Protokół warunkowej preferencji miejsca do pomiaru inkubacji łaknienia u szczurów

Summary

Tutaj opisany jest protokół preferencji miejsca uwarunkowanego morfiną (CPP) do pomiaru inkubacji głodu u szczurów.

Abstract

Główną przyczyną powtarzających się nawrotów jest głód narkotykowy. Głód narkotykowy wzrasta stopniowo w okresie abstynencji, zjawisko to określa się mianem inkubacji głodu narkotykowego. W tym miejscu opisujemy protokół preferencji miejsca uwarunkowanego morfiną (CPP) do pomiaru inkubacji głodu u szczurów. W tym protokole paradygmat CPP wykorzystujący głównie wskazówki somatosensoryczne jest używany do ustanowienia długotrwałej pamięci nagrody morfiny. Konstruowana jest trzykomorowa skrzynka CPP, która różni się fakturą podłogi komory. Po pierwsze, zwierzęta są badane pod kątem ich preferencji wyjściowej dla dwóch bocznych komór przez trzy kolejne dni. Następnie wstrzykuje się im dootrzewnowo morfinę/sól fizjologiczną i umieszcza w niepreferowanej/preferowanej komorze na 45 minut. Po 6 dniach kondycjonowania ich preferencje dotyczące komór bocznych są testowane przez 15 minut w różnych punktach czasowych po ostatniej sesji kondycjonowania. Przy tym paradygmacie pamięć nagrody morfiny może trwać co najmniej 18 dni. Aby sprawdzić, czy wyżej wymieniony protokół może modelować zwiększone łaknienie, w okresie abstynencji liczy się liczbę wejść do dwóch bocznych komór. Wyniki pokazują, że wejścia wzrosły, co sugeruje, że paradygmat CPP może naśladować inkubację pragnienia. Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw pamięci długotrwałej i inkubacji łaknienia.

Introduction

Uzależnienie od narkotyków jest chorobą przewlekłą¹ z kilkoma różnymi etapami²: objadanie się/odurzenie, wycofanie/negatywny wpływ i zaabsorbowanie/oczekiwanie. W początkowej fazie upijania się/odurzenia cyklu uzależnienia od narkotyków, badani przyjmują narkotyki ze względu na efekt wzmacniający². Na etapie wycofania/negatywnego afektu, badani doświadczają negatywnych somatycznych i emocjonalnych stanów odstawienia narkotyków, które promują negatywne mechanizmy wzmocnienia związane z rozwojem uzależnienia³. W fazie zaabsorbowania/przewidywania badani powracają do poszukiwania narkotyków po wyginięciu, co może być wywołane przez sygnały związane z narkotykami lub stresory. W badaniach na zwierzętach nad uzależnieniem od narkotyków, paradygmaty warunkowej preferencji miejsca (CPP) są używane do naśladowania pozytywnego wzmacniającego efektu narkotyków^4,5,6, a zatem służy do modelowania początkowego etapu cyklu uzależnienia od narkotyków. Morfina, należąca do rodziny opioidów, wywołuje pozytywny efekt wzmacniający poprzez aktywację receptorów opioidowych w mózgu^7,8.

