Wizualne warunkowanie klasyczne u mrówek leśnych

Podsumowanie

Prezentujemy protokół klasycznego warunkowania mrówek w okiełznaniu, który pozwala badaczom badać wizualne uczenie się i tworzenie pamięci na poziomie analizy niemożliwym dla swobodnie poruszających się osób.

Streszczenie

Kilka gatunków owadów stało się modelowymi systemami do badania uczenia się i tworzenia pamięci. Chociaż wiele badań koncentruje się na swobodnie poruszających się zwierzętach, badania wdrażające klasyczne paradygmaty warunkowania z wykorzystaniem zaprzęgniętych owadów były ważne dla zbadania dokładnych wskazówek, których uczą się poszczególne osoby, oraz mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci. W tym miejscu przedstawiamy protokół wywoływania wizualnego uczenia się asocjacyjnego u mrówek leśnych poprzez warunkowanie klasyczne. W tym paradygmacie mrówki są zaprzęgnięte i prezentowane za pomocą wizualnej wskazówki (niebieski karton), bodźca warunkowego (CS), w połączeniu z apetytywną nagrodą cukrową, bodźcem bezwarunkowym (US). Mrówki wykonują odruch wyprostu szczękowo-sromowego (MaLER), odpowiedź bezwarunkową (UR), która może być wykorzystana jako odczyt do uczenia się. Trening składa się z 10 prób, oddzielonych 5-minutową interwencją międzytrialową (ITI). Mrówki są również testowane pod kątem zachowania pamięci 10 minut lub 1 godzinę po treningu. Protokół ten może pozwolić naukowcom na analizę, w precyzyjny i kontrolowany sposób, szczegółów tworzenia pamięci wzrokowej oraz neuronalnych podstaw uczenia się i tworzenia pamięci u mrówek leśnych.

Wprowadzenie

Owady były szeroko wykorzystywane jako modele do badania uczenia się i tworzenia pamięci¹. Szczególnie udanym nurtem badań jest wykorzystanie klasycznego warunkowania skrępowanych zwierząt, co pozwala na precyzyjną kontrolę nad wyuczonymi sygnałami i pozwala naukowcom badać mechanizmy neuronalne leżące u podstaw uczenia się i pamięci. Większość badań koncentrowała się na klasycznym warunkowaniu apetytywnym robotnic pszczół miodnych, Apis mellifera. Robotnice pszczół miodnych są szkolone w zakresie kojarzenia CS z USA, który przywołuje UR. W tym paradygmacie, pierwotnie opracowanym przez Takeda² oraz Bitterman et al.³, UR to odruch przedłużenia trąbowca (PER), US to cukier, a CS to zapach. Pszczoły uczą się związku między CS a USA i mogą tworzyć długotrwałą pamięć tego związku.

Oryginalny paradygmat wykorzystujący PER jako UR został wykorzystany do rozwikłania ścieżek neuronowych leżących u podstaw uczenia się węchowego u pszczół⁴. Został zmodyfikowany na kilka sposobów, aby przetestować uczenie się różnych bodźców sensorycznych, w tym bodźców wizualnych^5,6,7, aby włączyć awersyjne uczenie się za pomocą tłumienia PER⁸ lub Sting Extension Reflex (SER)⁹ jako UR, oraz aby przetestować uczenie się u innych gatunków, takich jak bumblebees¹⁰ i muszki owocowe¹¹. Chociaż tworzenie pamięci za pomocą kilku modalności zostało zbadane za pomocą klasycznego warunkowania, uczenie się wizualne jest nadal trudne do zaobserwowania przy użyciu tego podejścia, nawet u gatunków, które wykazują wysoki stopień zdolności uczenia się wizualnego podczas żerowania, takich jak pszczoły miodne.

