Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

DOI:

10.3791/58351

⸱

7 stycznia 2019

 ,  , 
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W swoim fizjologicznym środowisku, komórki ssaków są często poddawane mechanicznym i biochemicznym obciążeniom, które skutkują uszkodzeniem błony plazmatycznej. W odpowiedzi na te uszkodzenia złożone mechanizmy molekularne szybko ponownie uszczelniają błonę plazmatyczną, aby przywrócić jej funkcję barierową i utrzymać przetrwanie komórek. Pomimo 60 lat badań w tej dziedzinie, nadal brakuje nam dogłębnej wiedzy na temat maszyn do ponownego zamykania komórek. W celu zidentyfikowania składników komórkowych, które kontrolują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej lub leków, które mogą poprawić ponowne uszczelnianie, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków hodowanych na mikropłytkach. Jako system modelowy do uszkodzenia błony komórkowej, komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory listeriolizyny O (LLO), która tworzy duże pory białkowe o średnicy 30-50 nm w błonach zawierających cholesterol. Zastosowanie wielotrybowego czytnika mikropłytek z kontrolowaną temperaturą pozwala na szybkie i czułe pomiary spektrofluorometryczne w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek za pomocą mikroskopii jasnego pola i fluorescencji. Analiza kinetyczna intensywności fluorescencji emitowanej przez nieprzepuszczalny dla błony fluorochrom wiążący kwas nukleinowy odzwierciedla zakres zranień i ponownego uszczelnienia błony na poziomie populacji komórek, co pozwala na obliczenie skuteczności ponownego uszczelniania komórek. Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym pozwala na zliczenie komórek, które konstytutywnie wyrażają fluorescencyjną chimerę białka jądrowego histonu 2B, w każdym dołku mikropłytki, aby uwzględnić potencjalne zmiany w ich liczbie i pozwala na ostateczną identyfikację odrębnych populacji komórek. Ten wysokoprzepustowy test jest potężnym narzędziem, które ma poszerzyć naszą wiedzę na temat mechanizmów naprawy błon poprzez badania przesiewowe w kierunku genów gospodarza lub egzogennie dodanych związków, które kontrolują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki ssaków są poddawane stresowi mechanicznemu, osmotycznemu i biochemicznemu, co skutkuje utratą integralności błony plazmatycznej. Bez szybkiego i skutecznego ponownego uszczelnienia uszkodzone komórki szybko uległyby zaprogramowanej lub martwiczej śmierci. Od lat sześćdziesiątych XX wieku wysiłki zmierzające do zrozumienia procesu ponownego uszczelniania błony komórkowej były motywowane niszczycielskimi konsekwencjami związanymi z jej dysfunkcjami. Rzeczywiście, choroby takie jak dystrofia mięśniowa obręczowo-kończynowa, cukrzyca i zespół Chediaka-Higashiego zostały powiązane z niedostateczną naprawą błony plazmatycznej z powodu mutacji w genie kodującym dysferlinę, produkcji zaawansowanych produktów końcowych glikacji i defektów w lizosomalnym regulatorze transportu CHS1, odpowiednio1,2,3,4,5,6. Jednak do tej pory nasza wiedza na temat ponownego uszczelniania membran jest nadal ograniczona7. Wstępne badania wykazały, że ponowne uszczelnienie błony jest inicjowane przez napływ zewnątrzkomórkowego Ca2+ przez uszkodzoną błonę plazmatyczną8,9,10. Od tego czasu zaproponowano kilka wzajemnie wykluczających się mechanizmów zależnych odCa2+ w celu ponownego uszczelnienia komórek. Hipoteza łatki zakłada, że w pobliżu rany pęcherzyki wewnątrzkomórkowe łączą się ze sobą i z uszkodzoną błoną plazmatyczną, działając jak łata11,12,13,14. Drugi model sugeruje, że zależna od wapnia egzocytoza lizosomów w miejscu rany uwalnia enzym lizosomalny kwas sfingomielinazę, który przekształca sfingomielinę w ceramid w zewnętrznej płatku błony komórkowej. Ta nagła zmiana składu lipidów powoduje endocytozę uszkodzonego regionu wywołaną ceramidami15,16,17. Wreszcie, trzeci proponowany mechanizm obejmuje rolę endosomalnego kompleksu sortującego wymaganego do transportu (ESCRT) w promowaniu tworzenia pęcherzyków skierowanych na zewnątrz, które wyrastają z błony komórkowej18. W tych modelach zidentyfikowano tylko ograniczony zestaw białek, a ich mechanizm musi zostać dokładniej wyjaśniony.

