Artykuł metodologiczny

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

DOI:

10.3791/58375

⸱

21 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Department of Entomology, Louisiana State University AgCenter, 2Department of Entomology, Virginia Tech, 3Department of Entomology and Nematology, Emerging Pathogens Institute, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość obecnie dostępnych środków owadobójczych celuje w układ nerwowy, a mutacje genetyczne białek nerwowych bezkręgowców często powodują szkodliwe konsekwencje, jednak obecne metody rejestrowania aktywności układu nerwowego poszczególnych zwierząt są kosztowne i pracochłonne. Ten preparat elektrody ssącej ośrodkowego układu nerwowego larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster jest elastycznym systemem do badania fizjologicznych skutków czynników neuroaktywnych, określania fizjologicznej roli różnych ścieżek nerwowych do aktywności OUN, a także wpływu mutacji genetycznych na funkcjonowanie neuronów. Ten preparat ex vivo wymaga jedynie umiarkowanych umiejętności preparacyjnych i wiedzy elektrofizjologicznej, aby wygenerować powtarzalne zapisy aktywności neuronalnej owadów. Szeroka gama modulatorów chemicznych, w tym peptydy, może być następnie stosowana bezpośrednio do układu nerwowego w roztworze z solą fizjologiczną w celu zmierzenia wpływu na aktywność OUN. Co więcej, technologie genetyczne, takie jak system GAL4/UAS, mogą być stosowane niezależnie lub w połączeniu ze środkami farmakologicznymi w celu określenia roli określonych kanałów jonowych, transporterów lub receptorów w funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego stawonogów. W tym kontekście opisane w niniejszym dokumencie testy są bardzo interesujące dla toksykologów insektycydów, fizjologów owadów i biologów rozwojowych, dla których D. melanogaster jest uznanym organizmem modelowym. Celem tego protokołu jest opisanie metody elektrofizjologicznej umożliwiającej pomiar elektrogenezy ośrodkowego układu nerwowego u modelowego owada Drosophila melanogaster, która jest przydatna do testowania różnorodnych hipotez naukowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tego podejścia jest umożliwienie naukowcom szybkiego pomiaru elektrogenezy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u modelowego owada, Drosophila melanogaster. Ta metoda jest niezawodna, szybka i opłacalna w przeprowadzaniu eksperymentów fizjologicznych i toksykologicznych. Ośrodkowy układ nerwowy jest niezbędny do życia, dlatego szlaki fizjologiczne krytyczne dla prawidłowego funkcjonowania neuronów zostały szeroko zbadane w celu zrozumienia lub modyfikacji funkcji neuronalnych. Charakterystyka szlaków sygnałowych w obrębie ośrodkowego układu nerwowego stawonogów umożliwiła odkrycie kilku klas chemicznych insektycydów, które zaburzają funkcje neuronalne bezkręgowców w celu wywołania śmiertelności przy jednoczesnym ograniczeniu konsekwencji poza celem. W związku z tym możliwość pomiaru aktywności neuronalnej owadów jest bardzo interesująca dla dziedziny toksykologii i fizjologii owadów, ponieważ układ nerwowy jest tkanką docelową większości stosowanych insektycydów1. Jednak ciągły rozwój podstawowej i stosowanej wiedzy na temat układu nerwowego owadów wymaga zaawansowanych technik neurofizjologicznych, których wykonalność jest ograniczona, ponieważ obecne techniki są pracochłonne i wymagają dużych kosztów, linie komórek nerwowych owadów są ograniczone i/lub dostęp do centralnych synaps większości stawonogów jest ograniczony. Obecnie charakterystyka większości białek nerwowych owadów wymaga sklonowania celu i heterologicznej ekspresji w celu późniejszego odkrycia leku i zapisów elektrofizjologicznych, jak opisano dla kanałów potasowych prostownika wewnętrznego owadów2, receptor ryanodine owadów3, kanały K+ wrażliwe na napięcie komarów4i inne. Aby złagodzić wymóg ekspresji heterologicznej i potencjał niskiej ekspresji funkcjonalnej, Bloomquist i współpracownicy postawili sobie za cel wywołanie fenotypu neuronalnego w hodowanych komórkach Spodoptera frugiperda (Sf21) jako nowej metody odkrywania insektycydów5,6. Metody te stanowią słuszne podejście do rozwoju nowej chemii, jednak często tworzą one nieprzezwyciężalne wąskie gardło dla charakterystyki środków farmakologicznych, identyfikacji mechanizmów oporności na insektycydy i charakterystyki podstawowych zasad fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę ex vivo, która umożliwia rejestrowanie aktywności elektrycznej modelowego owada o plastycznej genetyce7,8,9 i znanych wzorców ekspresji kompleksów neuronowych10,11,12 w celu umożliwienia scharakteryzowania mechanizmów oporności na poziomie nerwu, sposobu działania nowo opracowanych leków i innych badań toksykologicznych.