Paradygmat CPP opiera się na zasadzie klasycznego (Pawłowa) warunkowania i jest powszechnie używany do mierzenia nagradzającego efektu nadużywanych narkotyków, takich jak morfina^4,5^,9,10, ze względu na łatwą dostępność w laboratoriach. Typowy paradygmat CPP składa się z trzech faz: kondycjonowania wstępnego, kondycjonowania i faz testowania. Podczas fazy warunkowania, nagradzające właściwości narkotyku (bodziec bezwarunkowy) są sparowane z jednym lub kilkoma neutralnymi bodźcami kontekstowymi, które uzyskują właściwości nagradzające po kilku parach warunkowania i służą jako bodźce warunkowe. Podczas fazy badania preferencje zwierząt dotyczące kompartmentów sparowanych z narkotykami są mierzone i odzwierciedlane jako ich pamięć nagrody. Z tego powodu paradygmat CPP jest również wykorzystywany do badania mechanizmów uczenia się i pamięci. Aby ustanowić długotrwałą pamięć nagrody morfiny, zmienne wpływające na ustalanie CPP zostały dostosowane i zoptymalizowane za pomocą niżej opisanego protokołu¹¹. Bodźce kontekstowe to połączenie sygnałów wizualnych, dotykowych i zapachowych. Różnice w bodźcach kontekstowych i punktach czasowych testowania są tworzone zgodnie z różnymi celami badawczymi. Na przykład w naszym poprzednim badaniu¹², wskazówki somatosensoryczne (różne tekstury podłogi) były głównie używane jako bodźce kontekstowe do zbadania roli ogonowej części kory wyspowej, regionu mózgu z funkcją somatosensoryczną, w nabywaniu i utrzymywaniu długotrwałej pamięci nagrody. Konstrukcja aparatury i przypisanie szczurów do stron preferowanych/nieuprzywilejowanych ma wpływ na ustanowienie CPP. W poniższym protokole zastosowano aparaturę trzykomorową zamiast aparatury dwukomorowej, aby uniknąć wymuszonych wyborów. Równowaga dwóch bocznych komór i początkowe przypisanie do nich zwierząt wpływa na nabycie CPP^4,13. W związku z tym w tym protokole zastosowano zrównoważony projekt komór bocznych i tendencyjne przypisywanie zwierząt, aby uzyskać silną preferencję miejsca. Utrzymanie długotrwałej pamięci nagrody wymaga większej liczby prób kondycjonowania w fazie warunkowania. Aby zmniejszyć koszt czasu podczas fazy kondycjonowania, przeprowadza się dwie próby kondycjonowania dziennie, a wstrzyknięcia morfiny/soli fizjologicznej są równoważone, aby uniknąć ostrego efektu odstawienia morfiny w próbach sparowanych solą fizjologiczną⁴.

Przywrócenie modeli zwierzęcych¹⁴ zostały założone w celu modelowania etapu zaabsorbowania/oczekiwania cyklu uzależnienia od narkotyków. CPP jest również wykorzystywane do badania przywracania, które modeluje powrót do zachowań uzależniających⁵. Nawrót choroby jest jedną z barier w leczeniu uzależnień od narkotyków. Łaknienie jest jedną z przyczyn powtarzających się nawrotów. Głód narkotykowy stale wzrasta w okresie abstynencji, zjawisko to określa się mianem inkubacji głodu^15,16. Inkubacja głodu jest szeroko badana w paradygmacie samodzielnego podawania leków, ale nie w paradygmacie CPP. Zastosowanie paradygmatu CPP do odzwierciedlenia inkubacji łaknienia zostało po raz pierwszy zaproponowane przez Li i wsp.¹⁷. Ich wyniki¹⁷ pokazały, że wyniki CPP niskich dawek morfiny (1 mg/kg i 3 mg/kg), ale nie wysokich dawek (10 mg/kg) wzrastały stopniowo w ciągu pierwszych 14 dni abstynencji. Podobnie, myszy, którym wstrzyknięto niską dawkę kokainy, wykazywały zwiększone wyniki CPP w czasie¹⁸. Podwyższone wyniki CPP niskich dawek morfiny wykorzystano do odzwierciedlenia inkubowanego głodu¹⁷. Sugeruje się, że zarówno czas przebywania w środowisku, jak i liczba wejść do środowiska związanego z narkotykami odzwierciedlają wzmacniające reakcje warunkowe w paradygmacie CPP¹⁹. Większość ostatnich badań wykorzystuje wyniki CPP do bezpośredniego lub pośredniego odzwierciedlenia czasu spędzonego w komorach sparowanych z lekami, podczas gdy liczba wejść do komór bocznych jako parametr jest często zaniedbywana. Z tych powodów zastosowano dawkę morfiny 10 mg/kg, a liczba zgłoszeń została zmierzona w naszym badaniu¹¹. Wyniki pokazują, że wejścia szczurów do bocznych komór znacznie wzrosły w okresie abstynencji¹¹. Wskazuje to, że zarówno wyniki CPP, jak i liczba wpisów są użytecznymi parametrami w ocenie zwiększonego głodu narkotykowego, a paradygmat CPP ma zastosowanie do modelowania zjawiska inkubacji głodu. Jednakże, aby zmniejszyć liczbę wymaganych zwierząt, grupa zwierząt mających doświadczenie z morfiną jest wielokrotnie badana; W związku z tym nie można było wykluczyć efektu wyginięcia przy obecnym nurcie w projektowaniu przedmiotu. Projekt między tematami z tym samym protokołem może przezwyciężyć to ograniczenie.

