Artykuł metodologiczny

Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58368

⸱

2 października 2018

 ,  ,  , 
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Peptydy bogate w cysteinę składają się w odrębne trójwymiarowe struktury w zależności od ich połączeń dwusiarczkowych. Ukierunkowana synteza pojedynczych izomerów dwusiarczkowych jest wymagana, gdy utlenianie buforu nie prowadzi do pożądanego połączenia dwusiarczkowego. Protokół dotyczy selektywnej syntezy peptydów z wiązaniami 3-dwusiarczkowymi oraz ich analizy strukturalnej z wykorzystaniem badań NMR i MS/MS.

Streszczenie

Peptydy z dużą ilością cystein są zazwyczaj pod wpływem ich dwusiarczkowej struktury pod wpływem ich dwusiarczkowej struktury. Dlatego bardzo ważne jest, aby uniknąć niepożądanego tworzenia się wiązań dwusiarczkowych podczas syntezy peptydów, ponieważ może to skutkować zupełnie inną strukturą peptydów, a co za tym idzie zmienioną bioaktywnością. Jednak prawidłowe tworzenie wielu wiązań dwusiarczkowych w peptydzie jest trudne do uzyskania przy użyciu standardowych metod samofałdowania, takich jak konwencjonalne protokoły utleniania buforowego, ponieważ może powstać kilka połączeń dwusiarczkowych. Protokół ten stanowi zaawansowaną strategię wymaganą do ukierunkowanej syntezy wielu peptydów z mostkami dwusiarczkowymi, których nie można zsyntetyzować poprzez utlenianie buforowe w wysokiej jakości i ilości. W badaniu wykazano zastosowanie odrębnej strategii grupy ochronnej do syntezy wszystkich możliwych izomerów peptydowych wiązanych 3-dwusiarczkiem μ-konotoksyny PIIIA w ukierunkowany sposób. Peptydy są przygotowywane w procesie syntezy peptydów w fazie stałej na bazie Fmoc przy użyciu strategii grupy ochronnej do tworzenia określonych wiązań dwusiarczkowych. Odpowiednie pary cystein są chronione grupami ochronnymi trytylu (Trt), acetamidometylu (Acm) i tert-butylu (tBu), aby upewnić się, że podczas każdego etapu utleniania tylko wymagane cysteiny są odchronione i połączone. Oprócz ukierunkowanej syntezy stosuje się kombinację kilku metod analitycznych w celu wyjaśnienia prawidłowego fałdowania i generowania pożądanych struktur peptydowych. Porównanie różnych izomerów wiązań 3-dwusiarczkowych wskazuje na znaczenie dokładnego określenia i znajomości połączeń dwusiarczkowych dla obliczenia trójwymiarowej struktury i interpretacji aktywności biologicznej izomerów peptydowych. Charakterystyka analityczna obejmuje dokładne wyjaśnienie wiązań dwusiarczkowych za pomocą analizy tandemowej spektrometrii mas (MS/MS), która jest wykonywana z częściowo zredukowanymi i alkilowanymi pochodnymi nienaruszonego izomeru peptydowego wytwarzanego przez dostosowany protokół. Ponadto struktury peptydowe są oznaczane za pomocą eksperymentów 2D magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz wiedzy uzyskanej z analizy MS/MS.

Wprowadzenie

Wykorzystanie bioaktywnych peptydów w badaniach i rozwoju farmaceutycznym jest wysoko cenione, ponieważ reprezentują one silne i wysoce selektywne związki dla określonych celów biologicznych1. Jednak ze względu na ich bioaktywność trójwymiarowa struktura ma ogromne znaczenie w celu przeprowadzenia badań zależności struktura-aktywność2,3,4. Oprócz pierwszorzędowej sekwencji aminokwasów, która wpływa na ogólną konformację, wiązania dwusiarczkowe znacząco stabilizują strukturę peptydów bogatych w cysteinę5. Wiele peptydów dwusiarczkowych obejmuje konotoksyny, takie jak μ-PIIIA z Conus purpurascens, który zawiera sześć cystein w swojej sekwencji. Ta wysoka zawartość cysteiny teoretycznie pozwala na tworzenie 15 izomerów dwusiarczku. Prawidłowa łączność dwusiarczkowa jest bardzo ważna dla aktywności biologicznej6,7. Nasuwa się jednak pytanie, czy istnieje więcej niż jedna bioaktywna konformacja naturalnie występujących peptydów, a jeśli tak, to który z tych izomerów ma najwyższą aktywność biologiczną? W przypadku μ-konotoksyn celami biologicznymi są kanały jonowe sodu bramkowane napięciem, a w szczególności μ-PIIIA jest najsilniejsza dla podtypów NaV1.2, NaV1.4 i NaV1.73.