Muszka owocowa, D. melanogaster, jest powszechnym organizmem modelowym do definiowania systemów nerwowych owadów lub mechanizmu działania insektycydów i została uznana za dobrze dopasowany organizm modelowy do badań toksykologicznych13, farmakologiczny14,15, neurofizjologiczny16 i patofizjologiczny17,18,19,20 procesów kręgowców. D.melanogaster jest owadem holometabolicznym, który przechodzi całkowitą metamorfozę, w tym stadium larwalne i poczwarkowe przed osiągnięciem dorosłego stadium reprodukcyjnego. W trakcie procesu rozwojowego układ nerwowy ulega znacznej przebudowie na różnych etapach życia, ale ta metodologia skupi się na larwalnym OUN. W pełni rozwinięty larwalny OUN jest anatomicznie prosty z segmentami klatki piersiowej i brzucha, które są zrośnięte i tworzą zwój brzuszny, który reprezentuje szereg powtarzających się i prawie identycznych jednostek neuromerycznych21,22. Zstępujące nerwy ruchowe wywodzą się z ogonowego końca zwojów podprzełykowych i schodzą do unerwienia mięśni ściany ciała i narządów trzewnych larw. Rysunek 1 opisuje ogólną anatomię ośrodkowego układu nerwowego larw Drosophila.

Bariera krew-mózg Drosophila (BBB) rozwija się pod koniec embriogenezy i jest tworzona przez podkrążeniowe komórki glejowe (SPG)21. Komórki SPG tworzą liczne procesy podobne do filopodiów, które rozprzestrzeniają się, tworząc ciągły, bardzo płaski, przypominający śródbłonek arkusz, który pokrywa cały Drosophila CNS23. Skala Drosophila BBB ma podobieństwa do kręgowców BBB, co obejmuje zachowanie homeostazy mikrośrodowiska nerwowego poprzez kontrolowanie wchodzenia składników odżywczych i ksenobiotyków do CNS21. Jest to warunek wstępny niezawodnej transmisji i funkcji neuronalnej, jednak ochrona OUN przez barierę krew-mózg ogranicza przenikanie leków syntetycznych, większości peptydów i innych ksenobiotyków24,25, co wprowadza potencjalne problemy przy charakteryzowaniu potencji modulatorów małocząsteczkowych. Metoda wykorzystuje prostą transsekcję w celu przerwania tej bariery i zapewnienia łatwego dostępu farmakologicznego do centralnych synaps.
Największą zaletą opisywanej metodyki jest prostota, powtarzalność i stosunkowo wysoka przepustowość charakterystyczna dla tego systemu. Protokół jest stosunkowo łatwy do opanowania, konfiguracja zajmuje niewiele miejsca i wymagany jest tylko początkowy wkład finansowy, który sprowadza się do odczynników i materiałów eksploatacyjnych. Co więcej, opisana metoda jest całkowicie modyfikowalna, aby rejestrować centralną aktywność nerwu zstępującego muchy domowej, Musca domestica26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sprzęt i materiały