Poniżej opisano protokół CPP, który ustanowił długotrwałą pamięć nagrody i modelował zwiększone pragnienie. Krótko mówiąc, po trzech dniach kondycjonowania wstępnego szczury przechodzą przez sześć dni kondycjonowania z dwiema próbami kondycjonowania dziennie, a następnie są testowane w różnych punktach czasowych po ostatniej próbie kondycjonowania. W tym paradygmacie CPP konstruowana jest trzykomorowa skrzynka z polichlorku winylu (PVC) używana jako aparat CPP, a podłoga aparatu jest zrównoważona. Aparat składa się z dwóch dużych czarnych komór bocznych (30 cm × 25 cm × 30 cm, dł×szer.×wys.) i jednej środkowej białej komory (11 cm × 25 cm × 30 cm, dł×szer.×wys.) z białą gładką podłogą z PVC. Dwie boczne komory mają różne tekstury podłogi jako wskazówki somatosensoryczne: jedna z podłogą z pleksiglasu siatkowego, druga z szorstką podłogą z PCV.

Protocol

Procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dla Narodowej Opieki i Użytkowania Zwierząt, a eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chińskiej Akademii Nauk.

1. Przyzwyczajenie zwierząt

1. Pozyskaj dorosłe samce szczurów z laboratorium zwierzęcego i utrzymuj je w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światło włączone od 7:00 do 19:00) ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
2. Zajmij się zwierzętami, bawiąc się z nimi lub klepiąc je dwa razy dziennie przez dwa tygodnie przed eksperymentami.
3. Losowo przypisz zwierzęta do grup soli fizjologicznej lub morfiny.

2. Przygotowanie leku

1. Przygotować chlorowodorek morfiny w postaci 10 mg/ml i wstrzyknąć szczurom dootrzewnowo (i.p.) w objętości 1 ml/kg.
2. Jako kontrolę należy wstrzyknąć szczurom sól fizjologiczną w objętości 1 ml/kg.

3. CPP Aparatura

1. Zbuduj trzykomorowy aparat CPP z różnymi sygnałami dotykowymi (podłogowymi) i przetestuj początkową preferencję szczurów do dwóch bocznych komór. Aparat składa się z dwóch dużych czarnych komór bocznych (30 cm × 25 cm × 30 cm, dł×szer.×wys.) i jednej środkowej białej komory (11 cm × 25 cm × 30 cm, dł×szer.×wys.) z białą gładką podłogą z PVC. Dwie boczne komory mają różne tekstury podłogi jako wskazówki somatosensoryczne: jedna z podłogą z pleksiglasu siatkowego, druga z szorstką podłogą z PCV.
2. Zmieniaj kombinację sygnałów dotykowych, aby upewnić się, że urządzenie jest bezstronne, ponieważ stronnicze urządzenie jest podatne na dawanie wyników fałszywie dodatnich⁴.
   UWAGA: Ważną kwestią metodologiczną w projektowaniu aparatury CPP jest to, czy aparatura jest "stronnicza" czy "bezstronna"⁴. Jeśli jedna grupa niewyszkolonych szczurów nie wykazuje początkowej preferencji dla jednej bocznej komory nad drugą, aparat jest uważany za "bezstronny". W przeciwnym razie potraktuj to jako "stronnicze"¹³.