Tutaj opisujemy test o wysokiej przepustowości, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej w przylegających komórkach ssaków poddanych uszkodzeniu, w którym pośredniczy rekombinowana listeriolizyna O (LLO)19. LLO jest toksyną tworzącą pory (PFT) wydzielaną przez fakultatywny wewnątrzkomórkowy patogen Listeria monocytogenes20,21,22 i należy do nadrodziny MACPF/CDC (kompleks ataku błonowego, perforyna i cytolizyna zależna od cholesterolu). MACPF to białka tworzące pory ssaków zaangażowane w obronę immunologiczną, podczas gdy CDC to toksyny bakteryjne wytwarzane głównie przez patogeny Gram-dodatnie, które uszkadzają komórki gospodarza, promując ich patogenny styl życia23. CDC są syntetyzowane jako rozpuszczalne w wodzie monomery lub dimery, które wiążą się z cholesterolem obecnym w błonie komórkowej i oligomeryzują się w kompleks preporowy do 50 podjednostek. Kompleks prepore następnie przestawia się, aby wprowadzić β-nici w poprzek dwuwarstwy lipidowej, tworząc β-beczkowy por o średnicy 30-50 nm24,25,26,27. Te duże pory umożliwiają strumienie jonów i małych składników komórkowych do i z komórki; Jednak niektóre badania sugerują, że powstają również pory o mniejszych rozmiarach28,29,30. Wśród CDC LLO wykazuje unikalne właściwości, w tym nieodwracalną agregację zależną od pH i temperatury, co sprzyja analizom o wysokiej przepustowości31,32. LLO można dodać do pożywki do hodowli komórkowej w temperaturze 4 °C, która pozwala na jego wiązanie z komórkami, ale nie na tworzenie kompleksu porów. Inicjacja tworzenia porów może być następnie zsynchronizowana poprzez podniesienie temperatury do 37 °C, co pozwala na efektywną dyfuzję cząsteczek toksyn w płaszczyźnie błony w celu utworzenia oligomerów i przebudowę konformacyjną zaangażowaną w tworzenie porów. Dlatego po zmianie temperatury kinetyka uszkodzenia komórek będzie zależeć od ilości toksyny związanej z błoną plazmatyczną. Co ważne, rozpuszczalny LLO (niezwiązany z błoną plazmatyczną) szybko i nieodwracalnie agreguje się, gdy temperatura osiągnie 37 °C, co łagodzi konieczność wypłukiwania niezwiązanych cząsteczek toksyny i ogranicza zakres uszkodzeń błony w czasie. Wreszcie, ponieważ LLO wiąże się z cholesterolem i tworzy pory w błonach bogatych w cholesterol, test ten jest podatny na szeroki zakres komórek ssaków. Ważne jest, aby pamiętać, że LLO wpływa na sygnalizację komórkową gospodarza głównie poprzez tworzenie porów, z kilkoma wyjątkami, w których może wystąpić sygnalizacja komórkowa niezależna od porów33,34,35,36,37,38,39. Dlatego nie można wykluczyć, że aktywność sygnalizacyjna LLO może wpływać na proces naprawy błony.