Synteza peptydów z mostkami dwusiarczkowymi może być osiągnięta przy użyciu różnych metod. Najwygodniejszą metodą tworzenia wiązań dwusiarczkowych w peptydzie jest tak zwane podejście samozawijające się oksydacyjnie. W tym przypadku liniowy prekursor pożądanego peptydu cyklicznego jest syntetyzowany najpierw za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej, która następuje po rozszczepieniu z nośnika polimerowego poddanego utlenianiu w układzie buforowym. Środki aktywne redoks, takie jak zredukowany i utleniony glutation (GSH/GSSG), są często dodawane w celu promowania tworzenia wiązań dwusiarczkowych. Główną wadą samofałdowania wspomaganego buforem jest to, że wiązania dwusiarczkowe nie są tworzone selektywnie w sposób stopniowy. W porównaniu z natywnym peptydem, dla którego często opisywany jest tylko jeden konkretny izomer dwusiarczkowy, możliwe jest otrzymanie wielu innych izomerów za pomocą tego podejścia8. Wykazano już, że μ-PIIIA powoduje co najmniej trzy różnie pofałdowane izomery po samofałdowaniu w poprzednim badaniu3. Rozdzielenie takiej mieszaniny izomerów jest raczej trudne ze względu na podobne czasy retencji przy użyciu metod oczyszczania chromatograficznego9. Ukierunkowana synteza określonego izomeru jest zatem korzystna. Aby specyficznie wytworzyć izomer o zdefiniowanym łączeniu dwusiarczkowym, wymagana jest specjalna strategia, w której wiązania dwusiarczkowe są kolejno zamykane. W związku z tym na nośniku polimerowym syntetyzuje się liniowy prekursor przenoszący odrębne grupy ochronne w poszczególnych parach cysteiny. Po eliminacji pary cysteiny są pojedynczo i kolejno dechronione i łączone w reakcji utleniania w celu uzyskania pożądanych wiązań dwusiarczkowych10,11,12,13,14,15,16. Po syntezie i oczyszczeniu produktu reakcji wymagane jest potwierdzenie tożsamości i połączenia dwusiarczkowego za pomocą odpowiednich metod analitycznych. Dostępnych jest wiele metod analitycznych do wyjaśnienia sekwencji aminokwasów pierwszorzędowych, np. MS/MS, podczas gdy oznaczanie połączeń dwusiarczkowych nadal pozostaje znacznie mniej zbadane. Oprócz złożoności takich peptydów z wieloma wiązaniami dwusiarczkowymi, zanieczyszczenia związane z produktem (np. z mieszania dwusiarczkowego), wynikające z przygotowania i obróbki próbki, mogą jeszcze bardziej skomplikować analizę. W niniejszej pracy pokazujemy, że zastosowanie kombinacji różnych technik analitycznych jest niezbędne do jednoznacznego wyjaśnienia tożsamości wiązań dwusiarczkowych w izomerach μ-PIIIA. Połączyliśmy metody chromatograficzne ze spektrometrią mas i dostarczyliśmy te same próbki do spektroskopii NMR. W analizie MS / MS wspomaganej matrycą desorpcji/jonizacji laserowej (MALDI) zidentyfikowaliśmy wiązania dwusiarczkowe za pomocą częściowej redukcji i derywatyzacji jodoacetamidowej, ponieważ analiza odgórna nie jest możliwa dla tego peptydu. Przeprowadzono eksperymenty 2D NMR w celu uzyskania trójwymiarowej struktury każdego izomeru. W ten sposób, łącząc różne wyrafinowane metody analityczne, możliwe jest prawidłowe wyjaśnienie łączności dwusiarczkowej i trójwymiarowej struktury złożonych peptydów z wieloma wiązaniami dwusiarczkowymi7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Wszystkie aminokwasy użyte w tym artykule były w konfiguracji L. Skróty aminokwasów i pochodnych aminokwasów zostały użyte zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Nomenklatury IUB oraz Wspólnej Komisji ds. Nomenklatury Biochemicznej IUPAC-IUB.

1. Synteza peptydów w fazie stałej (SPPS)

UWAGA: Przeprowadź syntezę za pomocą syntezatora peptydów w fazie stałej. Przeprowadzić syntezę liniowych prekursorów peptydów o ogólnej sekwencji ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 przy użyciu standardowego protokołu dla chemii 9-fluorenylometylokoksykarbonylu (Fmoc). Zastosuj następujące chronione aminokwasy: Pyr(Boc (tert-butyloksykarbonyl)), Arg(Pbf (2,2,4,6,7-pentametylodihydrobenzofuran-5-sulfonylo)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) i His(Trt). Chroń pary cysteiny grupami Trt, Acm lub tBu zgodnie z zamierzonym połączeniem dwusiarczkowym.