4. CPP Procedura

1. Ustal paradygmat CPP indukowany morfiną głównie zgodnie z wcześniejszymi badaniami^21,22 z modyfikacją punktów czasowych kondycjonowania, liczby sesji kondycjonowania, okresu próbnego kondycjonowania i punktów czasowych testowania²⁰. Poniżej znajduje się krótki opis, którego harmonogram eksperymentu jest przedstawiony w Rysunek 1.
2. Faza kondycjonowania wstępnego
   1. W tej fazie (dzień od 1 do 3) należy zdjąć drzwiczki gilotyny, aby umożliwić swobodny dostęp do całego aparatu i umieścić zwierzę w środkowej komorze.
   2. Rejestruj aktywność zwierząt przez 15 minut.
   3. Oblicz czas spędzony w dwóch bocznych komorach w dniu 3 jako linię bazową i odnieś się do tego jako T0.
   4. Z eksperymentu należy usunąć szczury, które wchodzą do którejkolwiek z bocznych komór mniej niż -cztery razy²³, ponieważ szczury te mogą mieć problemy z ogólnym samopoczuciem (np. brudne futro i nowotwory). Sprawdzić stan zdrowia zwierząt podczas całego okresu doświadczalnego.
3. Faza kondycjonowania
   UWAGA: Faza kondycjonowania trwa 6 dni (dzień od 4 do 9).
   1. W przypadku osób kondycjonowanych morfiną należy wstrzykiwać szczurom dożylnie morfinę (10 mg / kg) lub sól fizjologiczną (1 ml / kg) na przemian w sesjach porannych (9:00) i wieczornych (19:00) w odstępie 10 godzin).
   2. Szczury należy trzymać w zamknięciu natychmiast po każdym wstrzyknięciu w komorze z parami lekowymi (niepreferowanymi) lub solą fizjologiczną (preferowane) przez 45 minut (Rysunek 1B).
   3. Nie wyłączaj systemu nagrywania wideo.
      UWAGA: Według naszego doświadczenia, około 5% szczurów ma depresję oddechową po pierwszym wstrzyknięciu morfiny (10 mg/kg). W takim przypadku, aby zwiększyć przeżywalność szczurów z depresją oddechową, wyjmij szczura z komory kondycjonowania, wyciągnij mu język i połóż go na białej bibułce w jego domowej klatce.
   4. W przypadku kontroli kondycjonowanych solą fizjologiczną, należy podać szczurom zastrzyki z soli fizjologicznej (1 ml / kg) przed ekspozycją na jedną boczną komorę aparatu CPP podczas sesji porannej i na drugą stronę podczas sesji wieczornej przez 45 minut / sesję zgodnie z grupą morfiny (Rysunek 1C).
4. Faza testowania
   1. W tej fazie należy zdjąć drzwiczki gilotyny, aby umożliwić swobodny dostęp do całego aparatu i umieścić zwierzę w środkowej komorze, aby umożliwić mu swobodne eksplorowanie całego aparatu przez 15 minut.
   2. Rejestruj ich aktywność w ciągu tych 15 minut.
   3. Przeprowadź trzy testy kondycjonowania, tj. test 1 (T1), test 2 (T2) i test 3 (T3), odpowiednio 2 dni, 10 dni i 18 dni po ostatniej sesji kondycjonowania w stanie wolnym od morfiny (Rysunek 1A).
   4. Różnicuj punkty czasowe testowania dla różnych celów eksperymentalnych.
      UWAGA: Aby zminimalizować wymaganą liczbę szczurów, stosuje się projekt wewnątrzprzedmiotowy. Jednak, aby wykluczyć efekt wygaszania, wymagany jest projekt między tematami.

Rysunek 1: Procedury eksperymentalne. (A) Procedury doświadczalne całego procesu CPP. (B) Schemat doświadczalny fazy kondycjonowania grupy morfiny. (C) Schemat doświadczalny fazy kondycjonowania grupy soli fizjologicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Analiza danych

1. Oblicz wynik CPP w grupie morfiny (soli fizjologicznej) jako: wynik CPP = czas spędzony w komorze sparowanej z lekiem (niepreferowanej) / całkowity czas spędzony w obu komorach kondycjonujących.
2. Przeprowadzanie analizy danych wyników CPP i wejść do komór bocznych za pomocą odpowiednich metod statystycznych z wykorzystaniem SPSS.
3. Przedstaw wszystkie dane behawioralne jako średnią ± SEM, gdzie SEM jest standardowym błędem średniej. Wartości p<0,05 należy uznać za statystycznie istotne i wskazać je gwiazdkami (*) i oktohorpesyną (#) na rysunkach.

