Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58355

⸱

17 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Streszczenie

Analiza interakcji komórka-komórka lub komórka-patogen in vivo jest ważnym narzędziem do zrozumienia dynamiki odpowiedzi immunologicznej na infekcję. Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna (2P-IVM) umożliwia obserwację interakcji komórkowych w głębokich tkankach u żywych zwierząt, przy jednoczesnej minimalizacji fotowybielania powstającego podczas akwizycji obrazu. Do tej pory opisano różne modele 2P-IVM narządów limfoidalnych i nielimfatycznych. Jednak obrazowanie narządów oddechowych pozostaje wyzwaniem ze względu na ruch związany z cyklem oddechowym zwierzęcia.

Tutaj opisujemy protokół do wizualizacji in vivo interakcji komórek odpornościowych w tchawicy myszy zakażonych wirusem grypy za pomocą 2P-IVM. W tym celu opracowaliśmy niestandardową platformę obrazowania, która obejmowała chirurgiczne naświetlenie i intubację tchawicy, a następnie akwizycję dynamicznych obrazów neutrofili i komórek dendrytycznych (DC) w nabłonku błony śluzowej. Dodatkowo szczegółowo opisaliśmy kroki potrzebne do przeprowadzenia infekcji donosowej grypy i analizy cytometrycznej przepływowej komórek odpornościowych w tchawicy. Na koniec przeanalizowaliśmy ruchliwość neutrofili i DC, a także ich interakcje w trakcie trwania filmu. Protokół ten pozwala na generowanie stabilnych i jasnych obrazów 4D niezbędnych do oceny interakcji komórka-komórka w tchawicy.

Wprowadzenie

Mikroskopia dwufotonowa (2P-IVM) jest skuteczną techniką obrazowania w czasie rzeczywistym interakcji międzykomórkowych zachodzących w ich naturalnym środowisku1. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że umożliwia ona badanie procesów komórkowych na większej głębokości próbki (od 500 μm do 1 mm) w porównaniu z innymi tradycyjnymi technikami obrazowania2. Jednocześnie, zastosowanie dwóch niskoenergetycznych fotonów generowanych przez laser dwufotonowy minimalizuje fotouszkodzenia tkanek zwykle związane z procesem akwizycji obrazu2. W ciągu ostatniej dekady 2P-IVM został zastosowany do badania różnych typów interakcji komórka-komórka w kilku dyscyplinach3,4,5. Badania te były szczególnie istotne dla zbadania komórek odpornościowych, które charakteryzują się wysoką dynamiką i tworzeniem wyraźnych kontaktów podążających za sygnałami generowanymi przez inne komórki i środowisko. 2P-IVM został również zastosowany do badania interakcji między patogenem a host6. Rzeczywiście, wykazano wcześniej, że niektóre patogeny mogą zmieniać rodzaj i czas trwania kontaktów między komórkami odpornościowymi, utrudniając w rezultacie odpowiedź immunologiczną7.

Błona śluzowa dróg oddechowych jest pierwszym miejscem, w którym generowana jest odpowiedź immunologiczna przeciwko patogenom przenoszonym drogą powietrzną8. Dlatego analiza in vivo interakcji patogen-gospodarz w tej tkance ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia inicjacji mechanizmów obronnych gospodarza podczas infekcji. Jednak 2P-IVM dróg oddechowych jest wyzwaniem głównie ze względu na artefakty wytwarzane przez cykl oddychania zwierzęcia, co utrudnia proces pozyskiwania obrazu. Ostatnio opisano różne modele chirurgiczne do obrazowania mysiej tchawicy9,10,11,12 i płuca13,14,15,16. Modele 2P-IVM tchawicy stanowią doskonały zestaw do wizualizacji początkowej fazy reakcji immunologicznej w górnych drogach oddechowych, podczas gdy modele 2P-IVM pęcherzyków płucnych są bardziej odpowiednie do badania późnej fazy infekcji. Opracowane modele płuc wykazują ograniczenie związane z obecnością pęcherzyków płucnych wypełnionych powietrzem, które ograniczają penetrację optyczną lasera i sprawiają, że warstwa śluzówkowa wewnątrzpłucnych dróg oddechowych jest niedostępna dla obrazowania in vivo17. I odwrotnie, struktura tchawicy, utworzona przez ciągły nabłonek, ułatwia akwizycję obrazu.