  1. preparat
    1. Wysuszyć żywicę amidową Fmoc Rink (obciążenie: 0,28 mmol/g) za pomocą liofilizatora przez noc.
    2. Wprowadź żądaną sekwencję peptydową (1-literowy kod) do programu syntezatora. Program oblicza wymaganą ilość dla każdego odczynnika z osobna i wskazuje ilości rozpuszczalnika.
    3. Zważyć poszczególne odczynniki (aminokwasy, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylofluorofosforan)) zgodnie z protokołem i rozpuścić je w dimetyloformamidzie (DMF) do końcowego stężenia odpowiednio 0,6 M (aminokwasy) i 0,6 M (HBTU).
    4. Przenieść różne odczynniki (aminokwasy, HBTU, N-metylomorfolina (NMM, 50% w DMF), piperydyna (20% w DMF), DMF, dichlorometan (DCM)) do odpowiednich naczyń i umieścić je w odpowiednich szczelinach syntezatora peptydów w fazie stałej.
    5. Dodać 100 mg suchej żywicy do kolumn reakcyjnych i umieścić je w rakietce syntezatora. Rozpocznij syntezę peptydów w fazie stałej.
  2. Protokół SPPS (dostarczany przez syntezator)
    UWAGA: Standardowy protokół zwykle dotyczy 100 mg żywicy (obciążenie: 0,53 mmol/g) dodanego do jednej kolumny reakcyjnej w skali 53 μmol, co prowadzi do następujących równoważników: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. aminokwasów. Natomiast w przypadku PIIIA stosuje się obciążenie 0,28 mmol/g (skala 28 μmol), co daje określone wyższe ekwiwalenty.
    1. Przygotowanie żywicy
      1. Przepłucz żywicę 2500 μl DMF, 1400 μl DCM i 1400 μl DMF.
      2. Przepłukać żywicę powietrzem, aż rozpuszczalnik zostanie usunięty i spłukać żywicę 2500 μl DMF.
    2. Rozłam grupy ochronnej Fmoc
      1. Dodać 20% piperydyny w DMF (1000 μL) do żywicy i odczekać 6 minut. Usunąć roztwór z żywicy. Powtórz krok 1.2.2.1.
      2. Spłukać dwukrotnie DMF (1st 4000 μL, 2st1400 μL), przepłukać żywicę powietrzem aż do usunięcia rozpuszczalnika i dwukrotnie spłukać 2000 μl DMF.
    3. Reakcja sprzęgania
      1. Wymieszać następujące odczynniki w osobnej fiolce: HBTU (415 μL; 0,6 M w DMF; 249 μmol; 9 eq.), NMM (112 μL; 50% w DMF; 510 μmol; 18 eq.), Fmoc-aminokwas (420 μL; 0,6 M w DMF; 252 μmol; 9 eq.). Dodaj mieszaninę do żywicy i odczekaj 13 minut. Usuń roztwór z żywicy. Powtórz krok 1.2.3.1.
      2. Umyć 3000 μL DMF. Przemyć dwukrotnie 1400 μL DMF. Przemyć dwukrotnie 2000 μL DMF.
      3. Powtórzyć kroki 1.2.2 i 1.2.3 w zależności od liczby aminokwasów w sekwencji peptydowej.
    4. Końcowe rozszczepienie Fmoc i mycie żywicą
      1. Dodać 20% piperydyny w DMF (1000 μL) do żywicy i odczekać 6 minut. Usunąć roztwór z żywicy. Powtórz krok 1.2.4.1.
      2. Spłukać dwukrotnie DMF (1st 4000 μL, 2nd 1400 μL) i przepłukać żywicę powietrzem. Spłukać dwukrotnie 2000 μl DKZ, 4 razy 1400 μl DCM i dwukrotnie spłukać powietrzem.
  3. Przygotowanie
    1. Liofilizować żywicę z kolumn reakcyjnych przez noc po zakończeniu syntezy.

2. Rozszczepienie peptydu z żywicy (Rysunek 1A)

UWAGA: Podczas procedury rozszczepienia, wszystkie łańcuchy boczne aminokwasów z wyjątkiem Cys(Acm) i Cys(tBu) zostaną odbezpieczone. Protokół dotyczy 100 mg żywicy.

  1. Połącz liofilizowaną żywicę w probówce o pojemności 12 ml i schłodzić ją do 0 °C na lodzie.
  2. Do żywicy dodać 150 μl mieszaniny zmiatającej (przygotowanej z 0,75 g fenolu, 0,5 ml tioanizolu, 0,25 ml etanedithiolu) i 1 ml kwasu trifluorooctowego (TFA, 95% w wodzie (H2O)) na lodzie. Pozostawić delikatnie wstrząsając na 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Przefiltrować mieszaninę przez frytę szklaną i zebrać filtrat do probówek indywidualnie wypełnionych lodowatym eterem dietylowym (1 ml mieszaniny rozszczepienia na 8-10 ml eteru dietylowego). Peptyd wytrąca się w postaci białego ciała stałego.
  4. Przepłukać placek filtracyjny dodatkowym TFA (95% wH2O, ok. 1-3 mL).
  5. Zamknąć probówki zawierające osad i odwirować (3400 x g) zawiesiny na 1 minutę, zdekantować supernatant i przemyć granulki 8-10 ml lodowatego eteru dietylowego. Powtórz ten krok 3 razy.
  6. Pozostawić granulki bez korka na 5 minut, aby usunąć pozostałe ślady eteru dietylowego. Rozpuścić granulki surowego produktu w 1 ml tert-butanolu (80% wH2O). Peptydy należy liofilizować (-80 °C).