  1. Przygotować wymagane elementy (wymienione w Tabeli Materiałów) stanowiska do elektrofizjologii do wykonywania zapisów elektrody ssącej CNS.
    UWAGA: Przed przystąpieniem do eksperymentów konieczne jest skonstruowanie komór do preparowania ośrodkowego układu nerwowego Drosophila oraz do kąpieli zwojów w soli fizjologicznej podczas nagrań. Poniżej znajduje się zarys budowy studzienki krok po kroku.
  2. Przygotuj komorę larwalną.
    1. Rozpuść wosk za pomocą gorącej płyty.
    2. Wlej 2 ml stopionego wosku do komory o maksymalnej objętości 2 - 2,5 ml.
    3. Pozostaw wosk do ostygnięcia i stwardnienia przez około 2 godziny.
    4. Za pomocą żyletki wydrąż otwór w utwardzonym wosku, który pomieści objętość 500 μl, który ma powierzchnię około 0,5cm2 i głębokość około 0,25 cm.

2. Konfiguracja sprzętu i oprogramowania

UWAGA: Konfiguracja nagrania zewnątrzkomórkowego jest pokrótce opisana poniżej.

  1. Przygotuj sprzęt do sekcji i nagrywania.
    1. Umieść preparat tkankowy, mikroskop, elektrodę ssącą, mikromanipulatory, źródło światła wewnątrz klatki Faradaya, aby zredukować hałas i wyeliminować zewnętrzne pola elektryczne (Rysunek 2).
    2. Podłącz (najlepiej) przewody uziemiające i dodatnie do ekranowanych zacisków krokodylkowych, które zostaną podłączone odpowiednio do wanny i uchwytu mikroelektrody.
      UWAGA: Lutowane i odsłonięte przewody można przykryć folią aluminiową w celu zmniejszenia hałasu.
    3. Podłącz przewody uziemiające i dodatnie do wejścia 1 wzmacniacza różnicowego AC/DC.
    4. Podłącz system akwizycji danych do wzmacniacza różnicowego AC/DC, podłączając Bayonet Neill-Concelman (BNC) z wejścia 1 systemu akwizycji danych do wyjścia kanału 1 amplifier.
      UWAGA: Zaleca się włączenie eliminatora szumów 50/60 Hz między oprogramowaniem do akwizycji danych a amplifier. Wymagane jest użycie trójnika BNC.
    5. W razie potrzeby dołącz monitor audio do konfiguracji, podłączając wejście 1 monitora audio do wejścia 1 oprogramowania do akwizycji danych.
    6. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml solą fizjologiczną i podłącz ją do portu ciśnieniowego uchwytu elektrody.
      UWAGA: Upewnij się, że między strzykawką, granulką Ag/AgCl i otworem elektrody nie ma pęcherzyków powietrza.
  2. Przygotuj oprogramowanie do sekcji i nagrywania.
    UWAGA: Zarys metod konfiguracji oprogramowania opiera się na oprogramowaniu do akwizycji/analizy wymienionym w Tabeli materiałów, które zdigitalizuje surową moc elektryczną i przekonwertuje dane na częstotliwość skoków. Można jednak użyć innego oprogramowania i użyć wielu konwersji nagrań.
    1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji/analizy.
    2. Kliknij "ustawienia" na głównym pasku narzędzi i wybierz "ustawienia kanału", co otworzy okno dialogowe.
    3. Zmniejsz łączną liczbę kanałów do trzech.
    4. Dla kanału 1 wybierz zakres 100 mV.
    5. W przypadku kanału 2 kliknij zakładkę "obliczenia", która otworzy menu rozwijane. Wybierz "pomiary cykliczne", co otworzy drugie okno dialogowe.
    6. Wybierz kanał 1 jako źródło. Następnie w menu rozwijanym pomiar wybierz skok jednostki na wydarzeniach. Na koniec w obszarze ustawień wykrywania z menu rozwijanego wybierz prosty próg.
    7. Aby przeliczyć aktywność elektryczną na wykres szybkości wyrażony w hercach, 3. kanał musi być ustawiony w trybie arytmetycznym: W oknie wejściowym wpisz "1000*smoothsec(ch2,2)". Następnie wybierz jako menu rozwijane jednostki hertz.
      UWAGA: Udane nagrania można wykonać z wieloma różnymi ustawieniami nagrywania, ale "Skok jednostki przy zdarzeniach i prosty próg" jest prawdopodobnie najłatwiejszy, ponieważ pozwala na dostosowanie progu powyżej aktywności w tle dla każdego pojedynczego nagrania. Nagrania z ustawieniem "Wejście ze źródła niestandardowego" zwiększają odtwarzalność danych, przy założeniu, że aktywność w tle nie różni się między nagraniami.
    8. Zamknij okna dialogowe, aby powrócić do ekranu głównego. Oś y powinna być wyrażona w Hz, a oś x w czasie.