Tutaj prezentujemy protokół, który zawiera szczegółowy opis kroków wymaganych do przeprowadzenia infekcji grypą, przygotowania chirurgicznego zwierząt i 2P-IVM tchawicy. Ponadto opisujemy specyficzny zestaw eksperymentalny do wizualizacji neutrofili i komórek dendrytycznych (DC), dwóch typów komórek odpornościowych, które odgrywają ważną rolę jako mediatory mechanizmu obronnego przed wirusem grypy18,19. Na koniec opisujemy procedurę analizy oddziaływań neutrofili-DC. Wykazano, że kontakty te modulują aktywację prądu stałego, a następnie wpływają na odpowiedź immunologiczną przeciwko patogenom20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach z udziałem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Szwajcarskiego Federalnego Biura Weterynaryjnego, a protokoły na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalne władze weterynaryjne.

1. Zakażenie grypą myszy CD11c-YFP

  1. Bezpieczeństwo biologiczne
    UWAGA: Zmodyfikowany przez myszy szczep wirusa grypy A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) został wyhodowany w zapłodnionych jajach, oczyszczonych i miareczkowanych zgodnie z wcześniejszym opisem21. Wszystkie etapy z udziałem zakażonych zwierząt lub próbek biologicznych zostały przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z warunkami poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2.
    1. Wyczyść komorę bezpieczeństwa biologicznego 70% roztworem etanolu przed i po zabiegu infekcji.
    2. Wyrzuć wszystkie odpady powstałe podczas tej procedury, postępując zgodnie z odpowiednimi wytycznymi WHO dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Wyrzuć odpady stałe do pojemników nadających się do sterylizacji w autoklawie, a zanieczyszczone płyny do plastikowych worków wypełnionych 70% roztworem etanolu lub medycznym środkiem dezynfekującym.
  2. Zakażenie donosowe grypy
    UWAGA: B6. W tym badaniu użyto Cg-Tg(Itgax-Venus)1Mnz/J (CD11c-YFP)22 na tle C57BL/6J. Myszy utrzymywano w specyficznym ośrodku wolnym od patogenów w Instytucie Badań Biomedycznych.
    1. Umieść maksymalnie 5 dopasowanych wiekowo i płciowo (od sześciu do ośmiu tygodni) myszy CD11c-YFP w klatce. Przed zabiegiem zakażenia należy odczekać co najmniej dwa dni, aż myszy zaaklimatyzują się do warunków inwentarskich.
    2. Rozmrozić wywar PR8 i przygotować odpowiednie rozcieńczenie, używając na zimno 1x bufor fosforanowy Dulbecco z solą fizjologiczną modyfikowaną bez chlorku wapnia i chlorku magnezu (PBS) w celu uzyskania końcowego stężenia 200 jednostek tworzących płytkę miażdżycową (PFU) w 30 μl. Utrzymuj rozcieńczenie wirusa na lodzie podczas całej procedury.
      UWAGA: Zaleca się miareczkowanie każdej partii wirusa grypy przed jego użyciem w celu zapewnienia precyzyjnej dawki infekcji.
    3. Dawkę ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) wstrzyknąć dootrzewnowo (i.p.) za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 26 G.
    4. Poczekaj, aż mysz zostanie w pełni znieczulona (całkowita utrata odruchu zarówno prostowania, jak i odruchu wycofania pedału). Głębokie znieczulenie jest niezbędne do optymalnej infekcji, ponieważ nie w pełni znieczulone myszy połkną lub wydalą inokulum wirusa, co prowadzi do zmian w dawce infekcji.
    5. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej. Zebrać 15 μl inokulum wirusa. Umieść końcówkę pipety blisko lewego nozdrza myszy i dozuj inokulum wirusowe kropla po kropli. Ponieważ krople muszą być wdychane, nie należy pipetować ich bezpośrednio do jamy nosowej.
    6. Odczekaj 2–5 minut i umieść końcówkę pipety zawierającą pozostałe 15 μl inokulum wirusa w prawym nozdrzu.
      UWAGA: Aby uniknąć uduszenia, dozuj małe krople w odstępach około 20 sekund.
    7. Sprawdź, czy mysz prawidłowo oddycha i umieść ją w klatce w bocznym odleżynie. Monitoruj oddychanie myszy i powrót do zdrowia po znieczuleniu (około 60 minut po indukcji).
      UWAGA: Możliwe jest zainfekowanie więcej niż 1 myszy w tym samym czasie. W takim przypadku należy podać inokulum wirusa w lewe nozdrze wszystkich myszy w sekwencji, odczekać 2–5 minut, a następnie podać wirusa do prawego nozdrza. Aby uniknąć zmienności między osobnikami, zarażaj nie więcej niż 3 myszy w tym samym czasie.
    8. Codziennie monitoruj stan zdrowia zwierząt i utratę wagi.