3. Oczyszczanie prekursora liniowego za pomocą półpreparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

UWAGA: Oczyść surowe peptydy za pomocą półpreparatywnego HPLC z odwróconymi fazami (RP) wyposażonego w kolumnę C18 (wielkość cząstek 5 μm, wielkość porów 100 A, 250 x 32 mm) i pętlę iniekcyjną 3,6 ml. Stosować gradientowy system elucji 0,1% TFA wH2O(eluent A) i 0,1% TFA w acetonitrylu (MeCN)/H2O(9:1, eluent B). Wykrywanie pików przy długości fali 220 nm.

  1. Dodać ok. 70 mg surowego peptydu do probówki o pojemności 15 ml i rozpuścić peptyd w stanie stałym w objętości pętli próbki HPLC (np. 3,6 ml). Użyć mieszaniny 0,1% TFA w MeCN/H2O (1:1). Wirować aż do całkowitego rozpuszczenia i odwirowywać (3400 x g) roztwór przez 1 minutę.
  2. Pobrać próbkę (3,6 ml) do strzykawki o pojemności 5 ml i wstrzyknąć próbkę bez pęcherzyków powietrza do pętli iniekcyjnej. Wstrzyknąć do systemu HPLC. Oddzielić mieszaninę peptydów, stosując gradient 0-50% eluentu B przez 120 minut przy natężeniu przepływu 10 ml/min.
  3. Zbierz frakcje w poszczególnych probówkach, gdy się pojawią. Po zakończeniu cyklu przygotuj wybrane frakcje do analizy spektrometrii mas (MS) i HPLC (Krok 6.1-6.2). Frakcje należy liofilizować i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Po analizie MS i HPLC połącz czyste frakcje peptydu liniowego i przygotuj próbki do pierwszego utleniania.

4. Selektywne tworzenie wiązań dwusiarczkowych

  1. 1. Utlenianie (Rysunek 1B)
    UWAGA: Podczas rozszczepiania peptydów z żywicy, Cys (Trt) są odbezpieczane, co prowadzi do dwóch niezabezpieczonych reszt Cys, które są następnie poddawane utlenianiu w celu utworzenia pierwszego wiązania dwusiarczkowego. Poniższy protokół ma zastosowanie do 15 mg liniowo oczyszczonego peptydu (2864,5 g/mol; 5,2 μmol; 1 eq.).
    1. Rozpuścić peptyd liniowy (15 mg) w 105 ml mieszaniny izopropanolu/H2O (1:2; 0,05 mM; pH 8,5 dostosowanego wodorotlenkiem sodu (NaOH)) i pozostawić delikatnie wstrząsając na powietrzu w podstawowych warunkach przez 12-48 godzin.
    2. Monitorować reakcję utleniania za pomocą HPLC i MS. Potwierdzić utworzenie pierwszego mostka przez derywatyzację jodoacetamidem (IAA) (krok 6).
    3. Proszę wyliofilizować peptyd i użyć go bez dalszego oczyszczania do 2. utleniania.
  2. 2. Utlenianie (Rysunek 1C)
    UWAGA: Podczas drugiego utleniania deprotekcja cystein chronionych przez Acm i tworzenie drugiego mostka są katalizowane przez jod. Protokół dotyczy 15 mg peptydu po 1st. oksydacji (2862,5 g/mol; 5,2 μmol; 1 eq.)
    1. Rozpuścić peptyd (15 mg; końcowe stężenie 0,05 mM) w 105 ml mieszaniny izopropanolu/H2O/1 M kwasu solnego (HCl) (80:12,5:7,5).
    2. Dodać 158 μl 0,1 M roztworu jodu w metanolu (MeOH) (15,7 μmol; 3 eq) do roztworu. Mieszać reakcję w temperaturze pokojowej przez 3-52 godzin, tj. do zakończenia utleniania.
    3. Monitorować reakcję utleniania za pomocą HPLC i MS. Potwierdzić powstanie drugiego wiązania dwusiarczkowego przez derywatyzację jodoacetamidu (IAA) (krok 6).
    4. Zatrzymać reakcję, dodając 79 μl 1 M roztworu kwasu askorbinowego wH2O(78,8 μmol; 15 eq.). Liofilizować mieszaninę reakcyjną i użyć proszku do 3. utleniania.
  3. 3Utlenianie (Rysunek 1D)
    UWAGA: Ostatnie utlenianie prowadzi do deprotekcji cystein chronionych przez tBu i do powstania trzeciego mostka dwusiarczkowego. Protokół dotyczy 15 mg peptydu po 2. oksydacji (2718,3 g/mol; 5,5 μmol; 1 eq.).
    1. Rozpuścić peptyd (15 mg, końcowe stężenie 1 mM) w 5,5 ml TFA. Zawiera mieszaninę wymiatającą składającą się z 11,2 mg difenylosulfotlenku (55 μmol; 10 eq.), 60,2 μl anizolu (0,6 mmol; 100 eq.) i 97,2 μl trichloromethylosilanu (0,8 mmol; 150 eq.). Mieszaj mieszaninę przez 3-5 godzin w temperaturze pokojowej.
    2. Monitorować reakcję utleniania za pomocą HPLC i MS. Potwierdzić powstanie trzeciego wiązania dwusiarczkowego przez derywatyzację jodoacetamidem (IAA) (krok 6).
    3. Wytrącić peptyd w probówkach zawierających zimny eter dietylowy (0 °C, 1 ml roztworu reakcyjnego na 8-10 ml eteru dietylowego).
    4. Odwirować zawiesiny (3400 x g, 1 min), zdekantować supernatant i kilkakrotnie przemyć granulki (4 razy) 8-10 ml zimnego eteru dietylowego (0 °C). Pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu (3 min).
    5. Rozpuścić granulki w 1 ml 80% tert-butanolu (wH2O), wyliofilizować peptyd i przechowywać go w temperaturze -20 °C.

