Pomiar wzorców pojawiania się owadów wymaga precyzji. Istniejące systemy są tylko częściowo zautomatyzowane, a wielkość próby jest ograniczona. Zajęliśmy się tymi problemami, projektując system wykorzystujący mikrokontrolery do precyzyjnego pomiaru czasu pojawienia się dużej liczby pojawiających się owadów.
Artykuł metodologiczny
Precyzyjny i autonomiczny system wykrywania wzorców pojawiania się owadów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istniejące systemy do pomiaru wzorców pojawiania się owadów mają ograniczenia; są tylko częściowo zautomatyzowane i mają ograniczoną maksymalną liczbę pojawiających się owadów, które mogą wykryć. Aby uzyskać precyzyjny pomiar pojawiania się owadów, konieczne jest, aby systemy były półautomatyczne i zdolne do pomiaru dużej liczby pojawiających się owadów. Rozwiązaliśmy te problemy, projektując i budując system, który jest zautomatyzowany i może mierzyć pojawienie się do 1200 owadów. Zmodyfikowaliśmy istniejący system "spadającej kuli" za pomocą mikrokontrolerów Arduino, aby zautomatyzować zbieranie danych i zwiększyć wielkość próby za pomocą wielu kanałów danych. Wiele kanałów danych umożliwia użytkownikowi nie tylko zwiększenie wielkości próby, ale także pozwala na jednoczesne przeprowadzenie wielu zabiegów w jednym eksperymencie. Ponadto utworzyliśmy skrypt języka R, aby automatycznie wizualizować dane w postaci wykresu bąbelkowego, jednocześnie obliczając medianę dnia i godziny pojawienia się. Obecny system został zaprojektowany z wykorzystaniem druku 3D, dzięki czemu użytkownik może modyfikować system tak, aby był dostosowany do różnych gatunków owadów. Celem tego protokołu jest zbadanie ważnych pytań z zakresu chronobiologii i fizjologii stresu, przy użyciu tego precyzyjnego i zautomatyzowanego systemu do pomiaru wzorców pojawiania się owadów.
Wprowadzenie
Precyzyjne mierzenie czasu pojawienia się owadów lądowych w warunkach eksperymentalnych jest niezwykle trudne i wymaga pewnego stopnia automatyzacji. W przeszłości zaprojektowano kilka mechanizmów, zawierających albo zasadę "spadającej kuli", wykorzystującej spadające kule i czujniki, lub "bang-box" wykorzystujący system lejkowy1,2,3. Istnieją dwa ograniczenia związane z istniejącymi projektami: 1) gromadzenie danych jest tylko częściowo zautomatyzowane oraz 2) wielkość próby lub liczba pojawiających się owadów, które można wykryć, jest ograniczona. Problemy te zmniejszają precyzję zbierania danych, co jest ważne dla badania czasu wzorców eklozji i/lub wynurzania. Rozwiązaliśmy te problemy, projektując system, który jest zautomatyzowany i nie jest ograniczony wielkością próby, umożliwiając użytkownikowi lepszą wizualizację rytmów wyłaniania się w odpowiedzi na sygnały środowiskowe.
Nasz system jest ulepszeniem zasady spadającej kuli, której najnowsza wersja wykorzystywała czujniki podczerwieni do wykrywania pojawiania się owadów w sześciominutowych odstępach2. Nasz system nadal wykorzystuje czujniki podczerwieni, ale zawiera również mikrokontroler Arduino, który rejestruje datę i godzinę każdego zdarzenia emergencji z dokładnością do sekundy. Dane są automatycznie zapisywane na bezpiecznej karcie cyfrowej (SD), którą można wyeksportować jako plik rozdzielany przecinkami w celu analizy. Analiza jest zautomatyzowana przy użyciu niestandardowego skryptu języka R, który przedstawi dane na wykresie w postaci wykresu bąbelkowego i określi medianę czasu i dnia pojawienia się.
Wiele kanałów umożliwia użytkownikowi większą elastyczność w pozyskiwaniu danych. Na przykład nasza wielokanałowa konstrukcja nie tylko minimalizuje wpływ "zatkanego" czujnika, ale może być również wykorzystana do zwiększenia wielkości próbki. Co więcej, wiele kanałów pozwala użytkownikowi przypisać zabiegi do określonych kanałów, dzięki czemu mogą one działać jednocześnie w eksperymencie. Wykorzystanie wszystkich sześciu kanałów pozwala na zarejestrowanie około 1200 wschodzących pszczół w jednym eksperymencie. Według naszej wiedzy jest to największa próbka spośród wszystkich obecnych systemów mierzących pojawianie się owadów i pozwoliła nam zaobserwować wzorce pojawiania się na małą skalę w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Wreszcie, nasz system korzysta z faktu, że większość części jest drukowana w 3D. W ten sposób powstają precyzyjnie zwymiarowane komponenty, co zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia błędów (takich jak zatkanie detektora) podczas pracy. Pozwala również na dostosowanie do innych systemów badawczych.