    9. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z humanitarnym punktem końcowym określonym przez wytyczne władz. Metoda eutanazji musi zostać zatwierdzona przez organy doświadczalne na zwierzętach i musi być zgodna z lokalnymi przepisami etycznymi. Po eksperymentach z użyciem dwóch fotonów należy poddać myszy eutanazji poprzez podanie przedawkowania ketaminy/ksylazyny, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. We wszystkich innych eksperymentach należy stosować inhalację CO2 jako metodę eutanazji.
      UWAGA: Aby zmierzyć miana wirusa w zakażonej tchawicy, można przeprowadzić test 50% dawki infekcyjnej w kulturze tkankowej (TCID50) lub test reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR), jak opisano wcześniej23.
  3. Ocena rekrutacji neutrofili w tchawicy metodą cytometrii przepływowej
    UWAGA: Ta część protokołu jest opcjonalna. Ma na celu ocenę rekrutacji neutrofili w błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu grypą.
    1. Poddaj eutanazji zakażone i niezakażone myszy kontrolne w 3 dniu po zakażeniu (PI) przez wdychanie CO2.
      UWAGA: Aby zapobiec uszkodzeniom tchawicy, należy unikać stosowania zwichnięcia szyjki macicy do eutanazji zwierząt. Dodatkowo zaleca się perfuzję myszy poddanych eutanazji, aby uniknąć zanieczyszczenia neutrofilami krwi.
    2. Spryskaj szyję myszy 70% roztworem etanolu i wykonaj nacięcie skóry nożyczkami chirurgicznymi od klatki piersiowej do podbródka.
    3. Oddziel gruczoły ślinowe za pomocą kleszczy i odsłoń tchawicę.
    4. Wypreparuj mięśnie wokół tchawicy za pomocą kleszczy i nożyczek.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać ostrożnie, ponieważ tchawica może zostać łatwo uszkodzona podczas zabiegu.
    5. Chwyć tchawicę kleszczami i ostrożnie odłącz przełyk przez rozwarstwienie.
    6. Trzymając część tchawicy wewnątrz klatki piersiowej kleszczami, wykonaj nacięcie na początku drzewa oskrzelowego. Następnie odłącz tchawicę od krtani i ostrożnie usuń pozostałą muskulaturę.
    7. Umieść narząd w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej RPMI 1640 + pożywkę HEPES (RPMI) na lodzie.
    8. Przygotować mieszaninę enzymów do trawienia tchawicy, zawierającą 0,26 jednostki/ml kolagenazy (I i II) i 0,2 mg/ml DNazy I w RPMI.
    9. Umieść wypreparowaną tchawicę w 6-dołkowej płytce zawierającej 1 ml mieszaniny enzymów.
    10. Pokrój narząd na małe kawałki za pomocą kleszczy i nożyczek. Na tym etapie trzymaj talerz na lodzie.
    11. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. W tym czasie należy wstrząsać płytką co 15 minut.
    12. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 1 ml buforu płuczącego FACS (2 mM EDTA i 2% inaktywowanej termicznie, sterylizowanej filtrem płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) do PBS.
    13. Ponownie zawiesić roztwór za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby pomóc w oddzieleniu częściowo niestrawionych kawałków tkanki.
    14. Przenieść roztwór do innego dołka, przepuszczając zawartość przez sitko o średnicy 40 μm. Następnie delikatnie rozbić pozostałe kawałki narządu uwięzione na sitku za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Rozdrobnienie częściowo niestrawionych kawałków tchawicy na sitku jest krytycznym krokiem w celu uzyskania optymalnej liczby komórek podczas analizy cytometrii przepływowej.
    15. Przemyć studzienkę i sitko buforem płuczącym FACS i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 5 ml trzymanej na lodzie.
    16. Odwirować probówki o sile 166 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu płuczącego FACS.
    17. Kontynuuj barwienie powierzchni przeciwciał do cytometrii przepływowej. Krótko mówiąc, zablokuj receptory Fc izolowanych komórek za pomocą przeciwciała przeciwko CD16/32, a następnie zabarwić powierzchnię. Aby prawidłowo zidentyfikować neutrofile, panel cytometrii przepływowej powinien zawierać następujące przeciwciała: αLy6G, αCD11b, αCD45, a także barwnik żywotności w celu wykluczenia martwych komórek.
    18. Zbadaj całą zawartość próbek na cytometrze przepływowym i przeanalizuj dane.
      1. Aby uzyskać optymalną liczbę komórek odpornościowych, uruchom zawiesinę pojedynczej komórki z prędkością nie większą niż 3000 zdarzeń/s. Zmniejszy to liczbę zdarzeń wykluczonych podczas przejęcia. Za pomocą tego protokołu powinno być możliwe uzyskanie od 1 do 2 milionów komórek na tchawicę.