3. Rozwiń i przygotuj larwy Drosophila CNS

UWAGA: Metody preparacji ośrodkowego układu nerwowego larw są wyraźnie zilustrowane w Hafer and Schedl27, ale te wcześniej opublikowane metody zmniejszają długość zstępujących neuronów, które są ważne dla pomiaru częstotliwości skoków. W tym miejscu przedstawiono dodatkową metodę wycinania larwalnego OUN, który utrzymuje długie, nienaruszone neurony zstępujące.

  1. Przygotowanie soli fizjologicznej.
    1. Przygotować sekcję i zapis soli fizjologicznej do następujących składników w mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowy (HEPES); miareczkować pH do 7,25.
  2. Wypreparuj larwę Drosophila CNS.
    1. Zidentyfikuj i wyekstrahuj wędrującego Drosophila melanogaster w trzecim stadium z fiolki hodowlanej i umieść w 200 μl soli fizjologicznej (Rysunek 3A).
    2. Chwyć haczyki do ust parą cienkich kleszczy i chwyć brzuch robaka drugą parą kleszczy (Rysunek 3B).
      UWAGA: Nie wywieraj zbyt dużego nacisku na brzuch, ponieważ może to spowodować rozerwanie cienkiej warstwy kutykularnej robaka.
    3. Delikatnie pociągnij haczyki do ust i brzuch w różnych kierunkach, aby oddzielić ogonowy koniec robaka od obszaru głowy i odsłonić wnętrzności robaka (Rysunek 3C).
      UWAGA: OUN będzie spleciony z tchawicą i przewodem pokarmowym. Nie odcinaj OUN od żadnej tkanki, aby zapobiec przecięciu zstępujących nerwów obwodowych.
    4. Oczyść OUN z przewodu pokarmowego i tchawicy za pomocą kleszczy (Ryc. 3D).
    5. W razie potrzeby przerwij barierę krew-mózg, ręcznie przecinając OUN tylnie do płatów mózgowych za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas.
      UWAGA: Należy to zrobić w oparciu o właściwości fizykochemiczne stosowanej substancji chemicznej. Czerwona linia w Rysunek 4A to sugerowany punkt przecięcia i przecięty OUN z nienaruszonymi opadającymi pniami nerwów obwodowych pokazany na Rysunek 4B. Przecięty OUN jest gotowy do eksperymentów po wykonaniu kroku 3.2.5.