Celem tego protokołu jest zbudowanie precyzyjnego i zautomatyzowanego systemu do pomiaru pojawiania się owadów, do badania zagadnień z zakresu chronobiologii i fizjologii stresu. System ten był i nadal będzie miał kluczowe znaczenie w badaniu pytań bez odpowiedzi związanych z wzorcami pojawiania się owadów w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Tutaj opisujemy jego montaż i zastosowanie do wykrywania pojawienia się pszczoły tnącej liście lucerny, Megachile rotundata w warunkach laboratoryjnych. System jest zautomatyzowany za pomocą programowalnego mikrokontrolera i konfigurowalny za pomocą części drukowanych w 3D. Drukowane stojaki utrzymują na miejscu probówki zawierające komórki gniazda pszczół po metalowej kulce. Po wynurzeniu metalowa kulka jest uwalniana ze stojaka, przechodząc przez czujnik podczerwieni rejestrujący datę i godzinę wynurzenia na kartę SD. Obecny projekt jest zoptymalizowany pod kątem M. rotundata, ale z niewielkimi poprawkami może zostać dostosowany do innych gatunków owadów.
Protokół
1. Budowa systemu
- Używając filamentu PLA, wydrukuj następującą liczbę części dla każdego budowanego kanału: 1 kolektor kolektora (collector_manifold.stl), 1 zaślepka końcowa (end_cap.stl), 6 wsporników platformy (platform_support.stl), 4 płyty podstawy stojaka na rury (base_plate.stl) i 4 płyty czołowe stojaka na rury (face_plate.stl). Przed rozpoczęciem drukowania upewnij się, że stół drukarki jest wystarczająco duży, aby można było wydrukować element. Wszystkie pliki *.stl są dostępne w danych uzupełniających.
- Z 3 wspornikami platformy i kawałkiem tektury falistej o wymiarach 33 x 30 cm, użyj gorącego kleju, aby zmontować 2 platformy stojaków na rury na każdy budowany kanał, jak pokazano na Rysunek 2. Tektura falista może być nacięta z jednej strony w każdym rogu, aby umożliwić gięcie.
- Zainstaluj elektronikę w kolektorze kolektora.
- rezystor 120 Ω do anody (dłuższej nogi) zarówno emitera podczerwieni, jak i detektora podczerwieni, a przewód o długości ~5 cm 22 GA do obu katod. Użyj różnych kolorów przewodów, aby uniknąć nieporozumień w późniejszych krokach.
- Ostrożnie włóż czujkę do jednego gniazda kolektora kolektora (zaznaczonego na niebiesko w Rysunek 3), a emiter do drugiego gniazda (zaznaczonego na czerwono). Oba elementy powinny ściśle przylegać.
- Przeprowadź przewody detektora przez kanał okablowania (zaznaczony na żółto w Rysunek 3) i przeciągnij wszystkie cztery przewody przez otwór dostępowy (zaznaczony na zielono). Upewnij się, że żadne nieosłonięte przewody się nie stykają, używając gorącego kleju, aby zabezpieczyć je na miejscu.
- wszystkie cztery przewody do gniazda RJ45 (Ethernet), używając tylnego rzędu pinów. Obie anody powinny być przylutowane do skrajnego lewego pinu, katoda emitera do skrajnego prawego pinu, a katoda detektora do jednego ze środkowych pinów (Rysunek 4).
- Przymocuj gniazdo RJ45 nad otworem dostępowym do kolektora kolektora (zaznaczonym na zielono w Rysunek 3) gorącym klejem, upewniając się, że żadne nieosłonięte przewody nie stykają się wewnątrz kolektora.
- Zbuduj kolektor spadających kul (1 na budowany kanał), jak pokazano na Rysunek 5
- Za pomocą jednego przewodowego kolektora kolektora, jednej zaślepki i odcinka z tektury falistej o wymiarach 24 x 30 cm, użyj gorącego kleju, aby połączyć podstawę urządzenia (czerwone, zielone i jasnoszare elementy Rysunek 5).