2. Izolacja i wstrzykiwanie neutrofili

UWAGA: W tej procedurze użyto myszy B6.129(ICR)-Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy/J (CK6-ECFP)24. Zwierzęta te wykazują ekspresję CFP we wszystkich typach komórek pod wpływem ludzkiego promotora β-aktyny. Alternatywnie możliwe jest również użycie myszy C57BL/6J do izolowania komórek i barwienia ich zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2.6. Oczyszczanie i manipulowanie neutrofilami może zwiększyć ich stan aktywacji, potencjalnie zmieniając ich właściwości migracyjne i funkcjonalne.

  1. Poddać zwierzę eutanazji przez wdychanie CO2 .
  2. Usuń zarówno kości udowe, jak i piszczele i delikatnie oczyść je za pomocą kleszczy.
  3. Przeciąć nasady kostne i przepłukać szpik kostny za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej sterylnym zimnym PBS, w probówce o pojemności 50 ml trzymanej na lodzie.
  4. Zawiesić komórki za pomocą igły 18 G i przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o wielkości 40 μm. Przemyć raz PBS w sile 110 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić komórki w 2 ml zimnego PBS.
  5. Rozcieńczyć 100% Percoll 9:1 w 10x PBS i przygotować roztwory gradientowe percollu 72%, 64% i 52% używając 1x PBS. Ostrożnie ułóż 2 ml każdego z trzech gradientów w probówce o pojemności 15 ml, zaczynając od najbardziej skoncentrowanego.
    1. Dodać ostrożnie 2 ml zawiesiny komórek szpiku kostnego na wierzch gradientów i odwirować przy 1 100 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przyspieszania i hamowania.
  6. Ostrożnie zdjąć opaskę na granicy między 64% a 72% i umyć ją raz w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w zimnym PBS. Ponownie zawiesić komórki w objętości 100 μl PBS i przechowywać je na lodzie. Oczekuje się, że czystość neutrofili będzie wyższa niż 90%.
  7. Opcjonalnie oznacz neutrofile zestawem do proliferacji komórek zgodnie z protokołem producenta. Dodać barwnik do zawiesiny komórkowej do końcowego stężenia 10 μM w objętości 1 ml, inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut i przemywać (166 x g, 5 min).
  8. Oszacuj stężenie komórek za pomocą hemocytometru i wstrzyknij dożylnie 5 x 106 komórek w maksymalnej objętości 100 μl wcześniej zakażonym myszom CD11c-YFP+ za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 26 G, 12 godzin przed obrazowaniem.