Ostatnie badania zastosowały podobne podejście do owadów, które nie mają trąby, takich jak szarańcza, która wykonuje reakcję na otwarcie palp (POR)¹², oraz mrówki, które wykonują odruch wydłużenia szczęki-wargi sromowej (MaLER)¹³. To już ujawniło specyficzne dla danej fazy zdolności uczenia się, które pasują do specyficznych dla fazy strategii żywieniowych dwóch różnych fenotypów szarańczy pustynnej, formy stadnej i solitarnej, wzmacniając ideę, że tworzenie pamięci musi odpowiadać potrzebom ekologicznym¹⁴. Co więcej, badania nad uczeniem się węchowym u mrówek wykazały podobieństwa między mrówkami a pszczołami miodnymi w tworzeniu i zapamiętywaniu, przy czym zachowanie pamięci długotrwałej, 72 godziny po treningu, jest zależne od syntezy białek¹⁵.

Te adaptacje oryginalnego paradygmatu pozwoliły na badanie uczenia się i tworzenia pamięci za pomocą wielu modalności i w kilku gatunkach modeli. Ma to zasadnicze znaczenie dla identyfikacji mechanizmów tworzenia pamięci wspólnych dla owadów, ale także dla identyfikacji różnic, które odzwierciedlają szczególną ekologię uczenia się i pamięci u różnych gatunków. Głównym celem opisywanego przez nas protokołu jest zapewnienie sposobu na przeprowadzanie klasycznych eksperymentów warunkowych przy użyciu wizualnego bodźca warunkowego z szeroko badanym gatunkiem mrówek, Formica rufa. Pochodzi on z naszego badania nad wizualnym uczeniem się u mrówek leśnych¹⁶, który jest również adaptacją klasycznych paradygmatów warunkowania wizualnego.

Protokół

1. Utrzymanie kolonii Formica rufa

Uwaga: Kolonie mrówek leśnych (Formica rufa, L.) użyte do tego badania zostały zebrane z Ashdown Forest, Sussex, UK (N 51 4.680, E 0 1.800). W Wielkiej Brytanii kolonie F. rufa powinny być zbierane między lipcem a sierpniem. Znaczna część gniazda musi zostać usunięta, w tym kilkaset robotnic i czerwiu, aby zapewnić utrzymanie i aktywność kolonii przez dłuższy czas (do jednego roku). Przed usunięciem gniazda należy uzyskać zgodę odpowiednich władz.

1. Umieść kolonie mrówek drewnianych w szerokim pudełku (około 135 cm x 70 cm x 35 cm) ze ścianami pokrytymi żywicą politetrafluoroetylenową (PTFE) (np. Fluon), aby zapobiec ucieczce mrówek, w temperaturze 21°C, w 12-godzinnym cyklu światła: 12-godzinnego ciemnego cyklu.
   1. Podaj mrówkom sacharozę (333 g/l) i wodę za pomocą dozowników wody. Aby dieta mrówek była bogata w białko, karm kolonię mrożonymi świerszczami 2 razy w tygodniu. Codziennie spryskuj gniazdo wodą, aby było wilgotne.
   2. Aby poprawić warunki sanitarne kolonii, w razie potrzeby dodaj żywicę sosnową; żywica sosnowa zmniejsza pasożytnictwo w koloniach mrówek leśnych¹⁷. Umieść mały pojemnik (o średnicy około 15 cm i głębokości 5 cm) wewnątrz gniazda, aby mrówki mogły złożyć w nim martwych członków kolonii.
2. Trzymaj mrówki w wyżej wymienionych warunkach przez co najmniej 2 tygodnie po zebraniu przed przystąpieniem do jakichkolwiek eksperymentów. Usuń sacharozę z gniazda, aby zagłodzić mrówki 2 dni przed eksperymentami, poprawiając w ten sposób ich motywację.

2. Wybór i okiełznanie mrówek

Uwaga: Do okiełznania mrówek potrzebny jest specjalnie wykonany uchwyt. Można go zbudować z modeliny i kartonu z wyciętym otworem przymocowanym do niego poziomo. Górna powierzchnia tektury powinna być częściowo pokryta woskiem, co pozwoli na przymocowanie szpilek do owadów podczas mocowania. Ostrożne obchodzenie się z nim jest konieczne na każdym etapie tego protokołu (w tym konserwacji, transportu i eksperymentów), ale w szczególności podczas zaprzęgania mrówek, aby uniknąć narażania ich na wysoki poziom stresu przed treningiem.