- Użyj odcinka tektury falistej o wymiarach 8 x 27 cm, aby dodać opadającą rampę kulkową do kolektora (ciemnoszary element Rysunek 5). Konstrukcja zaślepki końcowej i kolektora kolektora zawiera półki zapewniające prawidłowe umieszczenie. Sprawdź, czy przejście od rampy do kolektora jest płynne, aby uniknąć zacięć podczas użytkowania.
- Skonstruuj centralny procesor dla systemu (zgodnie z opisem w Rysunek 6).
- Wydrukuj niestandardową płytkę drukowaną do budowy systemu. Wszystkie pliki potrzebne do wydruku na płytce PCB są dostępne w danych uzupełniających.
- żeńskie złącza header na otworach przelotowych oznaczonych dla następujących instalacji: Arduino Nano, temp, zegar, moduł SD i ekran wyświetlacza ciekłokrystalicznego (LCD) (nieoznaczony obszar otworu przelotowego 2 x 5 w lewym górnym rogu płytki PCB).
- Zatrzaśnij i sześć gniazd RJ45 wzdłuż dolnej krawędzi płytki PCB.
- sześć rezystorów ściągających 470 kΩ w miejscach otworów przelotowych znajdujących się tuż nad gniazdami RJ45.
- Zainstaluj Arduino Nano, czujnik temperatury i wilgotności DHT, zegar i moduł SD na płytce PCB. Czujnik temperatury i wilgotności DHT powinien zostać przetestowany przed użyciem w eksperymentach, aby zapewnić dokładność.
- Podłącz przewód taśmowy z 10 złączami do złącza ekranu LCD płytki PCB. drugi koniec przewodu taśmowego do ekranu LCD tak, aby piny ekranu odpowiadały pinom Arduino, jak zaznaczono w Rysunek 4. Więcej informacji na temat okablowania LCD można znaleźć na stronie https://Learn.adafruit.com/character-lcds/wiring-a-character-lcd.
- Programowanie systemu
- Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję Arduino IDE dla odpowiedniego systemu operacyjnego z www.arduino.cc.
- Przy pierwszym użyciu zainstaluj biblioteki Arduino dla zegara czasu rzeczywistego (github.com/adafruit/RTClib) i czujnika temperatury/wilgotności (github.com/adafruit/DHT-sensor-library). Ustaw zegar na bieżący czas lokalny za pomocą skryptu ds1307 dołączonego do biblioteki.
- Wgraj systemowy skrypt Arduino, dostępny w danych uzupełniających.
2. Korzystanie z systemu
- Zmontuj system, jak pokazano na Rysunek 7. Dla każdego używanego kanału, jeden kolektor z opadającą kulą (zmontowany w kroku 1.4) powinien być otoczony z obu stron platformą rackową (zmontowaną w kroku 5.1). Użyj taśmy pakowej, aby przytrzymać kawałki razem i stworzyć gładką, zaokrągloną krawędź na platformie stojaka.
- Skonfiguruj nieużywane kanały, aby uniknąć fałszywych alarmów. Ponieważ system opiera się na słabym sygnale w celu wykrycia zdarzenia (detektor podczerwieni nie odbiera sygnału z emitera podczerwieni), nieużywane kanały muszą być odpowiednio skonfigurowane, aby uniknąć fałszywych sygnałów dodatnich. Można to osiągnąć na jeden z dwóch sposobów.
- Dezaktywuj nieużywane kanały w oprogramowaniu, komentując pętle odpowiadające nieużywanym kanałom. W Arduino IDE można to osiągnąć, dodając "/*" przed niepotrzebnymi pętlami i "*/" na ich końcu.
- Dezaktywuj nieużywane kanały za pomocą prostego dostosowania sprzętowego. Po prostu ze sobą przewody #6 i #8 (zwykle stałe brązowe i zielone przewody dostępnego na rynku cat 6) i włóż do pustego gniazda RJ45 w centralnym procesorze.
- Załaduj i umieść stojaki na probówki bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.
- Upewnij się, że wszystkie otwory zawierają probówkę do mikrowirówki o pojemności 0.5 ml ze zdjętą nakrętką i że probówki są dobrze dopasowane.
- Napełnij każdą tubę jedną komórką czerwiową owada, etui na poczwarkę lub kokon, jednym kulką airsoftową i na koniec jedną metalową kulką. Upewnij się, że płaska krawędź boczna (nasadka) komórki czerwiowej jest skierowana w stronę airsoftowego pelletu i metalowej kulki. Przymocuj płytę czołową stojaka na rury, zaokrągloną krawędzią w kierunku dolnej części stojaka, za pomocą nylonowych 1/4 cala.