3. Przygotowanie myszy do obrazowania

  1. znieczulenie
    1. Znieczulenie zakażonych myszy CD11c-YFP+ w 3 dniu p.i. zgodnie z krokiem 1.2.3.
    2. Gdy myszy zostaną głęboko znieczulone, przygotuj cewnik do ponownego dawkowania znieczulenia.
      1. Wyjąć igłę 30 G ze strzykawki za pomocą kleszczy.
      2. Włóż igłę do 20-centymetrowego kawałka silikonowej rurki medycznej PE-10.
      3. Włożyć strzykawkę igłową o pojemności 30 g wypełnioną mieszaniną ketaminy i ksylazyny po drugiej stronie probówki.
      4. Usuń powietrze z wnętrza rurki.
    3. Przygotuj cewnik 20 G podłączony do rurki z urządzenia do wdmuchiwania tlenu, aby utrzymać automatyczną wentylację (Rysunek 1Ai). Ustaw go na stosunek oddechu 130 uderzeń na minutę (b.p.m.) z objętością oddechową 0,2 ml, używając 100% dopływu tlenu.
  2. Przygotuj mysz do operacji
    1. Trzymaj mysz na konkretnej, dostosowanej do potrzeb klienta tablicy chirurgicznej (Rysunek 1Aii-iii) nad podgrzewaną płytą lub podgrzewanym stołem chirurgicznym ustawionym na 37 °C przez cały czas operacji.
    2. Ogol włosy z szyi myszy za pomocą elektrycznej maszynki do golenia i kremu do depilacji (Rysunek 1Bi).
    3. Umieść mysz nad plastikową pozycją myszy (Rysunek 1Aii-a), trzymając głowę zwierzęcia poza pozycją (Rysunek 1Bii), aby stworzyć kąt, który ułatwi intubację tchawicy.
    4. Przymocuj kończyny przednie, łapy i ogon taśmą chirurgiczną, zwilż oczy myszy żelem wzbogaconym w witaminę A i zdezynfekuj szyję myszy (Rysunek 1Bii).
  3. chirurgia
    1. Przygotuj odpowiednio autoklawowane przedmioty, a mianowicie nożyczki, nożyczki mikrochirurgiczne i kleszcze.
    2. Wykonaj małe nacięcie na długiej osi przyśrodkowej szyi, o długości około 1 cm, w środkowej części między górną częścią klatki piersiowej a linią przechodzącą przez dolny punkt żuchwy (Rysunek 1Biii).
    3. Poruszaj na boki plam skórnych i gruczołów ślinowych i uwidocznij tchawicę, pokrytą mięśniami. Następnie dokładnie wypreparuj mięśnie tchawicy za pomocą kleszczy (Rysunek 1Biii).
    4. Zaintubuj mysz cewnikiem i rozpocznij sztuczną wentylację (Rysunek 1Biv).
      UWAGA: Cewnik składa się z zewnętrznej części z tworzywa sztucznego, która chroni błonę śluzową tchawicy oraz wewnętrznej żelaznej igły. Obecność igły stanowi idealne rozwiązanie do przedłużenia i ustabilizowania tchawicy oraz regulacji jej ekspozycji. Sztuczna wentylacja przez cewnik zagwarantuje prawidłowe oddychanie myszy.
    5. Natychmiast uruchom sztuczną wentylację, aby monitorować oddech myszy.
    6. Ustal wysokość i orientację cewnika za pomocą haka chirurgicznego ( Rysunek 1Bv) połączonego z określonym prętem na tablicy operacyjnej (Rysunek 1Aii-b). Odsłoń tchawicę na tej samej wysokości podbródka.
    7. Otocz tchawicę wazeliną i przykryj ją kilkoma kroplami podgrzanego PBS, aby zagwarantować odpowiednie nawodnienie narządu (Rysunek 1Bvi).
    8. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na wierzchu preparatu. W tym kroku przyklej szkiełko nakrywkowe do metalowego uchwytu (Rysunek 1Bvii), który zostanie przykręcony do translatora XYZ (Rysunek 1Aii-c). Dostosuj translator XYZ tak, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na preparacie chirurgicznym.
    9. Umieść cewnik do podania znieczulenia dootrzewnowo (Rysunek 1Bviii).
    10. Wstrzykiwać 50% dawki początkowej mieszaniny ketaminy i ksylazyny co 30 min.
      UWAGA: Ponowne dozowanie od 50% do 25% początkowej mieszaniny ketaminy/ksylazyny jest bezpieczną i ważną alternatywą25. Ponieważ jednak protokół ten jest nieuleczalny i podczas całego zabiegu wymagane jest ścisłe unieruchomienie zwierzęcia, należy stosować wyższe dawki, aby utrzymać głęboką chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.

4. Obrazowanie poklatkowe in vivo

UWAGA: Akwizycja obrazu została przeprowadzona za pomocą pionowego mikroskopu dwufotonowego, wyposażonego w dwa lasery Ti:Sa, komorę inkubacyjną o kontrolowanej temperaturze i obiektyw do zanurzenia w wodzie 25X/NA 1.1. Fotopowielacze (PMT) używane do akwizycji obrazu były albo detektorami hybrydowymi, albo detektorami GaAsP o wysokiej czułości.