1. Aby wybrać mrówki, które są zmotywowane do jedzenia, umieść szkiełko z kroplą sacharozy (200 g/l) w małym pudełku (około 14 cm x 8 cm x 5 cm) ze ściankami pokrytymi żywicą PTF, aby zapobiec ucieczce. Nie wybieraj mrówek, które niosą drewno lub martwe mrówki z gniazda. Zamiast tego weź mrówki, które pełzają po ścianach gniazda, ponieważ są one bardziej prawdopodobne, że będą to zbieracze próbujący opuścić gniazdo w poszukiwaniu pożywienia.
2. Umieść każdą mrówkę w pudełku i poczekaj, aby zobaczyć, czy żywi się kroplą sacharozy. Jeśli tak się stanie, natychmiast przenieś go do innego pustego pudełka, aby zapobiec nasyceniu.
3. Przenieś każdą mrówkę do osobnej probówki. Umieść każdą probówkę w zamrażarce na 1-2 minuty lub w pokruszonym lodzie na maksymalnie 5 minut, aby unieruchomić mrówkę.
4. Umieść unieruchomioną mrówkę w uchwycie, przez nacięcie w kartonie, przy stawie między jej głową a klatką piersiową. Upewnij się, że czułki pozostają z boku głowy, używając szpilek do owadów osadzonych w warstwie wosku na wierzchu kartonu.
5. Użyj specjalnie wykonanego elementu grzejnego, aby woskować końcówkę szpilki do owada do głowy mrówki, równolegle do kartonu. Podczas tej procedury nie dotykaj anten drutem elementu grzejnego, aby uniknąć ich uszkodzenia.
6. Po wyschnięciu wosku usuń szpilki owadów przytrzymujące czułki i ostrożnie wyjmij mrówkę z uchwytu.
7. Zamocuj szpilkę do owadów przytrzymującą mrówkę w cylindrze z plasteliny i zamocuj pod nią wykonany na zamówienie plastikowy uchwyt, upewniając się, że mrówka utrzymuje typową postawę stojącą i że całe ciało może się swobodnie poruszać z wyjątkiem głowy.
8. Trzymaj zaprzęgnięte mrówki w ciemności przez co najmniej 2 godziny przed treningiem.