- Umieść stojaki na probówki na platformie stojaka, tak aby otwór był skierowany w stronę kolektora spadającej piłki. Stojaki powinny być umieszczone na samej krawędzi platformy, tak aby metalowa kulka mogła swobodnie wpaść do kolektora, nie odbijając się od innej części konstrukcji (Rysunek 7). Umieszczając stojak, zacznij od otworu skierowanego do góry, a następnie delikatnie obróć na miejsce, aby upewnić się, że metalowe kulki nie zostaną zwolnione. Stojaki są zaprojektowane tak, aby rurki po prawidłowym umieszczeniu lekko odchylały się do tyłu, zmniejszając ryzyko przypadkowego wypuszczenia metalowych kulek.
- Włóż kartę SD do adaptera, a następnie uruchom centralny procesor, podłączając złącze micro-USB do Arduino, a drugi koniec do dowolnego odpowiedniego adaptera USB. Ekran LCD wyświetli cyfry od jednego do sześciu, gdy będzie gotowy. Wrzuć pojedynczą metalową kulkę do kolektora kulek każdego kanału i obserwuj, czy odpowiednia liczba pojawi się na ekranie i czy na dole ekranu pojawi się właściwy czas.
- Jeśli prawidłowy czas nie jest wyświetlany, powtórz kroki 1.6.3 i 1.6.4, aby zresetować zegar.
- Jeśli testowana metalowa kulka nie zostanie zarejestrowana, kolektor zostanie zablokowany. Sprawdź wizualnie, czy nie ma blokady i uruchom ponownie system.
- Jeśli kanał "zlicza" jedno zdarzenie na sekundę, oznacza to, że kanał nie jest prawidłowo podłączony. Sprawdź wszystkie połączenia i uruchom ponownie system.
3. Zakończenie eksperymentu i analiza danych
- Po zakończeniu wynurzania (patrz wyniki i rysunki 8 i 9 dla przykładów skali czasu), wyłącz urządzenie, odłączając Arduino. Stojaki można zdemontować i wyczyścić w celu ponownego użycia.
- Podczas eksperymentu dane są przechowywane na karcie SD w pliku rozdzielanym przecinkami (CSV) dostępnym przez język programowania R. Użyj karty SD, aby przesłać dane do komputera, a RStudio do automatycznego generowania wykresów bąbelkowych danych.
- Zarówno dane o zdarzeniu, jak i o temperaturze są zapisywane w tym samym pliku w celu zapewnienia integralności danych. W związku z tym przed analizą należy zakończyć pewne przetwarzanie. Zaimportuj plik rozdzielany przecinkami do programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Kolumny I i J to data i godzina pojawienia się pszczół; utwórz kolumny A i B, wycinając i wklejając kolumny A-E do drugiego arkusza kalkulacyjnego i zapisz jako osobny plik, to są dane dotyczące temperatury.
- Kolumna tytułu A z tekstem "Data" i kolumna B "Godzina", a następnie posortuj dane według kolumny A, a następnie według B. Zapisz jako plik CSV.
- Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję programu RStudio z https://www.r-project.org/. Pomoc w korzystaniu z programu RStudio do przekazywania i analizowania danych można znaleźć tutaj pod adresem https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.html.
- Korzystając ze skryptu języka R dostępnego w danych uzupełniających, przekaż dane do programu RStudio. Zmień miejsce docelowe pracy w skrypcie języka R, aby pasowało do miejsca, w którym znajduje się program Excel *. Znajduje się plik CSV. Uruchom skrypt i wybierz plik danych do analizy. Wpisz "działka" w konsoli języka R. Wykres bąbelkowy będzie zlokalizowany w miejscu docelowym pracy o nazwie "High-res; " Zmień nazwę tego pliku, aby zapisać go jako plik TIFF o wysokiej rozdzielczości (300 dpi).
Wyniki
Wylęganie M. rotundata przebiega asynchronicznie w przypadku braku ekspozycji na sygnał środowiskowy, a proces ten odbywa się równomiernie w ciągu dnia4. Jednakże po ekspozycji na termoperiod o przebiegu prostokątnym (termoperiod 4° C) wylęganie staje się synchroniczne z termofazą4,5. Wynik ten jest zbieżny z innymi badaniami, w których wykazano, że owady wykorzystują sygnały termoperiodyczne do regulacji wylęgania, w tym muchówka Sarcophaga crassipalpis6, muszka cebulowa Delia atiqua7 oraz zapachowiec bawełniany Anthonomus grandis grandis8. Jedno z badań wykazało, że stres podczas rozwoju wpływa na synchronizację wylęgania osobników dorosłych u S. crassipaplpis9. W niniejszej pracy przedstawiamy wyniki uzyskane dla M. rotundata poddanych stresowi podczas rozwoju, aby przetestować hipotezę, że taka procedura powoduje desynchronizację wylęgania osobników dorosłych.