Results

Następujące reprezentatywne wyniki pokazują, że CPP morfiny może być z powodzeniem ustanowiony za pomocą protokołu opisanego powyżej i długotrwała pamięć nagrody morfiny (Rysunek 2) może być utrzymana. Liczba wejść do komór bocznych, analogiczna do liczby aktywnych reakcji w paradygmacie samodzielnego podawania, odzwierciedla wzmacniające właściwości morfiny. Zwiększona liczba wpisów (Rysunek 3), wskazujących na inkubację łaknienia, zaobserwowano przy użyciu tego paradygmatu CPP morfiny.

Pamięć CPP może wytrzymać co najmniej 18 dni po ostatniej sesji kondycjonowania.

Dwadzieścia jeden szczurów w grupie morfiny i 10 szczurów w grupie soli fizjologicznej wykorzystano do przetestowania ekspresji długotrwałej pamięci nagradzającej. Mieszana ANOVA ujawniła istotne różnice w interakcji między grupą a testem (F (3,87) = 4,973, p = 0,003), testem (F (3,87) = 18,237, p< 0,001) i grupą (F (1,29) = 11,413, p = 0,002). Istotne różnice między testami (F (3,60) = 46,628, p < 0,001) w grupie morfiny, ale nie w grupie soli fizjologicznej (F(3,27) = 1,576, p = 0,218) zostały wykryte przez jednokierunkowo powtarzaną ANOVA. Wielokrotna analiza porównawcza z dostosowaniem Bonferroni wykazała istotne różnice między trzema testami a T0 w grupie morfiny. Jak pokazano w Rysunek 2, pamięć nagrody morfiny trwała co najmniej 18 dni i zmniejszała się w trendzie zależnym od czasu. Dane pochodzą z wcześniej opublikowanego badania¹¹.

Stopniowo zwiększano liczbę wejść do bocznych przedziałów w grupie morfiny.

Grupa morfiny
Aby przetestować trend wejść, grupa (sparowana solą fizjologiczną i para morfiny) jako czynnik międzyosobowy oraz test (T0, T1, T2 i T3) jako czynnik wewnątrzobiektowy ustalono dla mieszanej ANOVA. Nie stwierdzono istotnych różnic w interakcji między grupą a testem (F (2,311,92,449) = 1,915, p = 0,147) i grupą (F(1,40) = 0,898, p = 0,349), ale stwierdzono istotność w teście (F(2,311,92,499)= 24,243, p < 0,001). Wielokrotna analiza porównawcza z testem najmniejszej istotnej różnicy (LSD) wykazała istotne różnice między T1 i T0 (p<0,001), T2 i T0 (p < 0,001) oraz T3 i T0 (p < 0,001) w grupie morfiny w wejściach sparowanych morfiną. Jeśli chodzi o kompartmenty sparowane solą fizjologiczną, istotność statystyczna istniała między T2 i T0 (p = 0,002) oraz T3 i T0 (p = 0,003), ale nie między T1 i T0 (p = 0,246), co jest podobne do wzorca inkubacji głodu heroiny²⁴. Ogólnie rzecz biorąc, liczba wejść do bocznych komór w grupie morfiny wzrastała w zależności od czasu.

Szczury częściej wchodziły do komory sparowanej morfiną niż do komory sparowanej solą w T1 (t(1,21) = -2,833, p = 0,010) i T2 (t(1,21) = -4,458, p = 0,0002), ale nie T3 (t(1,21) = -0,471, p = 0,642) (dwustronne sparowane testy t).

grupa soli fizjologicznej
Podobnie jak w przypadku grupy morfiny, zastosowano mieszaną ANOVA, która nie wykazała istotnych różnic w interakcji między grupą a testem (F(3,54) = 0,345, p = 0,793), testem (F(3,54) = 1,793, p = 0,159) i grupą (F(1,18) = 0,151, p = 0,702). Stąd wejścia do bocznych komór w grupie solankowej były stabilne w czasie.

