiednio na 541 nm (pasmo przepustowości 108 nm) i 713 nm (pasmo przepustowości 123 nm) oraz obiektyw 4X sprzężony z 12-bitową kamerą CCD o rozdzielczości 1,25 megapiksela.

2. Analiza

Uwaga: W momencie przeprowadzania analizy konfluencja komórek musi wynosić 70-90%. Podczas etapów płukania medium należy usuwać i nanosić na ściankę boczną dołka (nie bezpośrednio na komórki). Należy utrzymać temperaturę LLO na poziomie < w temperaturze 4 ˚C, aby zapobiec jego agregacji aż do kroku 3.1.5.

  1. Przygotować roztwór zapasowy 30 µM PI w M1 oraz roztwór zapasowy 30 µM PI w M2, uprzednio podgrzany do 37 ˚C.
  2. Delikatnie wypłukać komórki na płytce 1, używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej i końcówek 200 µL, w następujący sposób:
    1. W przypadku warunków dopuszczających naprawę (repair-permissive), usunąć pożywkę wzrostową i wypłukać komórki dwukrotnie 200 µL/studzienkę M1 podgrzanego do 37 ˚C. Zastąpić pożywkę 100 µL/studzienkę ciepłego M1 zawierającego 30 µM PI.
    2. W przypadku warunków ograniczających naprawę (repair-restrictive), usunąć pożywkę wzrostową i wypłukać komórki raz 200 µL/studzienkę ciepłego M2 zawierającego 5 mM EGTA w celu chelatowania Ca2+, a następnie wypłukać raz 200 µL/studzienkę M2. Zastąpić pożywkę 100 µL/studzienkę ciepłego M2 zawierającego 30 µM PI.
    3. Po wypłukaniu pożywki wzrostowej i zastąpieniu jej pożywką zawierającą jodek propidyny, przejść bezpośrednio do kroku 2.1.3.
  3. Wykonać obrazowanie płytki 1 w świetle przechodzącym, GFP oraz PI zgodnie z opisem w punkcie 1.3.3 (przed kinetyką). Krok ten trwa 15-20 min.
  4. Podczas 15-minutowego okresu w kroku 2.1.3, przygotować płytkę 2, używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej i końcówek 200 µL w następujący sposób:
    1. Umieścić polipropylenową mikropłytkę 96-dołkową z okrągłym dnem na lodzie. Przygotować płytkę zgodnie z planem eksperymentalnym odpowiadającym płytce 1 (Rysunek 1).
    2. W przypadku warunków dopuszczających naprawę, dodać 100 µL/studzienkę lodowatego M1 zawierającego 60 µM PI, a następnie dodać 100 µL/studzienkę lodowatego M1 zawierającego 4x LLO lub pominąć ten krok w przypadku kontroli.
    3. W przypadku warunków ograniczających naprawę, dodać 100 µL/studzienkę lodowatego M2 zawierającego 60 µM PI, a następnie dodać 100 µL/studzienkę lodowatego M2 zawierającego 4x LLO lub pominąć ten krok w przypadku kontroli.
  5. Po obrazowaniu płytki 1 (krok 2.1.3), natychmiast umieścić ją na lodzie, używając folii aluminiowej, aby oddzielić płytkę od bezpośredniego kontaktu z lodem. Pozostawić płytkę 1 do schłodzenia na 5 min.
  6. Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej i końcówek 200 µL, przenieść 100 µL z każdej studzienki płytki 2 (krok 2.1.4) do odpowiadających im studzienek w płytce 1. Aby prawidłowo rozprowadzić toksynę w pożywkach płytki 1, wprowadzić końcówki poniżej menisku i delikatnie wypuścić objętość, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza.
    Uwaga: Nie pipetować w górę i w dół, ponieważ może to doprowadzić do przypadkowego odklejenia komórek.
  7. Pozostawić płytkę na dodatkową 1 min, aby toksyna mogła związać się z komórkami, a następnie natychmiast przenieść płytkę 1 do czytnika płytek w celu przeprowadzenia analizy kinetycznej w trybie spektrofluorometrycznym (krok 1.3.2).
  8. Po zakończeniu analizy kinetycznej, natychmiast wykonać obrazowanie płytki 1 (po kinetyce), stosując krok 1.3.3.