Prawidłowy przebieg
Użytkownik powinien sprawdzić ekran LCD przed otwarciem inkubatora, aby upewnić się, że owady nie wykluwają się już z kokonów. Po zakończeniu eksperymentu należy wyjąć kartę SD, a dane można wyeksportować do programu RStudio jako plik rozdzielany przecinkami, aby zwizualizować je w formie wykresu bąbelkowego, zgodnie z wcześniejszym opisem. Rycina 8 przedstawia wykluwanie się pszczół w termoperiodzie 4° C po ekspozycji na stres zimna podczas rozwoju. Czerwony celownik wskazuje medianę czasu i dnia wykluwania, a tytułem jest nazwa pliku. Ten skrypt R powinien służyć do wizualizacji danych, ale nie powinien być jedyną metodą analizy. Aby przeanalizować odpowiedź wykluwania na sygnał środowiskowy, dane można poddać analizie rytmiczności (patrz Analiza).
Powikłanie
Gdy czujnik zostanie zapchany metalowymi kuleczkami BB, brak sygnału jest wielokrotnie zliczany, co prowadzi do powstania licznych fałszywych punktów danych. Rycina 9 przedstawia ten sam zestaw danych co na Rycina 8, ale z jednym z sześciu kanałów zapchanym kuleczkami BB, co powoduje powstanie dużej bańki na wykresie. W przypadku zapchania czujnika dane z tego kanału można łatwo usunąć z analizy. Wykorzystanie wielu kanałów w eksperymencie jest korzystne, ponieważ minimalizuje wpływ zapchania pojedynczego czujnika.
Analiza
Analizę danych pod kątem występowania synchronizacji można przeprowadzić poprzez obliczenie „parametru R”, czyli statystyki skalarnej, która pozwala określić, czy proces wylochania jest rytmiczny czy arytmiczny10,11,12. Odbywa się to poprzez wyznaczenie najwyższej liczby osobników wyłochania w oknie 8-godzinnym, podzielenie tej liczby przez liczbę osobników wylochających się poza tym 8-godzinnym oknem, a następnie pomnożenie wyniku przez 100. Wszystkie osobniki, które się wylochały, powinny zostać zgromadzone w jednej puli, aby obliczyć liczbę wyłochania dla każdej godziny doby. Teoretyczny zakres parametru R wynosi od 0 (całe wylochanie następuje w określonym przedziale czasowym) do 200 (wylochanie jest rozłożone równomiernie w ciągu dnia)10. Wartości R < 60 uznaje się za wylochanie rytmiczne, 60 < R < 90 za słabo rytmiczne, a R > 90 za arytmiczne. Wartości R > 150 wskazują na równomierny rozkład wylochania10. Rysunek 8 pokazuje, że wylochanie jest rytmiczne przy parametrze R = 20,21 < 60. Ze względu na to, że tego typu dane są rozłożone wokół powtarzającego się cyklu 24-godzinnego, dla bardziej rzetelnej analizy należy zastosować statystykę kołową (szczegółowo opisaną w pracy Bennett et al., 20185). Można to zrealizować za pomocą pakietów statystyki kołowej dostępnych dla RStudio (pakiet 'circular' – CRAN.R-project.org).