Rysunek 2: pamięć CPP może działać co najmniej 18 dni, ale z czasem się zmniejsza. Zachowanie pamięci CPP w grupie morfiny (n = 21) i grupie soli fizjologicznej (n = 10) oceniano, mierząc wynik CPP dla kilku punktów czasowych po ostatnim kondycjonowaniu (T1, 2 dni; T2,10 dni i T3, 18 dni). Wszystkie wartości wyników CPP są średnimi ± SEM. ### oznacza p<0,001, a ## oznacza p < 0,01 w porównaniu z grupą soli fizjologicznej; wskazuje p < 0,001 w porównaniu z T0 w grupie morfiny. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Sun et al.,2017¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wejścia do komór bocznych w grupach morfiny i soli fizjologicznej. Wejścia do dwóch komór bocznych w grupie morfiny (n = 21) i grupie soli fizjologicznej (n = 10) oceniano w kilku punktach czasowych po ostatnim kondycjonowaniu (T1, 2 dni; T2,10 dni i T3, 18 dni) i w porównaniu z T0. Wszystkie wartości wejść są średnimi ± SEM. W grupie morfiny (A) wejścia do komory sparowanej morfiną wzrosły bardzo znacząco od T1 do T3, podczas gdy wejścia do komory sparowanej solą fizjologiczną wzrosły tylko znacznie od T2. Sparowane testy t z kompartmentem sparowanym morfiną i kompartmentem sparowanym solą fizjologiczną wykazały bardzo istotny wzrost zarówno T1, jak i T2. W grupie soli (B) nie ma istotnych zmian w wejściach po obu stronach. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Sun et al.,2017¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą paradygmat CPP morfiny w celu ustanowienia długotrwałej pamięci nagrody u szczura ze wskazówkami somatosensorycznymi jako kontekstem warunkowym. Aby zbudować taką długotrwałą pamięć nagrody, poprzedni protokół²¹ ze zrównoważonym aparatem CPP jest modyfikowany, a sesje soli fizjologicznej i morfiny są umieszczane w odstępie co najmniej 10 godzin. Ponadto w fazie warunkowania dodaje się więcej sesji warunkowających, aby wzmocnić uczenie się asocjacyjne. Oprócz wyników CPP, mierzone są wejścia do dwóch komór bocznych, a wzorzec zwiększonych wejść do komór bocznych jest podobny do wzorca zwiększonych aktywnych odpowiedzi w paradygmacie samodzielnego podawania.