  1. Umieścić deskę chirurgiczną ze znieczuloną myszą w komorze inkubacyjnej mikroskopu (podgrzanej do temperatury 37–38 °C) i dodać kroplę wody na szkiełko nakrywkowe.
  2. Wyśrodkuj i skup się na tkance tchawicy.
  3. Ustaw częstotliwość skanowania na 800 Hz, przy 520 x 520 pikselach, polu widzenia 440 x 440μm2 i średniej liniowej 1.
    1. Dostrój laser Ti:Sa do długości fali 830 nm, aby wzbudzić wytwarzanie drugiej harmonicznej (SHG) z kolagenu, o orientacyjnej mocy u źródła 150 mW. Dostrój drugi laser Ti:Sa o długości fali 920 nm i mocy 94 mW u źródła, aby wzbudzić zarówno CFP, jak i YFP.
    2. Ustaw tryb akwizycji 3D i timelapse z jednoczesnym wzbudzeniem
      UWAGA: Utrzymuj moc lasera na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować fotowybielanie i fototoksyczność.
  4. Rejestruj fluorescencję przy użyciu dwóch kanałów w trybie bez deskanowania, z głównym zwierciadłem dichroicznym przy długości fali 560 nm. W konfiguracji zastosowanej w tym protokole, drugie zwierciadło dichroiczne podzieliło sygnał przy 495 nm, aby oddzielić kanał 1 (filtr emisyjny 475/50) od kanału 2 (filtr emisyjny 525/50) (Rysunek 2A). Taka konfiguracja zbiera światło SHG z kolagenu w pierwszym kanale, podczas gdy emisja CFP jest zbierana zarówno w kanałach 1, jak i 2, a YFP jest zbierana tylko w kanale 2.
  5. Zdefiniuj zakres 50 μm wzdłuż osi Z, z rozmiarem kroku 3 μm (rozmiar woksela 0,86 μm x 3 μm). Rejestruj obrazy co 30 s przez łączny czas 30 minut.
  6. W razie potrzeby zdobądź wiele regionów. Przed wykonaniem kolejnych pobraniów należy sprawdzić parametry życiowe i w razie potrzeby ponownie wstrzyknąć znieczulenie przez cewnik (patrz krok 3.3.10).
  7. Pod koniec procesu obrazowania należy poddać mysz eutanazji poprzez przedawkowanie ketaminy/ksylazyny, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.

5. Przetwarzanie obrazów i analiza ilościowa ruchliwości i interakcji neutrofilów-DC

UWAGA: W tym protokole do analizy danych mikroskopowych użyto specjalistycznego oprogramowania do obrazowania.