3. Analiza: Liczenie komórek

  1. Wyznaczyć liczbę komórek na podstawie fluorescencji jąder, korzystając z oprogramowania do zliczania komórek w mikropłytkach.
    1. W sekcji Settings wybrać Re-analysis, a następnie w kategorii w ramach Image Analysis Settings wybrać Discreet Object Analysis, ustawiając długość fali 541 nm dla wykrywania obiektów.
    2. W opcji Find Objects, korzystając z metody wyszukiwania Draw on Images, wybrać Nuclei w karcie ustawień i nacisnąć Apply.
    3. Nacisnąć OK oraz Read, aby uruchomić algorytm zliczania komórek.
  2. Alternatywnie, w przypadku braku takiego narzędzia, użyć oprogramowania do analizy obrazu, np. ImageJ, aby przeliczyć komórki.
    1. W programie ImageJ otworzyć plik obrazu jako stos (stack).
    2. Konwertować stos na 8-bitowe obrazy w skali szarości, klikając Image w pasku menu, najeżdżając na Type i wybierając 8-bit.
    3. Odjąć tło: kliknąć Image w pasku menu, najechać na Adjust i wybrać Brightness/Contrast. Dostosować wartość minimalną, aby usunąć szum tła, i wybrać Apply.
    4. Zastosować progowanie (threshold), aby utworzyć obrazy binarne: kliknąć Image w pasku menu, najechać na Adjust i wybrać Threshold. Wybrać Dark background, dostosować minimalną i maksymalną wartość progu, a następnie kliknąć Apply.
    5. W przypadku nakładających się jąder można użyć narzędzia Watershed do ich segmentacji. Kliknąć Process w menu, najechać na Binary i wybrać Watershed.
      Uwaga: spowoduje to automatyczne rozdzielenie połączonych jąder.
    6. Przeanalizować zamaskowane obrazy, stosując określone przez użytkownika kryteria (rozmiar i kolistość), aby doprecyzować identyfikację jąder i wykluczyć debris komórkowe.
      1. Kliknąć Analyze w menu, a następnie Analyze particles. Ustawić pożądane zakresy rozmiaru (pixel^2) i kolistości (wartość 1 oznacza idealne koło), które są wystarczające do uwzględnienia pojedynczych komórek/jąder.
      2. W rozwijanym polu Show wybrać żądane opcje, zaznaczyć Summarize i kliknąć OK, aby uzyskać liczbę komórek.

4. Analiza: Krzywe kinetyczne

  1. Przenieś dane kinetyczne z oprogramowania czytnika płytek do oprogramowania do analizy danych.
  2. Dla każdego warunku doświadczalnego oblicz średnią intensywność fluorescencji powtórzeń w każdym punkcie czasowym, wraz z odpowiadającym im odchyleniem standardowym i błędem standardowym średniej dla każdego warunku doświadczalnego.
  3. Dla każdego warunku doświadczalnego wykreśl odpowiednią krzywą kinetyczną: intensywność PI (oś y) w funkcji czasu (oś x).
  4. Aby obliczyć wydajność uszczelniania dla danego warunku traktowania, oblicz pole pod krzywą (AUC) dla +LLO w M1 (AUC(M1)) oraz +LLO w M2 (AUC(M2)). Zastosuj poniższe podejście w celu oceny wydajności (E) uszczelniania:
    Równanie obliczania wydajności przy użyciu stosunków pól pod krzywą, AUC(M1) i AUC(M2).
  5. Przeprowadź porównanie między kontrolą a traktowaniem testowym poprzez wyznaczenie współczynnika wydajności (REff) wskazanego poniżej:
    Równanie współczynnika efektywności do oceny grup testowych i kontrolnych, formuła matematyczna.
    REFF = 1, traktowanie testowe nie ma wpływu na naprawę
    REFF < 1, traktowanie testowe hamuje naprawę
    REFF > 1, traktowanie testowe poprawia naprawę
  6. Oblicz pole pod krzywą korzystając z następującego równania:
    Formuła AUC dla całkowania numerycznego w analizie danych; równowaga statyczna, równanie., gdzie k jest całkowitą liczbą pomiarów kontrolnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dokładność zliczania komórek: komórki HeLa są często wykorzystywane jako modelowa linia komórkowa ssaków do badania mechanizmów naprawy błony. Podczas oceny naprawy błony na poziomie populacji komórkowej ważne jest wysianie komórek w tym samym stężeniu we wszystkich dołkach w celu prawidłowej interpretacji danych. Równie ważne jest zweryfikowanie w czasie przeprowadzania analizy, czy liczba komórek w dołkach jest równoważna. W analizie tej wprowadzono komórki HeLa konstytutywnie ekspresyj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test ten mierzy skuteczność ponownego uszczelniania błony na poziomie populacji komórek przy wysokiej przepustowości. Może być używany do badań przesiewowych w poszukiwaniu składników komórkowych lub bibliotek leków, które mogą wpływać na naprawę błony. W opisanym teście wykorzystano format płytki 96-dołkowej, ale można go dostosować do płytek 384-dołkowych w celu uzyskania większej przepustowości. Zaletą tego testu jest jego zdolność do uzyskiwania pomiarów fluorescencji przylegających żywych komórek w czasie rzeczywist...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Jesse Kwiek (Uniwersytet Stanowy Ohio) za uprzejme umożliwienie nam korzystania z jego wielotrybowej platformy detekcyjnej do wstępnych eksperymentów. Badania opisane w tym artykule były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer RO1AI107250 dla Stephanie Seveau. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax i3xUrządzenia molekularnei3x
MiniMax 300Urządzenia molekularne5024062
TO-PRO-3ThermoFisher ScientificT3605
Jodek propidiumThermoFisher ScientificP3566
HeLaATCCCCL2
HeLa H2B-GFPMilliporeSCC117
Trypsin-EDTA 0,25%ThermoFisher Scientific25200056
96-dołkowa płytka do hodowli tkanki polistyrenowej Corning z płaskim dnemCorning3603
Zrównoważone sole HanksaSigma-AldrichH4891
EGTAISC BioExpress0732-100G
HEPESFisher ScientificBP310-500
D-(+)-Glukoza, HybriMaxSigma-AldrichG5146-1KG
Cytometr obrazujący

Bibliografia

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597(2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132(2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643(2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136(2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305(2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690(2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310(2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza wysokoprzepustowalisteriolizyna Ojodek propidynymikroskopia fluorescencyjnaczytnik mikropłytekliczenie komóreknaprawa błonyzależność od wapniaanaliza kinetyczna
Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.