Ten test bezpośrednio ocenia stopień zranienia komórek, mierząc inkorporację nieprzeznaczonego dla komórki fluorochromu (np. jodku propidyny), który pasywnie wnika do uszkodzonych komórek i staje się wysoce fluorescencyjny, gdy połączy się z kwasami nukleinowymi. W związku z tym fluorochrom może być utrzymywany w pożywce do hodowli komórkowych przez cały czas trwania eksperymentu, co pozwala na analizę zranień komórek w czasie rzeczywistym. Intensywność fluorescencji barwnika wiążącego kwas nukleinowy będzie rosła wraz ze stężeniem toksyny i dla danego stężenia toksyny będzie rosła z czasem, aż uformują się wszystkie pory, a komórki zostaną w pełni naprawione lub do osiągnięcia nasycenia. Napływ zewnątrzkomórkowego Ca2 + przez pory błonowe jest warunkiem sine qua non ponownego uszczelnienia. W związku z tym skuteczność ponownego zamykania można pośrednio udowodnić, porównując zranienie komórek w pożywce hodowlanej zawierającej Ca2+ (warunek dopuszczający naprawę) z nawinięciem w pożywce wolnej od Ca2+ (warunek ograniczający naprawę). Ponieważ intensywność fluorescencji barwnika wiążącego kwas nukleinowy jest wprost proporcjonalna do stężenia komórek w każdym dołku, ważne jest, aby zasiać komórki w tym samym stężeniu we wszystkich studzienkach. Ważne jest również, aby zliczyć komórki w każdym dołku przed i po teście, aby upewnić się, że nie dojdzie do oderwania komórek, ponieważ unoszące się, zagregowane komórki mogą zaciemniać odczyty fluorescencji, co może skomplikować interpretację danych. Aby zliczyć komórki, w tym teście użyto komórek wyrażających histon zlokalizowany jądrowo 2B-GFP (H2B-GFP). Wielomodowe czytniki mikropłytek z kontrolowaną temperaturą łączą szybkie, wysokoprzepustowe pomiary intensywności fluorescencji (przy użyciu płytki 96- lub 384-dołkowej) z obrazowaniem mikroskopowym żywych komórek w temperaturze 37 °C. Te ostatnie mogą być używane do wyliczania liczby komórek i obserwowania ostatecznego tworzenia się odrębnych populacji komórek.