  1. Po zakończeniu akwizycji obrazu 4D przenieś pliki (dane i metadane) na stację roboczą o wystarczających zasobach obliczeniowych (sugerowane minimalne wymagania systemowe: 32 GB pamięci RAM, szybkie dyski SSD, najnowszy procesor, dedykowany procesor graficzny oparty na architekturze masowo równoległej).
  2. Otwórz pliki w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
  3. Odtwórz wideo i upewnij się, że interesujące komórki są wyraźnie widoczne, a artefakty obrazowania są nieobecne.
    UWAGA: W tym celu należy sprawdzić, czy zarówno ruch próbki, jak i zmiana jasności są wystarczająco ograniczone. Rzeczywiście, stanowią one wyzwanie dla automatycznej analizy26. Jeżeli ruch próbki między sąsiednimi ramkami jest nadmierny, należy zastosować metodę korekcji dryftu, używając na przykład kanału SHG jako stałego odniesienia. Pozwala to na lepszy pomiar ruchu komórek, a nie ruchu próbki. Dodatkowo, w przypadku jasnego tła lub zanieczyszczeń, należy przyciąć zrekonstruowane powierzchnie, używając objętości jako parametru wyboru.
  4. Wygeneruj kanał kolokalizacyjny specyficzny dla komórek CFP+, w celu oddzielenia sygnału między CFP a kolagenem (SHG). W tym celu należy oznaczyć wielokąt bramkowania (Rysunek 2Bi), który wybiera tylko woksele o dodatniej intensywności zarówno w kanale zielonym, jak i niebieskim.
    UWAGA: Ta procedura może się różnić w zależności od zestawu filtrów mikroskopu i barwienia komórek. Można to osiągnąć, wybierając tylko woksele o wystarczającej intensywności zarówno w kanale zielonym, jak i niebieskim. Wśród dostępnych narzędzi funkcja "coloc" może być wykorzystana do automatycznego obliczania kanału kolokalizacji na podstawie progów intensywności. Dodatkowo, metody oparte na uczeniu maszynowym mogą być wykorzystane do tego kroku pod nadzorem experta27.
  5. Wykrywaj i śledź komórki CFP+ za pomocą automatycznej rekonstrukcji i śledzenia powierzchni (narzędzie do powierzchni) przez odpowiedni kanał kolokalizacji.
    UWAGA: Może być wymagane ręczne wyeliminowanie ewentualnych błędów śledzenia i wykluczenie ścieżek o czasie trwania krótszym niż zdefiniowany próg (tj. 150 s).
  6. Wygeneruj kanał kolokalizacyjny specyficzny dla komórek CD11c-YFP+, w celu oddzielenia sygnałów CFP i YFP. W tym celu oznacz wielokąt bramkowania (Rysunek 2Bii), który wybiera tylko woksele o dodatnim natężeniu w kanale zielonym, ale o niskiej intensywności w kanale niebieskim.
    UWAGA: Reprezentatywne mikrofotografie przedstawiające sygnały z kanału 1, kanału 2, kanału kolokalizacyjnego dla CFP, kanału kolokalizacyjnego dla YFP oraz kombinację wszystkich kanałów można znaleźć w Rysunek 2Biii.
  7. Zrekonstruuj powierzchnię komórek CD11c-YFP+ i śledź ich położenie w czasie (narzędzie do powierzchni).
    UWAGA: Ręczna korekta ewentualnych błędów śledzenia nie jest wymagana na tym etapie. Rzeczywiście, ze względu na złożoną dynamikę czasoprzestrzenną DC, rekonstrukcja ich dokładnej powierzchni na podstawie danych 2P-IVM jest trudnym zadaniem, którego nie można osiągnąć za pomocą dostępnego oprogramowania do segmentacji. Jednym z powodów, dla których zadanie to jest trudne, są cienkie wypukłości i zmiany jasności, które nie pozwalają na użycie niektórych technik przetwarzania obrazu, takich jak filtry wygładzające lub statyczne progowanie. Co więcej, w sieci DC trudno jest rozdzielić pojedyncze komórki tylko na podstawie ich występowania w danych 2P-IVM. Z tych powodów, zamiast próbować dokładnej segmentacji poprzez dostrajanie parametrów oprogramowania, proponujemy zrekonstruować niedokładne powierzchnie DC. Następnie zajmij się możliwymi błędami za pomocą solidnych metryk, jak opisano w 5.8.
  8. Mierzenie migracji komórek.
    1. Wyeksportuj klasyczne miary migracji zarówno dla komórek CFP+, jak i CD11c-YFP+. Spośród nich "średnia prędkość toru" wskazuje średnią prędkość migracji komórek, podczas gdy "prostoliniowość toru" wskazuje kierunkowość komórek. Miary te można wyeksportować jako plik arkusza kalkulacyjnego z oprogramowania do obrazowania.
    2. W wyeksportowanych plikach arkuszy kalkulacyjnych oblicz "skorygowaną prostoliniowość ścieżki" (nazywaną również skorygowanym współczynnikiem zamknięcia) dla komórek CFP+ i CD11c-YFP+, która jest zdefiniowana jako "prostoliniowość ścieżki" pomnożona przez pierwiastek kwadratowy z "czasu trwania ścieżki" podzielony przez pierwiastek kwadratowy czasu trwania filmu. Ta miara jest bardziej niezawodna niż "prostoliniowość ścieżki" w obecności krótkich ścieżek28, pochodzących na przykład z błędów śledzenia.
      UWAGA: tylko filmy o tej samej długości mogą być porównywane z tą miarą.
  9. Mierz interakcję komórek.
    1. Zdefiniuj kontakt między komórką CFP+ a komórką CD11c-YFP+, jeśli ich odległość (najbliższe woksele) jest mniejsza lub równa progowi (tj. 2 μm).
      UWAGA: Próg ten powinien być wystarczająco rygorystyczny, aby wykryć kontakt tylko wtedy, gdy komórki znajdują się w bliskiej odległości. Zachęcamy jednak do utrzymywania tego progu większego niż 0, najlepiej N razy większego niż promień woksela (N > 2), ponieważ wygładzanie granic może sprawić, że rekonstrukcja komórek będzie mniejsza niż rzeczywisty rozmiar komórki.
    2. Policz liczbę i czas trwania kontaktów między komórkami CFP+ i CD11c-YFP+. W oprogramowaniu do obrazowania można to zrobić na przykład poprzez uruchomienie wtyczki "kiss and run". Miary te można wyeksportować jako plik arkusza kalkulacyjnego z zakładki statystyki.
  10. Zaimportuj wcześniej obliczone miary do oprogramowania statystycznego, wygeneruj wykresy i wykonaj testy statystyczne