3. Szkolenia i testy

1. Ustawienie, bodziec warunkowy i bodziec bezwarunkowy
   1. Przeprowadź eksperymenty w białym akrylowym pudełku (50 x 50 x 50 cm), otwartym z przodu, aby umożliwić dostęp eksperymentatorowi. Nagraj zachowanie mrówki za pomocą kamery.
      1. Umieść aparat z obiektywem makro bezpośrednio nad mrówką, przez otwór w górnej powierzchni pudełka.
      2. Aby zredukować wszelkie zewnętrzne wskazówki wizualne, utrzymuj pomieszczenie w ciemności, z wyjątkiem źródła światła skierowanego bezpośrednio na górną część akrylowego pudełka (dwie lampy o mocy 26 W).
   2. Użyj jako wizualnej wskazówki (CS) jasnoniebieskiego (widmo na rysunku S1) kartonowego prostokąta (60 x 45 mm) przymocowanego w środku do igły, połączonego ze strzykawką (2 ml), za pomocą której US (sacharoza 200 g/L) jest ręcznie dostarczana do mrówki (Rysunek 1A i 1B).
      Uwaga: Roztwór sacharozy można przygotować z dowolnym białym cukrem, pod warunkiem, że po rozpuszczeniu w wodzie nie ma koloru i zapachu.
   3. Prowadź dwa rodzaje treningu równolegle, sparowane i niesparowane (patrz wyjaśnienie poniżej), w losowej kolejności.
      Uwaga: W tym badaniu nie zwróciliśmy uwagi na naturę wskazówki wizualnej. Pod uwagę brany był tylko związek między wskazówką a nagrodą. Kolor i kształt nie były testowane i jest prawdopodobne, że CS z innymi funkcjami dałby podobne wyniki. Niemniej jednak wybrano kolor niebieski, ponieważ wykazano, że mrówki z tego samego rodzaju są wrażliwe na długości fal pokrywające kolor niebieski¹⁸.
2. Trening w parach
   Uwaga: W treningu sparowanym CS i US są prezentowane w każdym badaniu, powiązane ze sobą (Rysunek 1C).
   1. Rozpocznij nagrywanie mrówek 10 s przed prezentacją CS, aby upewnić się, że mrówki nie wykonują spontanicznie MaLER przed prezentacją. Jeśli mrówki wykonają MaLER w tym okresie, odłóż próbę na kilka sekund. Jeśli jakaś mrówka wykazuje takie zachowanie w sposób ciągły, wyklucz ją z analizy.
   2. Przesuwaj strzykawkę + CS przed mrówką przez ~10 s, trzymając końcówkę igły między pyskiem mrówki i maksymalnie 5 mm powyżej i z każdej strony. W tym czasie przesuń końcówkę igły jak najbliżej głowy mrówki, ale nie dotykając czułków (Rysunek 1B).
      Uwaga: Ruch został uwzględniony podczas prezentacji CS, ponieważ wykazano, że odgrywa on rolę w wizualnym uczeniu się asocjacyjnym w pszczołach miodnych⁶.
   3. Zastosuj nacisk, aby wypuścić pojedynczą kroplę sacharozy z końcówki strzykawki i umieść kroplę sacharozy obok czułków i aparatu gębowego, aby mrówka mogła wykryć sacharozy. Pozwól mrówce żerować przez około 5 s.
      Uwaga: Ilość mrówek sacharozowych spożywanych w każdym badaniu nie była kontrolowana w tych eksperymentach. Kropla sacharozy, którą żywią się mrówki, powinna być na tyle duża, aby mogły swobodnie żerować przez około 5 sekund.
   4. Powtórz tę procedurę 10 razy, z ITI 5 min.
      Uwaga: W tych eksperymentach mrówki były zawsze zwrócone w prawo, z prawym okiem blisko otwartej strony akrylowego pudełka. Dlatego CS zawsze podchodził do mrówek z prawej strony. Chociaż nie unieważnia to uczenia się, eksperymenty te można przeprowadzić, obracając połowę mrówek w lewo, a połowę w prawo, aby uniknąć możliwego efektu lateralizacji.
3. Trening bez par<br /> Uwaga: Trening ten polega na przedstawieniu mrówkom osobno CS lub USA, przy czym te dwa bodźce są w ten sposób oddzielane od siebie w czasie (Rysunek 1D).
   1. Rozpocznij nagrywanie mrówek 10 s przed każdą próbą.
   2. Przedstaw CS w taki sam sposób, jak podczas treningu w parach, ale nie podawaj sacharozy mrówce.
   3. Po 2,5 minuty dostarczyć US bezpośrednio do aparatu gębowego (dotykając również czułków) za pomocą strzykawki bez dołączonego CS.
   4. Rozpocznij od próby CS i powtórz tę procedurę 10 razy dla każdego rodzaju próby, interkalując je z ITI trwającym 2,5 minuty.
4. Testowanie
   Uwaga: Test powinien być przeprowadzony tylko 1x, 10 minut lub 1 godzinę po ostatniej próbie treningowej; test, w którym mrówce przedstawia się CS, ale nie USA, może spowodować wygaśnięcie utworzonej wcześniej pamięci asocjacyjnej.
   1. Rozpocznij nagrywanie mrówek 10 s przed badaniem.
   2. Przedstaw CS mrówce przez około 10 sekund.
   3. Upewnij się, że mrówka jest nadal zmotywowana do żerowania, dostarczając sacharozę po teście.