4. Zewnątrzkomórkowy zapis ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

  1. Przygotuj CNS do nagrywania.
    1. Wyciągnąć szklaną elektrodę pipetową z kapilar ze szkła borokrzemianowego do rezystancji 5-15 mΩ.
    2. Włożyć przecięty OUN do komory woskowej zawierającej 200 μl soli fizjologicznej. Clamp niepowlekaną szpilkę przeciw owadom z zaciskiem krokodylkowym przylutowanym do przewodu uziemiającego i włóż szpilkę do soli fizjologicznej, aby zakończyć obwód.
    3. Za pomocą mikromanipulatorów skieruj elektrodę na ogonowy koniec przeciętego OUN. Wyeliminuj nagrywanie szumów tła, dostosowując poziom progowy w oprogramowaniu do akwizycji/analizy przed kontaktem z obwodowymi pniami nerwowymi.
    4. Wciągnąć wszelkie dogodne nerwy obwodowe do elektrody ssącej, wywierając lekki podnacisk na strzykawkę.
      UWAGA: Podstawowa częstotliwość wystrzeliwania jest skorelowana z liczbą neuronów wciągniętych do elektrody, gdzie więcej neuronów często powoduje zwiększoną rezystancję elektrody.
  2. Rozpocznij zewnątrzkomórkowy zapis aktywności nerwów zstępujących do OUN.
    1. Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu do akwizycji danych i monitoruj częstotliwość wypalania linii bazowej. Pozwól, aby szybkość ognia zrównoważyła się przez 5 minut przed zebraniem danych dotyczących podstawowej szybkości ognia.
    2. Odrzucić przygotowanie i zapis, jeśli wzorzec odpalania leczenia kontrolnego nie jest wzorcem pękania podobnym do pokazanego na Rysunek 5A.
      UWAGA: Zmieniony wzorzec odpalania sugeruje nienormalną lub niestabilną aktywność centralnego generatora wzorców, co może zmienić funkcję neuronalną.
    3. Po 5 minutach dodaj 200 μl soli fizjologicznej + nośnik, aby zwiększyć całkowitą objętość komory do 400 μl, aby rozpocząć rejestrację kontrolnej szybkości wypalania.
    4. Po ustaleniu linii podstawowej (3-5 min) pobrać 200 μl soli fizjologicznej i dodać 200 μl czynnika doświadczalnego rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej.
      UWAGA: Dimetylosulfotlenek (DMSO) jest zalecanym rozpuszczalnikiem dla związków lipofilowych i nie powinien przekraczać 0,1% v/v.
    5. Stosuj stężenia leku w sposób seryjny (od niskich do wysokich stężeń) i zapisuj każde stężenie przez wybrany okres czasu (określony przez badacza na podstawie właściwości chemicznych leku29). Oznacz ten punkt czasowy aplikacji leku w oprogramowaniu do akwizycji/analizy, dołączając komentarz zawierający lek i końcowe stężenie.
      UWAGA: Aktywność wypalania OUN zmniejszy się o około 10-20% po 30-50 minutach od rozwarstwienia, dlatego należy przeprowadzić odpowiednie kontrole bez leczenia, a leczenie farmakologiczne nie powinno przekraczać tego czasu.
  3. Analizowanie danych.
    UWAGA: Na zebranych danych można przeprowadzić wiele analiz, takich jak zmiany w impulsach potencjału czynnościowego29, amplituda fali skokowej i przebieg w czasie oraz określenie średnich częstotliwości skoków po leczeniu farmakologicznym26,30,31,32. Najczęstszym z nich jest określenie wpływu leku na średnią częstość skoków w określonym czasie, co opisano poniżej.
    1. Tabelaryzuj średnie częstości skoków, wybierając cały obszar zainteresowania (tj. okres leczenia lekiem) i określ średnie częstotliwości skoków automatycznie za pomocą "Datapada" znajdującego się na głównym pasku narzędzi oprogramowania do akwizycji/analizy.
    2. Określić średnią częstość skoków OUN po leczeniu farmakologicznym do średniej częstości skoków w kontroli nośnika (wartość wyjściowa). Oblicz procentową zmianę szybkości wypalania po leczeniu farmakologicznym według wzoru: (częstotliwość leczenia / częstotliwość wyjściowa) × 100.
    3. Użyj średnich częstotliwości skoków lub procentowego wystrzeliwania kontroli dla każdego stężenia, aby skonstruować krzywą odpowiedzi na stężenie za pomocą standardowego oprogramowania do tworzenia wykresów.
    4. Przeprowadź analizę statystyczną (np. niesparowany test t), aby określić istotność między punktami czasowymi, stężeniami lub terapiami farmakologicznymi.
      UWAGA: Istnieją dwie podstawowe metody generowania i analizowania krzywych stężenie-odpowiedź. Pierwsza metoda to jedno stężenie na pojedynczy preparat. W tym przypadku szybkość skoku pojedynczego stężenia jest znormalizowana do wyjściowej szybkości skoku dla każdego preparatu. Korzyści to zmniejszenie zużycia preparatu ze względu na skrócony czas zapisu, podczas gdy pułapki polegają na wydłużeniu czasu preparacji, ponieważ metoda ta będzie składać się z 5-7 pojedynczych preparatów OUN na stężenie oraz większych słupków błędów na uśrednionym zestawie danych. Druga metoda polega na wielokrotnym stężeniu na pojedynczy preparat. W tym przypadku szybkość skoku dla każdego z 3-5 stężeń jest znormalizowana do tej samej wyjściowej szybkości skoku. Korzyściami są krótszy czas preparacji i mniejsza zmienność między powtórzeniami pod względem stężeń