Rycina 1: Komponenty wytworzone addytywnie. Przy użyciu filamentu PLA wydrukuj w technologii 3D części niezbędne do budowy systemu. Dla każdego konstruowanego kanału wymagane są następujące części: 1 rozdzielacz kolektora (zielony), 1 zaślepka (czerwona), 6 wsporników platformy (pomarańczowe), 4 płyty podstawy statywu na probówki (fioletowe) oraz 4 płyty czołowe statywu na probówki (żółte). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Montaż platformy stojaka na probówki. Użyj kleju na gorąco, aby zmontować dwie platformy stojaka na probówki na każdy konstruowany kanał. Wykorzystaj trzy podpory platformy (zaznaczone na pomarańczowo) z fragmentem tworzywa sztucznego falistego (zaznaczonego na szaro). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Zdjęcie rentgenowskie kolektora. Wsuń jeden detektor podczerwieni do jednego gniazda kolektora (zaznaczonego na niebiesko), a emiter do drugiego gniazda (zaznaczonego na czerwono). Przeciągnij przewody detektora przez kanał okablowy (zaznaczony na żółto), a następnie wszystkie cztery przewody przez otwór dostępowy (zaznaczony na zielono). Upewnij się, że żadne gołe przewody się nie stykają, używając kleju na gorąco do ich unieruchomienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Okablowanie złączy. Schemat okablowania gniazda RJ45 przed przymocowaniem do kolektora, widziany od dołu gniazda, oraz tabela okablowania dla połączenia ekranu LCD z procesorem centralnym. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 5: Zespół kolektora piłek. Używając jednej zaślepki (zaznaczonej na czerwono), jednego rozdzielacza kolektora (zaznaczonego na zielono) oraz kawałka plastikowej płyty kanelowanej o wymiarach 24 x 30 cm (zaznaczonego na jasnoszary kolor), zmontuj obudowę zespołu kolektora piłek. Do dodania rampy użyj kawałka plastikowej płyty kanelowanej o wymiarach 8 x 27 cm (zaznaczonego na ciemnoszary kolor). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Płytka PCB procesora centralnego. Płytka PCB procesora centralnego składa się z warstwy dolnej (kolor zielony), warstwy górnej (kolor czerwony) oraz warstwy sitodruku (kolor niebieski). Przylutuj żeńskie złącza do wszystkich otworów przelotowych, z wyjątkiem tych przeznaczonych dla gniazd RJ45 (wzdłuż dolnej krawędzi) oraz rezystorów podciągających do masy (bezpośrednio nad polami RJ45). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Montaż końcowy. Podczas użytkowania aparat powinien być zmontowany z platformą statywu na probówki po obu stronach każdego używanego kolektora kulek. Statywy na probówki z przymocowanymi płytkami czołowymi powinny być ustawione tak, aby znajdowały się na samej krawędzi platformy statywu na probówki, co zmniejsza ryzyko odbicia się wypadających kulek BB od aparatu. Wymiary podstawy zmontowanego aparatu wynoszą około 25 cm x 35 cm, a wysokość 20 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 8: Wykres typowego przebiegu eksperymentalnego po przetworzeniu w programie R. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 9: Wykres z eksperymentu, w którym wystąpiło zapchanie detektora, co obrazuje stosunkowo duży bąbel w dniu 4. Zapchany kanał można usunąć z analizy, zachowując tym samym pozostałe punkty danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Przedstawiamy protokół montażu i użytkowania systemu, który pozwala na precyzyjny pomiar czasu pojawienia się owadów. System ten rozwiązuje dwa problemy, które ograniczały poprzednie projekty: częściową automatyzację i ograniczoną wielkość próby. Rozwiązaliśmy te problemy, automatyzując zbieranie danych za pomocą mikrokontrolerów, co umożliwiło nam również zwiększenie wielkości próby poprzez wykorzystanie wielu kanałów. Obecny projekt ma sześć kanałów, które mogą pomieścić łącznie 1200 pszczół. W razie potrzeby można dodawać lub odejmować dodatkowe kanały, co pozwala nie tylko na zwiększenie wielkości próby, ale także na jednoczesne badanie efektów wielu zabiegów. Poniżej omówiono krytyczne kroki, modyfikacje, ograniczenia i przyszłe zastosowania.
Jedyną częścią systemu, która nie jest zautomatyzowana, jest załadunek na stojaki komórek lęgowych, metalowych kulek i śrutu airsoftowego na początku eksperymentu. Chociaż stojaki są zaprojektowane tak, aby lekko odchylały się do tyłu, aby zapobiec upadkowi metalowych kulek, gdy stojaki stoją pionowo, należy zachować ostrożność podczas umieszczania stojaków, aby zapobiec przypadkowemu wypuszczeniu metalowych kulek. Upewnij się również, że stojaki są zlicowane z krawędzią półki, tak aby trajektoria opadania metalowej kulki pokrywała się z pasem startowym. Na koniec należy usunąć resztki liści z pasa startowego, a podwozie, w którym znajdują się metalowe kulki z poprzednich eksperymentów, aby zapobiec zablokowaniu czujnika. Dane są automatycznie zapisywane na karcie SD jako plik CSV, a skrypt jest zapisywany w taki sposób, że Arduino nie będzie działać, jeśli nie ma karty SD. Plik danych jest ręcznie importowany do programu RStudio i wizualizowany przy użyciu wspomnianego wcześniej skryptu języka R. Ten skrypt automatycznie narysuje dane jako wykres bąbelkowy i określi medianę czasu i dnia pojawienia się. Skrypt Arduino jest napisany w celu dołączenia danych o zdarzeniach na końcu pliku, co zapobiega utracie danych w przypadku awarii zasilania. Oznacza to jednak również, że po wyodrębnieniu danych z karty SD wszystkie pliki powinny zostać wyczyszczone przed następnym eksperymentem.