5. Oczyszczanie peptydów

UWAGA: Oczyść utlenione peptydy za pomocą półpreparatywnego RP HPLC wyposażonego w kolumnę C18 (wielkość cząstek 10 μm, wielkość porów 300 A, 250 x 22 mm) i pętlę iniekcyjną 3,6 ml. Stosować gradientowy system elucji 0,1% TFA wH2O(eluent A) i 0,1% TFA w MeCN/H2O (9:1, eluent B). Wykrywanie pików przy długości fali 220 nm.

  1. Dodać 15 mg liofilizowanego produktu surowego z kroku 4.3.5 do probówki o pojemności 15 ml. Rozpuścić surowy produkt w objętości pętli próbki HPLC (np. 3,6 ml). Użyć mieszaniny 0,1% TFA w MeCN/H2O (1:1). Wirować aż do całkowitego rozpuszczenia i odwirowywać (3400 x g) roztwór przez 1 minutę.
  2. Pobrać mieszaninę o objętości 3,6 ml do strzykawki o pojemności 5 ml i wstrzyknąć próbkę bez pęcherzyków powietrza do pętli iniekcyjnej. Rozpocząć wstrzykiwanie do systemu HPLC. Oczyszczać mieszaninę peptydów przy użyciu gradientu 0-50% eluentu B przez 120 minut przy natężeniu przepływu 10 ml/min.
  3. Zbierz frakcje w poszczególnych probówkach, gdy się pojawią. Po zakończeniu cyklu należy przygotować wybrane frakcje do analizy MS i HPLC (Krok 6.1-6.2). Wszystkie frakcje należy liofilizować i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Po zakończeniu cyklu należy przygotować wybrane frakcje do analizy MS i HPLC (Krok 6.1-6.2). Wszystkie frakcje należy liofilizować i przechowywać w temperaturze -20 °C.