4. Gromadzenie i analiza danych

1. Rejestruj zachowanie mrówki z góry, 10 s przed każdą próbą oraz podczas prezentacji CS i US. Upewnij się, że wszystkie próby i testy są rejestrowane do analizy a posteriori.
2. Korzystając z nagrań wykonanych podczas treningu i testów, oceń reakcje mrówek w ciągu 10 sekund prezentacji CS.
3. Podziel reakcje mrówek podczas prezentacji CS na trzy typy zachowań, w zależności od wyprostowania i ruchu aparatu gębowego: Pełne wyprostowanie z ruchem (MES) jak podczas karmienia, Pełne wyprostowanie bez ruchu (FE) lub Częściowe wyprostowanie (PE) szczęki-wargi sromowej lub palpów szczękowych (Rysunek 2A - 2D). Na potrzeby analizy pogrupuj wszystkie typy MaLER jako pojedynczą odpowiedź (Rysunek 2E).
4. Wyklucz mrówki, które nie żerowały we wszystkich próbach i testach.
   Uwaga: Do analizy zaleca się test statystyczny, który bierze pod uwagę poszczególne mrówki, uwzględniając w ten sposób zmienność w obrębie osobników. Przy klasyfikowaniu odpowiedzi mrówek podczas treningu w sposób binarny (1 dla odpowiedzi pozytywnych i 0 dla braku odpowiedzi) zalecana jest regresja logistyczna z efektami mieszanymi^16,19. Aby porównać odsetek mrówek odpowiadających w każdej próbie treningowej lub teście, zaleca się test G lub dokładny test Fishera, w zależności od liczby analizowanych mrówek^16,20.

Wyniki

Podczas klasycznych eksperymentów warunkowania, CS nie może wywoływać spontanicznej reakcji u zwierząt. W przeprowadzonych przez nas eksperymentach tylko 3% - 4% mrówek wykonywało MaLER w odpowiedzi na wskazówkę wizualną podczas pierwszej próby, przed treningiem. Mrówki, które przechodziły trening w parach, osiągały coraz więcej MaLER w odpowiedzi na CS (Rysunek 3A; regresja logistyczna, N = 51, stopnie swobody (df) = 507, z = 5,949, p < 0,01). Odsetek sparowanych mrówek, które reagują na CS, ustabilizował się na poziomie około 50%, począwszy od trzeciego badania. Wręcz przeciwnie, niesparowane mrówki nie wykazały znaczącego wzrostu MaLER podczas treningu (Rysunek 3B; regresja logistyczna, N = 29, df = 287, z = 0,758, p = 0,45). Występowanie MaLER w odpowiedzi na wskazówkę wizualną było istotnie wyższe podczas treningu sparowanego niż niesparowanego (regresja logistyczna, N = 80, df = 796, z = -5,306, p < 0,01), co było prawdą dla każdej próby z wyjątkiem pierwszej (Tabela 1).

W celu zbadania ich pamięci krótko- i średniotrwałej¹⁵, mrówki zostały przetestowane 10 minut lub 1 godzinę po ostatniej próbie treningowej. W obu testach odsetek mrówek wykonujących MaLER w odpowiedzi na CS był znacznie wyższy, gdy przeszły trening w parach, a nie bez par (Rysunek 3C i 3D; Tabela 1).

Podczas treningu, poszczególne mrówki wykazywały znaczne różnice w liczbie i typie MaLER, które prezentowały (Rysunek 4A i 4B). Tylko 14% sparowanych mrówek odpowiedziało w każdym badaniu, począwszy od drugiego lub trzeciego badania, podczas gdy większość mrówek na przemian reagowała w różnych próbach, w których reagowała i w których nie. Podczas tych prób treningowych, w których mrówki reagowały, stopień, w jakim rozciągały i poruszały aparatem gębowym, był różny. Dlatego podzieliliśmy MaLER na trzy różne typy: MES, FE lub PE. Zazwyczaj mrówki wykonywały MES lub PE częściej niż FE. Jednak tylko kilka mrówek wykonywało konsekwentnie ten sam rodzaj reakcji; w większości przypadków mrówki wykazywały niewielką spójność w zakresie rodzaju wykonywanego przez nie MaLER (Ryc. 4).