Modyfikacje plików programu SketchUp można wprowadzić w celu dostosowania rozmiaru stojaków do owadów o różnych rozmiarach, przy czym w zmodyfikowanych stojakach używane są rurki o różnych rozmiarach. Nie bez znaczenia jest również wielkość śrutu airsoftowego, który zapobiega wydostawaniu się owada z tuby, a także mogą być potrzebne granulki o różnych rozmiarach. W skrypcie języka R można wprowadzić wiele różnych zmian, aby zmienić wygląd wykresów bąbelkowych i innych parametrów graficznych.
Zmniejszyliśmy ryzyko fałszywych alarmów, pisząc kod debounce, który wyłącza dowolny kanał na jedną sekundę po wykryciu metalowej kulki, zapobiegając w ten sposób liczeniu pojedynczej metalowej kulki jako wielu punktów danych. Chociaż stwarza to możliwość pominięcia punktu danych, jeśli wiele pszczół pojawi się jednocześnie, ale fakt, że kanały są niezależne, zmniejsza to ryzyko. Kolejnym ograniczeniem obecnego systemu jest to, że poszczególne punkty danych nie są dostrzegalne, tj. spadającej metalowej kulki nie można prześledzić wstecz do konkretnej osoby. Co więcej, obecny system mierzy rytmy wynurzania, ale nie rytmy eklozji u M. rotundata, ale mierzyłby rytmy eklozji u gatunków, u których pojawienie się i eklozja są synonimami. Wreszcie, obecna konstrukcja nie jest odporna na warunki atmosferyczne, co ogranicza jej zastosowanie do kontrolowanych środowisk.
Przyszłe zastosowania obejmują badanie wpływu innych abiotycznych i biotycznych sygnałów środowiskowych na czas pojawienia się M. rotundata. Ponadto, ponieważ owady zamieszkują różne środowiska, odpowiednie sygnały środowiskowe różnią się w zależności od gatunku. W związku z tym włączenie większej liczby gatunków owadów jest ważne dla zbadania, w jaki sposób systemy okołodobowe ewoluowały w różnych taksonach. Niewiele wiadomo na temat tego, jak warunki rozwojowe wpływają na czas pojawienia się dorosłego osobnika; Dlatego nasz system może być używany do rozszyfrowywania wpływu zabiegów na pojawienie się. Co więcej, kombinacje sygnałów środowiskowych mogą wpływać na reakcje owadów, dlatego przyszłe eksperymenty powinny uwzględniać wiele wskazówek środowiskowych, aby zrozumieć ich względny wpływ na pojawienie się. Wreszcie, interesujące jest zastosowanie w terenie w celu obserwacji, w jaki sposób naturalne warunki pośredniczą w rytmach wschodzących. Łatwość użycia tego systemu i jego unikalne połączenie wytwarzania przyrostowego, programowania typu open source i obserwowalnych cech biologicznych sprawiają, że jest on kandydatem do zastosowania w środowisku edukacyjnym.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować grupie roboczej Kriobiologii i Ekofizjologii Owadów w Fargo, ND za ich pomocne opinie na temat eksperymentów z użyciem opisanego systemu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Filament do drukarki PLA | www.lulzbot.com | różne | Numer katalogowy różni się w zależności od koloru |
| 0,5 ml probówki do mikrowirówek | www.daigger.com EF4254C | ||
| 4,5 mm rozmiar "bb" metalowe granulki www.amazon.com | B00419C1IA | Daisy 4,5 mm granulki metalowe | |
| BB 6,0 mm plastikowe granulki "softair" | www.amazon.com | B003QNELYE | Pellet airsoftowy Crosman 6 mm |
| Plastikowa blacha korekcyjna | www.lowes.com | 345710 | Blacha falista z tworzywa sztucznego |
| Para emmitera/detektora podczerwieni | www.amazon.com B00XPSIT3O | średnicy 5 mm, długości fali 940 | |
| nm Sprężyny 120 omów | www.amazon.com | B01MSZK8DV | 120 omów, 1/4 W |
| 22 GA przewód połączeniowy | www.adafruit.com | 1311 | |
| Gniazda RJ45 | www.sparkfun.com | PRT-00643 | |
| Niestandardowa płytka PCB | www.pcbexpress.com | nie dotyczy | Można wydrukować z plików zawartych w danych uzupełniających |
| Arduino Nano v 3.0 | www.roboshop.com | RB-Gra-01 | |