6. Analityka peptydów

  1. Analityczny HPLC
    UWAGA: Potwierdzić czystość peptydu za pomocą analitycznej HPLC RP wyposażonej w kolumnę C18 (wielkość cząstek 5 μm, wielkość porów 300 μm, 250 x 4,6 mm) i pętlę iniekcyjną 500 μl. Stosować gradientowy system elucji o zawartości 0,1% TFA wH2O(eluent A) i 0,1% TFA w MeCN (eluent B). Wykrywanie pików przy długości fali 220 nm.
    1. Przenieść próbkę frakcji peptydowych lub kontroli reakcji do fiolki HPLC i rozpuścić ją w mieszaninie 0,1% TFA w MeCN/H2O (1:1, 300-500 μL). Umieścić fiolkę HPLC w automatycznym podajniku próbek analitycznego RP HPLC.
    2. Wstrzyknąć 250 μl każdej próbki. Stosować gradientowy system elucji o zawartości 0,1% TFA wH2O(eluent A) i 0,1% TFA w MeCN (eluent B). Oczyść peptyd za pomocą gradientu 10-40% eluentu B przez 30 minut przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min.
  2. Spektrometria mas MALDI TOF
    UWAGA: Potwierdź tożsamość peptydu za pomocą spektrometrii mas MALDI TOF (czas przelotu), używając kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego jako matrycy.
    1. Przenieść widoczną ilość peptydu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i rozpuścić ją w 10 μl 37 mM roztworu kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego w mieszaninie 0,1% TFA wH2O/MeCN (1:1).
    2. Wirować roztwór przez 10 s, nanieść 2 μl próbki na zmieloną stalową tarczę i wysuszyć próbkę na powietrzu.
    3. Do pomiarów należy użyć trybu reflektora i wzorca kalibracji peptydów dla mas molowych poniżej 6000 g/mol.
  3. Derywatyzacja jodoacetamidu
    UWAGA: Ponieważ jodoacetamid reaguje z grupami tiolowymi, derywatyzacja jodoacetamidowa peptydów wskazuje na wolne grupy tiolowe. W związku z tym brak wolnych grup tiolowych służy jako kontrola reakcji za pośrednictwem MS podczas 1. utleniania.
    1. Rozpuścić peptyd w 10 mM buforze fosforanowym (100 μL; 0,05 mM; pH 7,8) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 μl jodoacetamidu w 10 mM buforze fosforanowym (4 mM) do roztworu peptydu i delikatnie wstrząsać reakcją przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Mieszaninę reakcyjną należy liofilizować i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Użyj końcówki pipety z filtrem o stężeniu C18 i kondycjonuj końcówkę 10 μl 80% (3 razy), 50% (3 razy), 30% (3 razy) i 0% (3 razy) MeCN w H2O (+ 0,1% TFA).
    3. Rozpuścić próbkę z etapu 6.3.1 w 1 μl 0,1% TFA wH2Oi dodać roztwór do końcówki pipety filtracyjnej. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby peptyd związał się ze kulką. WyjąćH2Oz końcówki pipety i przepłukać końcówkę pipety filtra 10 μl 0,1% TFA wH2O.
    4. Dodać 2 μl 0,1% TFA w H2O/MeCN (1:1) z drugą końcówką pipety (bez filtra) na wierzch kulki zawierającej peptyd. Nanieść filtrat na zmieloną stalową tarczę i wysuszyć próbkę na powietrzu.
    5. Nałożyć 1 μl 37 mM roztworu kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego w mieszaninie 0,1% TFA w H2O/MeCN (1:1) na zmieloną stalową tarczę z próbką i wysuszyć próbkę na powietrzu.
    6. Do pomiarów należy użyć trybu reflektora i wzorca kalibracji peptydów dla mas molowych poniżej 6000 g/mol.
  4. Analiza aminokwasów
    UWAGA: Przeanalizuj dokładne stężenie peptydu, a także skład aminokwasowy peptydu za pomocą analizatora aminokwasów.
    1. Przenieść 100 μg czystego peptydu (2604 g/mol; 0,04 μmol) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i rozpuścić proszek w 200 μl 6 M HCl.
    2. Przenieść 200 μl roztworu do szklanej ampułki i dwukrotnie przepłukać probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml 200 μl 6 M HCl. Przenieść roztwór płuczący do szklanej ampułki.
    3. Zamknij ampułkę, podgrzewając szyjkę ampułki płomieniem palnika Bunsena. Włóż ampułkę do szklanej probówki. Umieścić go w bloku grzewczym na 24 godziny w temperaturze 110 °C w celu hydrolizy.
    4. Otwórz ampułkę i przenieś roztwór do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Umyć ampułkę (3 x 200 μl) i nakrętkę (3 x 100 μl) podwójnie destylowanymH2Oi przenieść do probówki do mikrowirówki.
    5. Odwirowywać roztwór przez 6 godzin w temperaturze 60 °C i 210 x g w rotacyjnym koncentratorze próżniowym. Rozpuścić zhydrolizowany produkt w 192 μl buforu rozcieńczającego próbkę (200 μM) i przenieść roztwór do filtra mikroodśrodkowego.
    6. Odwirować próbkę przez 1 minutę przy 2300 x g i przenieść 100 μl filtratu do probówki z próbką do analizy aminokwasów. Umieść probówkę w analizatorze aminokwasów i rozpocznij analizę. Do kalibracji używany jest wzorzec aminokwasowy.