leków, podczas gdy pułapki to wymóg szybko działającego leku i nieznany wpływ wcześniejszych terapii skoncentrowanych na leki na kolejne terapie chemiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spontaniczna aktywność zstępujących nerwów obwodowych powstających z ośrodkowego układu nerwowego Drosophila może być rejestrowana za pomocą zewnątrzkomórkowych elektrod ssących z zachowaniem stałej powtarzalności. Spontaniczna aktywność wyciętego i przeciętego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila wytwarza cykliczny wzorzec pękania po 1-2 s wystrzeliwania z około 1 s aktywności prawie spoczynkowej. Na przykład OUN jest prawie w stanie spoczynku (1-2 Hz) przez 0,5-1 s,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły zawarte w powiązanym filmie i tekście dostarczyły kluczowych kroków w celu zarejestrowania aktywności i częstotliwości wyładowań skokowych ośrodkowego układu nerwowego Drosophila ex vivo. Skuteczność preparacji jest najbardziej krytycznym aspektem metody, ponieważ krótkie lub kilka zstępujących neuronów zmniejszy podstawową szybkość wypalania, co spowoduje duże różnice między powtórzeniami. Jednak po opanowaniu techniki preparacji dane zebrane za pomocą tego testu są wysoce powtarzalne i można...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Pani Rui Chen za rozbiór i zdjęcia ośrodkowego układu nerwowego Drosophila pokazane na rysunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drosophila melanogaster (szczep OR)Centrum magazynowe Bloomington Drosophila2376
Stół do tłumienia drgańKinetic Systemsserii
Faraday CageKinetic SystemsN/A
Mikroskop preparacyjny na wysięgnikuNikonSMZ800NMożna używać wielu lunet; stojak na wysięgniku ma kluczowe
znaczenie AC/ Wzmacniacz różnicowy DCADInstrumentsAM3000HModel 1700 może być używany zamiast monitora audio model 3000
ADInstrumentsAM3300
Hum Bug Noise EliminatorA-M Systems726300
Data Acquisition System (PowerLab)ADInstrumentsPL3504Można używać wielu modeli PowerLab.
Oprogramowanie Lab Chart ProADInstrumentsN/A - Pobierz
Lampy światłowodoweEdmund Optics89-740Można stosować różne źródła światła, ale światłowody są najbardziej elastyczne
mikromanipulatorówPrecyzyjne instrumentyM325
Uchwyt mikroelektrodyWorld Precision InstrumentsMEH715Dopuszczalne są różne modele
BNCWorld Precision Instrumentswielokrotne w zależności od rozmiaru
Kapilaryszklane World Precision InstrumentsPG52151-4
Ściągacz mikroelektrodSutter InstrumentsP-1000Może również używać Narashige PC-100
Black WaxCarolina Biological Supply974228
Niepowlekane szpilki do owadów, rozmiar #2Bioquip1208S2
Kleszcze FinceNarzędzia do nauki11254-20
Nożyczki sprężynowe VannasNarzędzia do nauki15000-03
9200onlineŚwiat

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
  2. Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954(2016).
  3. Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680(2015).
  4. Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
  5. Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
  6. Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
  7. Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
  8. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  9. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  10. Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
  11. Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
  12. Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
  13. Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907(2017).
  14. Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
  15. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
  16. Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
  17. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
  18. Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
  19. Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
  20. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
  21. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365(2014).
  22. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
  23. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  24. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
  26. Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713(2014).
  27. Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85(2006).
  28. Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
  29. Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
  30. Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
  31. Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617(2018).
  32. Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2(2016).
  33. Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
  34. Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Elektroda ss catrzecie stadium larwalnepreparat ex vivosystem GAL4 UAScz stotliwo wy adowa impulsowychmechanizm dzia ania insektycyduelektrofizjologia z zaciskaniem napi cia

Powiązane artykuły