Rysunek 1: Eksperymentalne przygotowanie i schemat treningowy. (A) Przymocuj mrówkę za pomocą wosku do pinezki przymocowanej do cylindra z plasteliny (pomarańczowej) i umieść pod nią specjalnie wykonany uchwyt, aby umożliwić naturalistyczną postawę. Umieść go w białym akrylowym pudełku oświetlonym dwoma źródłami światła, bezpośrednio pod kamerą. Jako bodziec warunkowy (CS) należy użyć kartonu (niebieskiego kwadratu) dołączonego do strzykawki, która dostarcza bodziec bezwarunkowy (US), nagrodę w postaci cukru. Wstawka przedstawia zbliżenie mrówki w uchwycie. (B) Końcówka igły strzykawki jest przesuwana jak najbliżej głowy mrówki, ale bez dotykania czułków, jak pokazano na tym schemacie. Trenuj mrówki poprzez trening w parze (C) lub (D) bez par. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Fernandes et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reakcja mrówek drewnianych na wydłużenie szczęki i warg sromowych. Poszczególne klatki z nagrań wideo pokazują ruchy części gębowej mrówek podczas treningu. (A) Ten panel nie wykazuje żadnej odpowiedzi. (B) Ten panel pokazuje pełne przedłużenie (FE) szczęki-wargi sromowej, które kończy się w glossa. (C) Panel ten pokazuje częściowe przedłużenie (PE) z widocznym tylko palpusem szczękowym. (D) Panel ten pokazuje częściowe przedłużenie (PE) struktur szczękowo-wargowych. (E) Mrówki poddawane treningowi w parach (N = 51) wykonują pełne wyprostowanie z ruchem (MES; ciemnobrązowy), FE (średnio brązowy) lub PE (jasnobrązowy). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Fernandes et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Drewniane mrówki tworzą skojarzeniowe wspomnienia wizualnej wskazówki w połączeniu z nagrodą cukrową. (A) Odsetek sparowanych mrówek (N = 51) wykonujących MaLER w odpowiedzi na prezentację CS znacznie wzrósł podczas treningu. (B) Odsetek mrówek wykonujących MaLER nie wzrósł znacząco podczas treningu bez par (N = 29). Mrówki badano (C) 10 minut (sparowane: N = 15; niesparowane: N = 15) lub (D) 1 godzinę (sparowane: N = 15; niesparowane: N = 14) po ostatniej próbie treningowej. Odsetek mrówek reagujących na CS podczas i po treningu w parach lub bez par jest reprezentowany odpowiednio na brązowo lub szaro. Trzy typy MaLER są reprezentowane w ciemnych (MES), średnich (FE) i jasnych (PE) tonach. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Fernandes et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Indywidualne wyniki mrówek podczas treningu. Panele te pokazują indywidualne występy (A) sparowanych mrówek i (B) niesparowanych mrówek. Trzy typy MaLER są reprezentowane w kolorze ciemnym (MES), średnim (FE) i jasnym (PE) brązowym lub szarym. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Fernandes et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. .

proces	N	Df	G (dostosowany)	P
1	Rozdział 80	nie	nie	>0,1
cyfra arabska	Rozdział 80	1	3,86	<0,05
3	Rozdział 80	1	Godzina 8,41	<0.01
4	Rozdział 80	1	Lokal 6,63	<0.01
5	Rozdział 80	1	Godzina 8,41	<0.01
6	Rozdział 80	1	7,5	<0.01
7	Rozdział 80	1	Godzina 10,69	<0.01
8	Rozdział 80	1	Godzina 11,76	<0.01
9	Rozdział 80	1	Godzina 17.13	<0.01
10	Rozdział 80	1	Godzina 17.13	<0.01
Czas trwania: 10 min	59 Rozdział 59	1	Rozdział 5.5	<0,05
1 godz	59 Rozdział 59	1	Godzina 4,42	<0,05

Tabela 1: Porównanie odpowiedzi MaLER na CS między mrówkami, które przeszły trening w parach i bez par, dla każdej próby i testu. Pokazana jest liczba mrówek (N), stopnie swobody (df), test niezależności G (G) i wartość p. Pierwsza próba została przeanalizowana za pomocą dokładnego testu Fishera. Ta tabela została zmodyfikowana na podstawie Fernandes et al.¹⁶.

Rysunek S1: Znormalizowana intensywność bodźców warunkowych (CS). CS ma szczytowe natężenie przy 545 nm (w zakresie zielonym), a drugie przy 435 nm (w zakresie niebieskim).