7. MS/MS Analiza połączeń dwusiarczkowych

  1. Częściowa redukcja i alkilacja17
    1. Rozpuścić 600 μg czystego peptydu (2604 g/mol; 0,23 μmol) w 1,2 ml 0,05 M buforu cytrynianowego (pH 3,0; stężenie peptydu 0,14 mM) zawierającego 7,5 mg tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP; 0,02 M; 0,03 mmol).
    2. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej i pobrać kilka próbek kontrolnych reakcji (100 μl) w zakresie od 0 min do 30 min.
    3. Wymieszać próbki w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml z 300 μl buforu alkilacyjnego (0,5 M tris-octanu; pH 8,0; 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA); 1,1 M jodoacetamid) w celu zatrzymania reakcji i przeprowadzenia karbamidometylacji wolnych grup tiolowych.
    4. Zatrzymać reakcję po 5 minutach przez dodanie 100 μl 10% TFA (wH2O) i przechowywać próbki na suchym lodzie. Przygotować próbki HPLC zgodnie z opisem w kroku 6.1.2 i wstrzyknąć 400 μl. (Rysunek 2A)
    5. Stosować gradientowy system elucji o zawartości 0,1% TFA wH2O(eluent A) i 0,1% TFA w MeCN (eluent B). Analizować peptydy, stosując kombinację separacji izokratycznej (10 % eluentu B przez 15 minut), a następnie gradientu 10–35 % eluentu B przez 25 minut przy natężeniu przepływu 10 ml/min. Wykrywanie pików przy długości fali 220 nm.
    6. Zbierz frakcje do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i liofilizuj peptydy. (Rysunek 2B)
    7. Przenieść niewielką ilość każdej frakcji do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu przeprowadzenia analizy MS/MS form utlenionych (kontynuować w kroku 7.1.12).
    8. Rozpuść pozostały peptyd (10-100 μg) w 0,1% TFA w H2O (10-50 μL) i dodaj odpowiednią objętość 100 mM roztworu TCEP (w H2O), aby uzyskać końcowe stężenie TCEP 10 mM.
    9. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (Rysunek 2C). Mieszaninę reakcyjną należy liofilizować i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    10. Przygotuj próbki MS/MS zgodnie z opisem w kroku 6.3.2-6.3.5.
    11. Wykonaj pomiary MS/MS na spektrometrze mas MALDI TOF/TOF. Użyj MS/MS LID (rozpad indukowany laserem) do fragmentacji peptydu i wybierz masy prekursorów 2- i 4-krotnie karbamidometylowanych. Przetwarzaj i oceniaj dane MALDI, aby potwierdzić pożądane połączenie dwusiarczkowe.