Ostatecznie, ten test daje użytkownikom możliwość poszerzenia swojej wiedzy na temat złożoności mechanizmów naprawy błony poprzez badania przesiewowe w poszukiwaniu cząsteczek gospodarza lub egzogennie dodanych związków, które mogą kontrolować naprawę błony. Poniższy protokół opisuje etapy eksperymentalne mające na celu zmierzenie skuteczności ponownego uszczelniania komórek wystawionych na działanie LLO i ocenę wpływu danego leku lub leczenia komórkowego na skuteczność ponownego uszczelniania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. Poszycie komórkowe
    Uwaga: W tym protokole użyto ludzkich komórek nabłonka szyjki macicy, HeLa i HeLa wyrażających histon 2B-GFP (H2B-GFP), ale ten test można dostosować do innych komórek ssaków19.
    1. Odłącz przylegające komórki od kolby hodowlanej o średnicy 75cm2, przemłukując komórki 2 ml trypsyny-EDTA 0,25%. Zastąp zużytą trypsynę 2 ml świeżej trypsyny-EDTA 0,25%.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aż komórki zaokrąglą się i odłączą od kolby.
    3. Ponownie zawiesić komórki w 8 ml pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).
    4. Oznaczyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru i 10 μl zawiesiny komórek.
    5. Rozcieńczyć komórki w pożywce wzrostowej do stężenia 2,5 x 105 komórek/ml.
    6. Wlać zawiesinę komórek do sterylnej miski na pipety i dokładnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
    7. Za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek o pojemności 200 μl rozprowadź komórki HeLa (2,5 x 104 komórek/100 μl/dołek) w trzech (lub poczwórnych) na 96-dołkowej płaskiej, przezroczystej płytce z czarnym polistyrenem poddanym kulturze tkankowej, z 96 dołkami.
      Uwaga: Układ poszycia jest przedstawiony jako przykład w Rysunek 1.
    8. Hodować komórki przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Przygotowanie roztworu podstawowego
    1. Przygotuj 1 l 10-krotnego zapasu buforu M (używanego do przygotowania M1 i M2), dodając 95 g zbilansowanego roztworu soli Hanksa, 0,476 g MgCl2 (5 mM) i 23,83 g HEPES (100 mM) do 900 ml wody. Dostosuj pH do 7,4 i zwiększ objętość do 1 l. Sterylizuj filtr.
    2. Przygotuj 50 ml 50-krotnego (1,25 M) zapasu glukozy, dodając 11,26 g D-(+)-glukozy do łącznie 50 ml wody. Filtruj wysterylizuj roztwór.
    3. Przygotuj 50 ml 100-krotnego (120 mM) zapasu wapnia, dodając 0,666 g CaCl2 do łącznie 50 ml wody. Filtruj wysterylizuj roztwór.
    4. Przygotować 50 ml 10x (50 mM) zapasu glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N',kwasu tetraoctowego (EGTA), dodając 0,951 g EGTA do 40 ml wody. Zwiększ pH do 8 za pomocą NaOH w celu rozpuszczenia EGTA, a następnie zwiększ objętość do 50 ml. Filtruj wysterylizuj roztwór.
    5. Na pojedynczą 96-dołkową płytkę przygotuj 50 ml pożywki 1 (M1, zawiera Ca2+), 50 ml pożywki 2 (M2, Ca2+-free) i 15 ml pożywki 2 uzupełnionej EGTA, odpowiednio:
      1. W przypadku M1 dodaj 5 ml 10x buforu M, 0,5 ml 100x CaCl2 i 1 ml 50x glukozy do 43,5 ml wody.
      2. W przypadku M2 dodaj 5 ml 10x buforu M i 1 ml 50x glukozy do 44 ml wody.
      3. W przypadku M2/EGTA dodać 1,5 ml 10x buforu M i 1,5 ml 10x EGTA do 12 ml wody.
        Uwaga: Wszystkie roztwory zawierające jodek propidyny (PI) należy przygotować bezpośrednio przed dodaniem do komórek.
  3. Ustawienia czytnika płytek/cytometru obrazowego
    Uwaga: Należy użyć wielotrybowego czytnika płytek wyposażonego w dwie jednostki detekcyjne: spektrofluorometr i cytometr obrazowy. Ogranicz ekspozycję na fluorescencję, aby uniknąć fotowybielania fluoroforów.