| www.amazon.com | DFR0071 | Moduł karty SD DFRobot | |
| Moduł zegara czasu rzeczywistego | www.adafruit.com | 264 | DS1307 Płytka wyprowadzająca zegar czasu rzeczywistego |
| Czujnik temperatury/wilgotności | www.tinyosshop.com | G4F4494F29ED05 | Czujnik temperatury/wilgotności DHT11 na płytce rozdzielającej |
| Rezystory 470k Ohm | www.amazon.com | B00EV2R39Y | |
| Złącza żeńskie | www.adafruit.com | 598 | Oderwij do żądanej długości |
| Męskie nagłówki | www.adafruit.com | 392 | Oderwij na żądaną długość |
| Przewód taśmowy | www.amazon.com | B00X77964O | 10-żyłowy przewód taśmowy ze złączami |
| Ekran LCD | www.adafruit.com | 198 | |
| Cat6 | www.amazon.com | B00N2VISLW | |
| karta SD | www.amazon.com | B00E9W1URM |
Bibliografia
- Lankinen, P. Geographical variation in circadian eclosion rhythm and photoperiodic adult diapause in Drosophila littoralis. Journal of Comparative Physiology A. 159, 123-142 (1986).
- Watari, Y. Comparison of the circadian eclosion rhythm between non-diapause and diapause pupae in the onion fly, Delia antiqua. Journal of Insect Physiology. 48, 83-89 (2002).
- Zimmerman, W. F., Pittendrigh, C. S., Pavlidis, T. Temperature compensation of the circadian oscillation in Drosophila pseudoobscura and its entrainment by temperature cycles. Journal of Insect Physiology. 14, 669-684 (1968).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Yocum, I. S., Kemp, W. P., Greenlee, K. J. Thermoperiodism synchronizes emergence in the alfalfa leafcutting bee (Hymenoptera: Megachilidae). Environmental Entomology. 45, 245-251 (2016).
- Bennett, M. M., Rinehart, J. P., Yocum, G. D., Doetkott, C., Greenlee, K. J. Cues for cavity nesters: Investigating relevant Zeitgebers for emerging leafcutting bees, Megachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae). Journal of Experimental Biology. 221, jeb175406(2018).
- Miyazaki, Y., Goto, S. G., Tanaka, K., Saito, O., Watari, Y. Thermoperiodic regulation of the circadian eclosion rhythm in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis. Journal of Insect Physiology. 57, 1249-1258 (2011).
- Watari, Y., Tanaka, K. Effects of background light conditions on thermoperiodic eclosion rhythm of onion fly Delia antiqua. Entomological Science. 17, 191-197 (2014).
- Greenberg, S. M., Armstrong, J. S., Setamou, M., Coleman, R. J., Liu, T. X. Circadian rhythms of feeding, oviposition, and emergence of the boll weevil (Coleoptera: Curculionidae). Insect Science. 13, 461-467 (2006).
- Yocum, G. D., Zdarek, J., Joplin, K. H., Lee, R. E., Smith, D. C., Manter, K. D., Denlinger, D. L. Alteration of the eclosion rhythm and eclosion behavior in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis, by low and high temperature stress. Journal of Insect Physiology. 40, 13-21 (1994).
- Winfree, A. Integrated view of resetting a circadian clock. Journal of Theoretical Biology. 28, 327-374 (1970).
- Watari, Y., Tanaka, K. Interacting effect of thermoperiod and photoperiod on the eclosion rhythm in the onion fly, Delia antiqua supports the two-oscillator model. Journal of Insect Physiology. 56, 1192-1197 (2010).
- Short, C. A., Meuti, M. E., Zhang, Q., Denlinger, D. L. Entrainment of eclosion and preliminary ontogeny of circadian clock gene expression in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis. Journal of Insect Physiology. 93, 28-35 (2016).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Wykrywanie wyklucia owad wautomatyczny monitoring owad wsystem z mikrokontrolerem Arduinokomponenty wydrukowane w 3Dwykres p cherzykowy w j zyku Rchronobiologia i fizjologia stresuwielokana owe przesy anie danychprzechowywanie danych na karcie SDdetektor z emiterem podczerwienizestaw statywu z prob wkami