    11. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy opisaliśmy szczegółowy protokół badania in vivo motylości oraz interakcji między neutrofilami a komórkami DC podczas infekcji grypą w tchawce myszy (Rycina 3A). W tym celu wyizolowaliśmy neutrofile CFP+ (czystość 92%; Rycina 3B) z myszy CK6-ECFP i przenieśliśmy je drogą adoptywną do myszy CD1c-YFP zainfekowanej grypą. Następnie, w 3. dniu po infekcji (p.i.), przeprowadziliśmy 2P-IVM tchawki....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy przedstawiono szczegółowy protokół generowania obrazów 4D pokazujących migrację adoptywnie przenoszonych neutrofili i ich interakcje z prądem stałym podczas infekcji grypowej w tchawicy myszy. Opisany model 2P-IVM będzie przydatny do badania dynamiki komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Ostatnio opracowano kilka modeli opartych na wizualizacji dynamiki komórek w drogach oddechowych 9,10,11,12,13,14,15,16.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Szwajcarskiej Fundacji Narodowej (SNF) (176124, 145038 i 148183), Grant Reintegracyjny Marie Curie Komisji Europejskiej (612742) oraz SystemsX.ch o grant dla D.U.P. (2013/124).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Gigasept instru AFSchü lke & Mayr GmbH4% roztwór
CD11c-YFPmyszy Jackson Laboratories008829myszy zostały wyhodowane we własnym zakresie
myszy CK6-ECFPJackson Laboratories004218myszy zostały wyhodowane we własnym zakresie
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco zmodyfikowana bez chorydu wapnia i chlorku magnezuSigmaD8537-500ML
10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco modyfikowana bez choryku wapnia i chlorku magnezuSigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigma E0414-1LPrzechowywać w 4° C
Ketamin LabatecLabatec Pharma7680632310024Sklep w RT, sklep pod adresem 4 & deg; C w roztworze mieszaniny ket/ksyl
Rompun 2% (Xylazin)Bayer6293841.00.00Przechowywać w temperaturze pokojowej, przechowywać w temperaturze 4 ° C w roztworze mieszaniny ket/ksyl
26 G 1 ml Sub-Q BD PlastipakBD Plastipak305501
30 G, 0,3 ml BD Strzykawki do insuliny Micro-FineBD324826
Falcon 40 µ m Sitko do komórekCorning352340
mL StrzykawkiBD Plastipak300185
Microlance 3x igły 18 GBD304622
Introcan Safety 20 G (cewnik)Braun4251652.01
6-dołkowy klaster do hodowli komórkowychCostar3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x)ThermoFisher Scientific42401-018Sklep pod adresem 4° C
Liberase TL Research GradeRoche5401020001Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C / kolagenaza (I i II) mieszanina
DNAzy IAmresco (VWR)0649-50KUPrzechowywać w temperaturze -20 ° C
CellTrace Fioletowa bejcaThermoFisher ScientificC34557Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
EDTASigmaEDS-500G
Płodowa surowica bydlęcaGibco10270-106Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
PE-10 Mikro rurki medyczne2Instrumenty biologiczne SNC#BB31695-PE/1
Chirurgiczna taśma plastikowaM Plast
ViscotearsBausch & LombStore w RT
PlastelinaOhropax
Szkiełko nakrywkowe o wysokiej tolerancji 15 mm okrągłeWarner Instruments64-0733
Przenośny system znieczulania zwierząt SomnoSuiteKent ScientificSS-01
Nuvo Lite mark 5GCE medline14111211
MiniTag (znieczulenie gazowe i ławka grzewcza)Tem Sega
SURGICAL BOARDUniwersytet w Bernie
TrimScope II Mikroskop dwufotonowyLaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa laseryCoherent Inc.
25X NA 1.05 cel do zanurzenia w wodzieOlympusXLPLN25XWMP2
The Cube& Komora inkubacyjna Box i regulator temperaturyobrazowania życia
Imaris 9.1.0Oprogramowanie do obrazowaniapłaszczyzny bitowej
GraphPad Prism 7Oprogramowanie statystyczneGraphPad
2 Usługi

Bibliografia

  1. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  2. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  3. Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
  4. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
  6. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  7. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  8. Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
  9. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
  10. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  11. Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
  12. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
  14. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
  15. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  16. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  17. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  18. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
  19. Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  20. van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
  21. Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
  22. Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  23. Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
  24. Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
  25. Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
  26. Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
  27. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  28. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  29. Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
  30. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
  31. Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).
  32. Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie b ony luzowej tchawicyinterakcja neutrofili z kom rkami dendrytycznymianaliza cytometrycznachirurgiczne ods oni cie tchawicydonosowa infekcja grypizolacja neutrofili z szpiku kostnegogradient g sto ci Percollanaliza ruchomo ci kom rek odporno ciowych
Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.