    1. Przed wykonaniem testu należy wstępnie ogrzać czytnik płytek do temperatury 37 °C.
    2. Ustaw odpowiednio parametry testu kinetycznego w trybie ustawień:
      1. Wybierz Monochromator, FL (fluorescencja) i Kinetyczny odpowiednio dla konfiguracji optycznej, trybów odczytu i typu odczytu.
      2. W obszarze Wavelength Settings (Ustawienia długości fali) wybierz odpowiednio pasmo wzbudzenia i emisji 9 i 15 nm. W przypadku testów z użyciem jodku propydu (PI) należy ustawić długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 535 i 617 nm.
      3. W obszarze Typ płyty wybierz 96 dołków dla formatu płyty i wstępnie ustawioną konfigurację płyty odpowiadającą przezroczystej płycie dolnej o czarnych ściankach.
      4. W obszarze Obszar odczytu zaznacz studnie, które będą analizowane w całym obszarze kinetycznym.
      5. W obszarze PMT i optyka ustaw błyski na odczyt na 6 i zaznacz pole Czytaj od dołu.
      6. W obszarze Chronometraż wstaw 00:30:00 w polu Całkowity czas wykonywania dla 30-minutowego testu kinetycznego i wstaw 00:05:00 dla Interwału.
        Uwaga: Dla każdego punktu czasowego i jednej długości fali czas odczytu pełnej płytki 96-dołkowej wynosi 30 s.
      7. Potwierdź określone ustawienia w informacjach o ustawieniach po prawej stronie i wybierz przycisk OK. Naciśnij przycisk Czytaj, aby rozpocząć bieg kinetyczny.
    3. Ustaw odpowiednio parametry obrazowania w trybie ustawień:
      1. Wybierz Minimax, Imaging i Endpoint odpowiednio dla konfiguracji optycznej, trybów odczytu i typu odczytu.
      2. W obszarze Długości fal wybierz światło przechodzące oraz jedno lub oba pola fluorescencji odpowiadające długościom fal wzbudzenia i emisji 456/541 nm (GFP) i 625/713 nm (PI).
      3. Użyj tych samych opcji dla Typu płyty i Obszaru odczytu, jak zdefiniowano w krokach 1.3.2.3 i 1.3.2.4.
      4. W polu Ustawienie obszaru studni wybierz liczbę miejsc w studni, które mają zostać zobrazowane.
        Uwaga: 12 miejsc odpowiada obrazowi z pełną studnią.
      5. W obszarze Image Acquisition Settings (Ustawienia akwizycji obrazu) wybierz czasy ekspozycji dla światła przechodzącego, 541 (GFP) i 713 (PI). W przypadku GFP należy zobrazować całą studnię z czasem naświetlania 20 ms/obraz. W przypadku fluorescencji światła przechodzącego (TL) i PI należy uzyskać pojedynczy obraz środka każdej studzienki z czasami naświetlania wynoszącymi odpowiednio 8 i 20 ms.
      6. Potwierdź określone ustawienia w informacjach o ustawieniach po prawej stronie i wybierz przycisk OK. Czas akwizycji dla zobrazowania całej powierzchni każdego dołka (12 obrazów/dołek) płytki 96-dołkowej i dla jednej długości fali wynosi ~15 min. Naciśnij przycisk Czytaj, aby rozpocząć obrazowanie.
        Uwaga: Czas akwizycji pojedynczego obrazu/dołka z 96-dołkowej płytki wymaga ~2,5 min/płytkę dla jednej długości fali. Opisane powyżej parametry odpowiadają konkretnemu sprzętowi w naszym laboratorium. Pomiary spektrofluorometryczne: Ksenonowa lampa błyskowa wyświetlająca długość fali wzbudzenia z przyrostem 1,0 nm (250-850 nm) z regulowanym pasmem przepustowym 9 lub 15 nm, detektor lampy fotopowielacza o zakresie dynamiki > 6 log i regulowanym pasmie przepustowym emisji 15 lub 25 nm. Cytometr obrazujący: Źródło światła podświetlającego zdolne do światła białego, długości fal wzbudzenia 460 nm i 625 nm z pasmem przepustowym 20 nm, filtrami emisyjnymi wyśrodkowanymi odpowiednio na 541 nm (pasmo przepustowe 108 nm) i 713 nm (pasmo przepustowe 123 nm) oraz obiektyw 4X sprzężony z 1,25-megapikselową 12-bitową kamerą urządzenia sprzężoną z ładunkiem.