8. Eksperymenty NMR i analiza struktury

  1. Rozpuścić ok. 0,3-2 mg czystego produktu peptydowego w 500 μLH2O/D2O (90:10) i przenieść mieszaninę do mikroprobówki NMR.
  2. Przygotować próbkę do pomiarów na spektrometrze NMR
  3. Rejestruj dwuwymiarowe widma [1 H,1H]-DQF-COSY (spektroskopia korelacji z podwójnym filtrem kwantowym), [1 H,1H]-TOCSY (spektroskopia skorelowana ogółem), [1 H,1H]-NOESY (spektroskopia wzmocnienia jądrowego Overhausera) i [1 H,13C]-HSQC (heterojądrowa pojedyncza koherencja kwantowa) przy użyciu tłumienia wody.
  4. Przypisz rezonanse protonowe zarejestrowanych widm i utwórz przypisanie atomu z widm NOESY. Porównaj intensywności w widmach NOESY, aby ustawić górne granice odległości między różnymi atomami w peptydzie. Użyj intensywności protonów zarodkowych do kalibracji intensywności szczytu.
  5. Wykonaj obliczenia i udoskonalenie struktury za pomocą programu komputerowego do wizualizacji molekularnej i użyj zidentyfikowanych połączeń dwusiarczkowych z kroku 7 jako dodatkowych ograniczeń ( Rysunek 3).
  6. Wybierz struktury o najniższych energiach i użyj ich do symulacji dynamiki molekularnej (MD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zsyntetyzowano i szczegółowo scharakteryzowano 15 różnych izomerów µ-konotoksyny PIIIA z mostkami dwusiarczkowymi (Rysunek 1). Wiązania dwusiarczkowe zidentyfikowano za pomocą częściowej redukcji i następującej po niej analizy MS/MS (Rysunek 2). W celu ujawnienia poszczególnych struktur peptydowych przeprowadzono analizę NMR różnych izomerów (Rysunek 3). Należy zaznaczyć, że do jednoznacznej identyfi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana w niniejszym dokumencie metoda syntezy peptydów bogatych w cysteinę, takich jak μ-PIIIA, umożliwia selektywne wytwarzanie izomerów związanych dwusiarczkiem z tej samej sekwencji aminokwasów. W związku z tym zastosowano sprawdzone metody, takie jak synteza peptydów w fazie stałej na bazie Fmoc18 oraz zdefiniowana strategia grupy ochronnej dla regioselektywnego tworzenia wiązań dwusiarczkowych16. Synteza peptydów w fazie stałej może wytwarzać sekwencje aminokwasów na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować A. Resemannowi, F. J. Mayerowi i D. Suckau z Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts i C. Thiele z Uniwersytetu Technicznego w Darmstadt; O. Ohlenschläger z FLI Jena, M. Engeser z Uniwersytetu w Bonn; K. Kramer, A. Harzen i H. Nakagami z Instytutu Badań nad Hodowlą Roślin im. Maxa Plancka, Kolonia; Susanne Neupert z Instytutu Zoologii w Kolonii; oraz Zakładom Spektroskopii Biomolekularnego Rezonansu Magnetycznego Uniwersytetu we Frankfurcie w celu uzyskania wsparcia technicznego, modułów szkoleniowych i dostępu do instrumentów. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe udzielone D.I. przez Uniwersytet w Bonn.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PS PEG2000 Fmoc Rink-amid ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc)BachemA-3850
Arg(Pbf)Iris BiotechFSC1010
Asn(Trt)BachemB-1785
Asp(tBu)Iris BiotechFSP1020
Hyp(tBu)Iris BiotechFAA1627
Lys(Boc)BachemB-1080
Ser(tBu)Iris BiotechFSC1190
Gln(Trt)Iris BiotechFSC1043
Glu(tBu)Iris BiotechFSP1045
Trp(Boc)Iris BiotechFSC1225
Tyr(tBu)Sigma Aldrich47623
Thr(tBu)Iris BiotechFSP1210
His(Trt)Iris BiotechFDP1200
2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloironioheksofluorfosforanSigma Aldrich8510060Łatwopalny
DMFFisher ScientificD119Łatwopalny, toksyczny
DCMFisher ScientificD37Racerotwórcza
piperydynaAlfa AesarA12442łatwopalny, toksyczny,
N-metylo-morfolinaSigma Aldrich224286
Cys(Acm)Iris BiotechFAA1506
Cys(Trt)BachemE-2495
Cys(tBu)BachemB-1220
kwas trifluoruoctowySigma Aldrich74564Toksyczny,
fenolMerck1002060Toksyczny
tioanizolAlfa AesarA14846
etanedithiolFluka Analytical2390
eter dietylowyVWR100,921Palny
tert-butanolAlfa AesarL12338Łatwopalny
acetonitrylFisher ScientificA998Woda łatwopalna
Fisher ScientificW5
izopropanolVWRACRO42383Łatwopalny
wodorotlenek soduAppliChemA6579,1000
jodoacetamidSigma AldrichI6125
jodSigma AldrichI0385
Kwas solnyMerck110165
kwas askorbinowySigma AldrichA4403
difenylosulfotlenekSigma AldrichP35405
anisolSigma Aldrich96109Łatwopalny
trichlorometylosilianSigma AldrichM85301Łatwopalny
bufor do rozcieńczania próbekLaborservice Onken
diwodorofosforan soduSigma Aldrich106370
wodorofosforan disodowySigma Aldrich795410
(2-karboksyetylo)chlorowodorek fosfinySigma AldrichC4706
kwas cytrynowySigma Aldrich251275
cytrynian sodu dwuwodnySigma AldrichW302600
tris-octanCarl Roth, 7125
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma AldrichE26282 
wzorzec kalibracji peptydów IIBruker Daltonics GmbH8222570
Nazwa urządzeniaFirma
syntezator peptydów w fazie stałejIntavis Bioanalytical Instruments AGEPS 221
 Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparatywny system HPLCJascoPV-987
Eurospher 100 C18 kolumna (RP, 5 i mikro; m wielkość cząstek, 100 i Aring; wielkość porów, 250 x 32 mm)Knauer25QE181E2Joczyszczanie liniowej kolumny peptydowej
Vydac 218TP1022 (RP C18, 10 µ m wielkość cząstek, 300 i Aring; wielkość porów, 250 x 22 mm)Hichrom-VWRHICH218TP1022oczyszczanie utlenionego peptydu
analitycznego HPLC System ShimadzuLC-20AD
Vydac 218TP54 kolumna (C18 RP, 5 & m wielkość cząstek, 300 i Aring; Wielkość porów, 250 x 4,6 mm) Kolumna analitycznaHichrom-VWRHICH218TP54
szlifowana stalowa tarcza (MTP 384)Bruker Daltonics GmbHNC0910436przygotowanie MALDI 
Filtr o stężeniu C18 (ZipTip)Merck KGaAZTC18S096preparat MALDI 
Spektrometr masowy MALDIBruker Daltonics GmbHultraflex III TOF/TOF
analizator aminokwasówEppendorf-Biotronik GmbHLC 3000 system
spektrometr NMR Bruker Avance IIIBruker Daltonics GmbHBruker Avance III 600 MHz
program komputerowy do wizualizacji molekularnejYASARA Biosciences GmbHObliczenia struktury YasaraNMR
program komputerowy do analizy danych MALDI Bruker Daltonics GmbHflexAnalysis, BioToolsMS/MS
analogowy mieszalnik wirowyVWRVM 3000
MikrowirówkaEppendorf5410
WirówkaHettichEBA 20
Rotacyjny koncentrator próżniChrist2-18 Waga analityczna Cdplus
A& D InstrumentyGR-202-EC
Liofilizator do fragmentacji

Bibliografia

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resinNovabiochem855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM

Tagi

Tworzenie wi za dwusiarczkowychsynteza peptyd wsynteza w fazie sta ejtandemowa spektrometria masrezonans magnetyczny j draselektywne utlenianieoczyszczanie metod HPLCanaliza aminokwas wcharakterystyka peptyd w

Powiązane artykuły