Dyskusja

Warunkowanie klasyczne jest jednym z najbardziej ugruntowanych paradygmatów do badania uczenia się i pamięci. Przedstawiony przez nas protokół jest adaptacją paradygmatu zaprojektowanego dla robotnic pszczół miodnych ^2,3, a następnie zastosowanego w odniesieniu do kilku innych gatunków, takich jak trzmiele, muszki owocowe, które również używają PER jako odczytu do uczenia się^10,11 oraz szarańcza i mrówki, które używają odpowiednio POR i MaLER^12,13. Korzystając z tego protokołu, możliwe jest wytrenowanie zaprzęgniętych mrówek leśnych, aby nauczyły się związku między wskazówką wizualną a nagrodą cukrową i przeanalizowały zachowanie tej krótkotrwałej (10 min) i średniotrwałej (1 godzina)^pamięci16.

W każdym eksperymencie behawioralnym należy wziąć pod uwagę krytyczne kroki, które mogą zminimalizować zmienność reakcji zwierząt. W przedstawionym tutaj protokole podjęto kilka środków mających na celu zminimalizowanie zmienności przed i w trakcie treningu. Przed rozpoczęciem eksperymentów kolonia musi być głodzona przez co najmniej dwa dni, a mrówki powinny być wybierane na podstawie ich gotowości do jedzenia z kropli cukru w pudełku. Selekcja mrówek w ten sposób ma na celu maksymalizację szansy na wyszkolenie mrówek, które są zmotywowane do żerowania. Ostrożne obchodzenie się z nim jest również ważnym czynnikiem, ponieważ może pomóc w zmniejszeniu poziomu stresu, który zakłóca naukę, jeśli jest zbyt intensywna²¹. W tym celu mrówki powinny być znieczulone zimnem, aby pozostały w bezruchu podczas zaprzęgnięcia, ponieważ każdy ruch (w celu ucieczki) podczas tej procedury może być źródłem stresu. Ponadto kontakt między mrówką a woskiem powinien być minimalny, unikając kontaktu czułków z gorącym woskiem lub drutem, który mógłby spowodować uszkodzenie. Chociaż obserwacje te nie zostały formalnie przeanalizowane, czułki wydawały się poruszać według określonego wzorca podczas uczenia się.

Podczas eksperymentów ważne jest również staranne dostarczanie cukru, aby utrzymać motywację mrówek. Ponownie, chociaż nie zostało to formalnie przeanalizowane, nagłe dostarczenie pożywienia wydawało się powodować dodatkowy stres u mrówek, co z kolei prowadziło do braku motywacji i uczenia się. Ponadto sacharoza dostarczana podczas treningu powinna mieć obniżone stężenie (200 g/l), aby uniknąć sytości przed zakończeniem treningu i testów. To sprawia, że MaLER może być dobrym kandydatem na bezwarunkową odpowiedź, ponieważ wraz z niską spontaniczną wydajnością tej odpowiedzi na wskazówkę wizualną, nie nasyca się również w trakcie prób. Wreszcie, w przeciwieństwie do większości klasycznych badań warunkowania 2,3,5,6,7,8,9,10,11,12,13, trenowaliśmy jedną mrówkę na raz do końca eksperymentu, pozostawiając ją na miejscu między próbami, zamiast usuwać ją, aby przetestować inną mrówkę. Szkolenie kilku mrówek razem wydawało się dawać bardziej zróżnicowane wyniki, co może być spowodowane wzrostem stresu i/lub konfliktem między informacjami wizualnymi spowodowanym całkowitą zmianą scenerii. Aby skrócić czas trwania każdego eksperymentu, zastosowaliśmy 5-minutowy ITI zamiast 10-minutowego ITI stosowanego w większości klasycznych badań kondycjonowania¹⁶. Chociaż wszystkie te względy powinny pomóc w zapewnieniu, że mrówki są zmotywowane do żerowania i uczenia się podczas treningu, nie da się uniknąć pewnej zmienności. Zalecamy wykorzystanie mrówek, które wydają się mieć normalne zachowania społeczne, apetytywne i lokomomocyjne oraz wykluczenie mrówek z analizy w momencie, gdy nie będą się odżywiać podczas próby treningowej lub testu.