2. Test

Uwaga: W czasie testu komórki muszą być zlewane w 70-90%. Podczas etapów mycia podłoże należy usunąć i nałożyć na boczną ścianę studzienki (nie bezpośrednio nad komórkami). Utrzymać temperaturę LLO na poziomie < 4 °C, aby zapobiec jego agregacji do etapu 3.1.5.

  1. Przygotować zapas 30 μM PI w M1 i zapas 30 μM PI w M2 wstępnie ogrzany w temperaturze 37 °C.
  2. Delikatnie umyj komórki na płytce 1 za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek o pojemności 200 μl, w następujący sposób:
    1. W przypadku warunków permisywnych należy usunąć pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki 200 μl/studzienkę M1 wstępnie podgrzaną w temperaturze 37 °C. Zastąp pożywkę 100 μl/studzienkę ciepłego M1 zawierającego 30 μM PI.
    2. W celu naprawy warunków restrykcyjnych należy usunąć pożywkę wzrostową i przemyć komórki raz 200 μl / dobrze ogrzany M2 zawierający 5 mM EGTA w celu chelatowania Ca2+, a następnie jedno przemycie 200 μl / basenik M2. Zastąp pożywkę 100 μl/dobrze ciepły M2 zawierający 30 μM PI.
    3. Po umyciu pożywki wzrostowej i zastąpieniu jej pożywką zawierającą jodek propidyny, należy bezpośrednio przejść do kroku 2.1.3.
  3. Płyta obrazowa 1 w świetle przechodzącym, GFP i PI, jak opisano w 1.3.3 (prekinetyczny). Ten krok zajmuje 15-20 minut.
  4. W ciągu 15 minut, o których mowa w kroku 2.1.3, przygotować płytkę 2 za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek o pojemności 200 μl w następujący sposób:
    1. Umieść 96-dołkową mikropłytkę polipropylenową z okrągłym dnem na lodzie. Skonfiguruj płytkę, korzystając z eksperymentalnego projektu odpowiadającego tablicy 1 (Rysunek 1).
    2. W przypadku warunków dopuszczających naprawę dodać 100 μl/studzienkę lodowatego M1 zawierającego 60 μM PI, a następnie dodać 100 μl/studzienkę lodowatego M1 zawierającego 4x LLO lub nie dla kontroli.
    3. W przypadku warunków ograniczających naprawę, dodać 100 μl/basenik lodowatego M2 zawierającego 60 μM PI, a następnie dodać 100 μl/studzienkę lodowatego M2 zawierającego 4x LLO lub nie do kontroli.
  5. Po zobrazowaniu płytki 1 (krok 2.1.3) natychmiast umieść ją na lodzie, używając folii aluminiowej w celu oddzielenia płytki od bezpośredniego kontaktu z lodem. Pozostaw płytkę 1 do ostygnięcia przez 5 minut.
  6. Za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek o pojemności 200 μl przenieść 100 μl z każdej studzienki na płytkę 2 (etap 2.1.4) do odpowiednich studzienek w płytce 1. Aby prawidłowo rozprowadzić toksynę w pożywce płytki 1, włóż końcówki poniżej łąkotki i delikatnie wysuń objętość bez wprowadzania pęcherzyków.
    Uwaga: Nie należy pipetować w górę i w dół, ponieważ może to spowodować przypadkowe odłączenie komórek.
  7. Pozostawić płytkę na dodatkową 1 minutę, aby toksyna mogła związać się z komórkami i natychmiast przenieść płytkę 1 do czytnika płytek w celu przeprowadzenia testu kinetycznego w trybie spektrofluorometru (krok 1.3.2).
  8. Na zakończenie testu kinetycznego natychmiast należy naświetlić płytkę 1 (postkinetyczną), wykonując krok 1.3.3.

3. Analiza: Wyliczanie komórek

  1. Określ liczbę komórek na podstawie fluorescencji jądrowej za pomocą oprogramowania do liczenia komórek na mikropłytkach.
    1. W obszarze Ustawienia wybierz opcję Ponowna analiza, a następnie w sekcji kategorii w obszarze Ustawienia analizy obrazu wybierz opcję Dyskretna analiza obiektów przy użyciu długości fali 541 do znajdowania obiektów.
    2. W opcji Znajdź obiekty, korzystając z metody wyszukiwania Rysuj na obrazach, wybierz Jądra na karcie ustawień i naciśnij Zastosuj.
    3. Naciśnij OK i odczyt, aby zainicjować algorytm zliczania komórek.
  2. Alternatywnie, jeśli takie narzędzie nie jest dostępne, użyj oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, aby zliczyć komórki.
    1. W ImageJ otwórz plik obrazu jako stos.
    2. Przekonwertuj stos na 8-bitowe obrazy w skali szarości, klikając Obraz na pasku menu, najedź kursorem na Typ i wybierz opcję 8-bitowy.
    3. Odejmowanie tła: Kliknij w Obraz na pasku menu, najedź kursorem na Dostosuj i wybierz Jasność/Kontrast. Dostosuj wartość minimalną, aby usunąć szum tła, a następnie wybierz pozycję Zastosuj.
    4. Próg, aby utworzyć obrazy binarne: Kliknij Obraz na pasku menu, najedź kursorem na Dostosuj i wybierz Próg. Wybierz opcję Ciemne tło, dostosuj minimalne i maksymalne wartości progowe, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.
    5. W przypadku nakładających się jąder do segmentacji jąder można użyć narzędzia Watershed. Kliknij Process w menu, najedź kursorem na Binary i wybierz Watershed.
      Uwaga: Spowoduje to automatyczne rozdzielenie połączonych jąder.
    6. Analizuj zamaskowane obrazy, stosując kryteria określone przez użytkownika (rozmiar i okrągłość), aby udoskonalić identyfikację jąder i wykluczyć szczątki komórek.
      1. Kliknij Analizuj w menu, a następnie Analizuj cząstki. Ustaw żądany rozmiar (piksel^2) i okrągłość (wartość 1 to idealne koło), które są wystarczające, aby objąć poszczególne komórki/jądra.
      2. W polu rozwijanym Pokaż wybierz żądane opcje, zaznacz opcję Podsumuj i kliknij przycisk OK, aby uzyskać liczbę komórek.

4. Analiza: Krzywe kinetyczne

  1. Przenieś dane kinetyczne z oprogramowania czytnika płytek do oprogramowania analitycznego.
  2. Dla każdego warunku doświadczalnego należy uśrednić intensywność fluorescencji kontrprób w każdym punkcie czasowym, wraz z odpowiadającym im odchyleniem standardowym i błędem standardowym średniej dla każdego warunku doświadczalnego.
  3. Dla każdego warunku eksperymentalnego prześledź odpowiednią krzywą kinetyczną: intensywność PI (oś y) w funkcji czasu (oś x).
  4. Aby obliczyć skuteczność ponownego zamykania w danym warunku obróbki, należy obliczyć powierzchnię pod krzywą (AUC) +LLO w M1 (AUC(M1)) i +LLO w M2 (AUC(M2)). Zastosuj podejście sugerowane poniżej, aby ocenić skuteczność (E) ponownego uszczelniania:
    figure-protocol-1
  5. Przeprowadzić porównanie między kontrolą a badaniem poprzez określenie współczynnika skuteczności (REff) wskazanego poniżej:
    figure-protocol-2
    REFF = 1, badane leczenie nie ma wpływu na naprawę
    REFF < 1, testowe leczenie hamuje naprawę
    REFF > 1, leczenie testowe poprawia naprawę
  6. Oblicz pole pod krzywą, korzystając z następującego równania:
    figure-protocol-3, gdzie k oznacza całkowitą liczbę działań następczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładność zliczania komórek: Komórki HeLa są często używane jako modelowa linia komórkowa ssaków do badania mechanizmów naprawy błony. Podczas oceny naprawy błony na poziomie populacji komórek ważne jest, aby komórki miały to samo stężenie we wszystkich studzienkach w celu prawidłowej interpretacji danych. Ważne jest również, aby w czasie testu sprawdzić, czy liczba komórek jest równoważna we wszystkich studzienkach. Komórki HeLa, które konstytutywnie wyrażają histon 2B połączony z GFP (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test ten mierzy skuteczność ponownego uszczelniania błony na poziomie populacji komórek przy wysokiej przepustowości. Może być używany do badań przesiewowych w poszukiwaniu składników komórkowych lub bibliotek leków, które mogą wpływać na naprawę błony. W opisanym teście wykorzystano format płytki 96-dołkowej, ale można go dostosować do płytek 384-dołkowych w celu uzyskania większej przepustowości. Zaletą tego testu jest jego zdolność do uzyskiwania pomiarów fluorescencji przylegających żywych komórek w czasie rzeczywist...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Jesse Kwiek (Uniwersytet Stanowy Ohio) za uprzejme umożliwienie nam korzystania z jego wielotrybowej platformy detekcyjnej do wstępnych eksperymentów. Badania opisane w tym artykule były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer RO1AI107250 dla Stephanie Seveau. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax i3xUrządzenia molekularnei3x
MiniMax 300Urządzenia molekularne5024062
TO-PRO-3ThermoFisher ScientificT3605
Jodek propidiumThermoFisher ScientificP3566
HeLaATCCCCL2
HeLa H2B-GFPMilliporeSCC117
Trypsin-EDTA 0,25%ThermoFisher Scientific25200056
96-dołkowa płytka do hodowli tkanki polistyrenowej Corning z płaskim dnemCorning3603
Zrównoważone sole HanksaSigma-AldrichH4891
EGTAISC BioExpress0732-100G
HEPESFisher ScientificBP310-500
D-(+)-Glukoza, HybriMaxSigma-AldrichG5146-1KG
Cytometr obrazujący

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597(2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132(2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643(2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136(2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305(2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690(2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310(2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza wysokoprzepustowalisteriolizyna Ojodek propidynymikroskopia fluorescencyjnaczytnik mikrop ytekliczenie kom reknaprawa b onyzale no od wapniaanaliza kinetyczna

Powiązane artykuły