Charakter CS nie był badany w tym badaniu. Chociaż użyliśmy niebieskiego bodźca wizualnego, ponieważ mrówki tego samego rodzaju są wrażliwe na te długości fal¹⁸, innych kolorów można również nauczyć się w połączeniu z nagrodą. Konieczne byłyby dalsze eksperymenty, aby w pełni scharakteryzować kolory widziane i poznawane w tej konfiguracji. Dotyczy to również różnych kształtów i rozmiarów wskazówki wizualnej. Nie sprawdziliśmy, czy rozdzielczość przestrzenna mrówek byłaby wystarczająca do rozróżnienia prezentowanego tutaj bodźca wzrokowego w odległości od oczu mrówek, w której został zaprezentowany. Chociaż złożone oczy mrówek leśnych zostały opisane pod względem wielkości i liczby fasetek²², to według naszej wiedzy ich rozdzielczość przestrzenna nie została jeszcze w pełni opisana. Zostało to jednak obliczone dla Melophorus magoti²³. Podobna charakterystyka oczu mrówek leśnych lub innych badanych owadów przyczyniłaby się do jasnego zbadania cech wizualnej wskazówki, które są obserwowane i wyuczone przez zwierzęta. Co więcej, uwzględniliśmy ruch podczas prezentowania bodźca wizualnego mrówce, ponieważ wykazano, że odgrywa on rolę w kojarzeniowym uczeniu się pszczół miodnych podczas warunkowania klasycznego⁶. Jednak to również nie zostało przetestowane w tym badaniu, a ze względu na odmienny charakter ruchowy owadów latających w porównaniu z owadami chodzącymi, można było zaobserwować różnice między klasycznym warunkowaniem wizualnym pszczoły miodnej i mrówki.

Na koniec, nie byliśmy w stanie zbadać zachowania pamięci długotrwałej, ponieważ mrówki nie przetrwały zaprzęgnięcia przez tak długi czas po treningu. Jednak w kolejnych zestawach eksperymentów utrzymywaliśmy mrówki przy życiu i motywowaliśmy je do jedzenia i nauki, gdy zostały zaprzęgnięte i pozostawione na noc w ciemnym i wilgotnym środowisku (umieszczając na nich pudełko). Dlatego ten paradygmat może być wykorzystany do rozwikłania zagadki zapamiętywania pamięci długotrwałej mrówek leśnych, oprócz pamięci krótko- i średniotrwałej.

Dzięki tej prostej procedurze zaadaptowanej z ogólnych klasycznych paradygmatów warunkowania, możliwe jest badanie nabywania i zatrzymywania wspomnień wzrokowych u zaprzęgniętych mrówek leśnych, które były szeroko badane w paradygmatach wykorzystujących swobodnie poruszające się zwierzęta. Paradygmat ten ma potencjał, aby zostać wykorzystany do analizy neuronalnych podstaw uczenia się wizualnego w bardzo dobrze ugruntowanym modelu nawigacji owadów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluon	Blades Biological Ltd, Edenbridge, Wielka Brytania	ACS 109; ACS 112; ACS 114	Do zapobiegania przedostawaniu się owadów
Crickets	Blades Biological Ltd, Edenbridge, Wielka Brytania	LZJ 217	Podawany koloniom mrówek jako źródło białka
Naturalna kalafonia sosnowa/żywica	Minerals-water Ltd, Rainham, Wielka Brytania	500g	Podawane koloniom mrówek w celach sanitarnych
Austerlitz Insect Pin	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy	26000-40	Do zaprzęgania mrówek
Kamera szybkoobrotowa	Edmund Optics Inc., Barrington, USA	eo-13122M	Nagrania MaLER podczas treningu i testów
	Macrolens Cannon, Surrey, Wielka Brytania	EF 100 mm f/2.8 L Macro IS USM	Nagrania MaLER podczas treningu i testowania
Software	IDS Imaging Development Systems GmbH	uEye64	Nagrania MaLER podczas treningu i testowania
Blue Cardboard	john smith's w Union Store, University of Sussex	JACK-PJM41358	Stanowi bodziec warunkowy
Syringe Fisher	Scientific LTD, Loughborough, Wielka Brytania	BD  Plastipak  300185walizka; Kod produktu.12369289	US i CS (w załączeniu) prezentacja
Igła (0,5 x 16 mm)	Fisher Scientific LTD, Loughborough, Wielka Brytania	BD Microlance 300600; Kod produktu: 10442204	Prezentacja w USA i CS (w załączeniu)