Na ustalenie wspomnianego powyżej paradygmatu CPP wpływa kilka czynników. Jednym z kluczowych czynników jest konstrukcja aparatu: szczury na ogół powinny mieć podobne preferencje do obu komór bocznych, aby zapewnić równowagę aparatu. Niezrównoważona aparatura może maskować nabycie CPP ze względu na początkową wysoką preferencję dla jednej bocznej komory¹³. W związku z tym należy unikać skrajnego preferowania jednej bocznej komory (ponad 90% całkowitego czasu w każdej z dwóch bocznych komór) przy wyborze tekstury podłogi lub innych wskazówek kontekstowych. Dla różnych celów eksperymentalnych eksperymentatorzy mogą zrównoważyć aparat CPP, modyfikując bodźce kontekstowe. W przypadku aparatury zrównoważonej powszechnie stosuje się dwa sposoby projektowania eksperymentalnego⁴. Jednym z tendencyjnych sposobów jest łączenie leków z niepreferowaną komorą ze wszystkimi badanych; Bezstronnym sposobem jest sparowanie połowy zwierząt z narkotykami w komorze niepreferowanej, a drugiej połowy z preferowaną komorą. Oba sposoby mogą ustalić CPP¹³, ale badania^17,25 z drugim wzorem zawsze wykluczają wielu badanych ze względu na ich silną preferencję dla jednej bocznej komory. Ponieważ istnieje indywidualna podatność na uzależnienie od narkotyków 26,27,28, w tym badaniu wybrano tendencyjny projekt, aby uniknąć wykluczenia zdrowych osób. Jednym z ograniczeń stronniczego projektu jest efekt niekonsekwentnego preferowania komór bocznych. Jak pokazano na rysunku 2, szczury w grupie soli fizjologicznej mają konsekwentnie niskie wyniki CPP dla początkowej komory niepreferowanej. Tak więc możliwość, że niekonsekwentna preferencja dla komór bocznych może wpływać na wyniki CPP w grupie morfiny, jest wykluczona przez ustawienie kontroli soli fizjologicznej. Aby uniknąć efektu sufitu preferowanej komory, używamy początkowej komory niepreferowanej jako komory sparowanej morfiną. Aby uniknąć wpływu nowości i stresu na preferencję linii wyjściowej w stosunku do komór bocznych, wykonuje się trzy sesje kondycjonowania wstępnego, a trzecia sesja jest używana jako linia bazowa. Czwartym czynnikiem jest odstęp między sesjami morfiny i soli fizjologicznej. W naszym paradygmacie wybieramy odstępy co najmniej 10 godzin, aby uniknąć efektu odstawienia w okresie kondycjonowania soli fizjologicznej. Ważnym czynnikiem jest również dawkowanie morfiny. Ekstremalnie niskie dawki morfiny, takie jak 0,01 mg/kg^mc.6, nie indukowały preferencji miejsca. Dawka 10 mg/kg wywołała najwyższy wynik CPP¹⁷ u szczurów i jest powszechnie stosowana w badaniach CPP morfiny na szczurach 17,21,23. Jednak morfina w dawce 10 mg/kg (i.p.) może wywołać depresję oddechową u około 5% szczurów. Niższe dawki morfiny, takie jak 5 mg/kg, mogą być stosowane w przyszłych badaniach. W przypadku innych gatunków, takich jak ryjówka drzewna, przy tworzeniu paradygmatu CPP należy wziąć pod uwagę tolerancję na leki. Ponieważ ryjówka drzewna szybko rozwija tolerancję na morfinę, w fazie kondycjonowania należy stosować zwiększone dawki morfiny^29,30.

Dzięki zmodyfikowanemu protokołowi długotrwała pamięć nagrody jest ustanawiana na co najmniej 18 dni po 6 dniach kondycjonowania¹¹ (ryc. 2). Przyszłe badania powinny zmierzyć, czy CPP może być utrzymany przez dłuższy czas. Powtarzające się nawroty są główną przeszkodą w leczeniu uzależnienia od narkotyków. Stres, sygnały środowiskowe i leki mogą wywołać nawrót choroby. Po wygaśnięciu pamięci CPP, model ten może być wykorzystany do modelowania nawrotu wywołanego stresem lub narkotykami.

Wejścia do komór sparowanych z narkotykami w grupie morfiny zwiększyły się w okresie abstynencji¹¹ (ryc. 3), co jest podobne ze zwiększonymi reakcjami aktywnymi w paradygmacie samodzielnego podawania. Jednak liczba wejść do komory sparowanej solą również wzrosła wraz z paradygmatem CPP zarówno u szczurów, jak i ryjówek drzewnych¹¹, co różni się od nieaktywnych reakcji paradygmatu samodzielnego podawania. Różnica ta może wynikać z różnych zasad leżących u podstaw tych dwóch paradygmatów: jeden to warunkowanie klasyczne, drugi to warunkowanie instrumentalne. Poza tym ryjówki drzewiaste z doświadczeniami z pokarmem CPP nie wykazywały takiego wzorca zwiększonych wejść³⁰. Dlatego uważa się, że zwiększone wejścia do obu bocznych komór u zwierząt doświadczonych z morfiną reprezentują inkubowany głód narkotyków. Chociaż nie można wykluczyć ograniczenia stosowania powtarzających się pomiarów u jednego osobnika, wzorzec zwiększonych wpisów został zachowany u szczurów¹¹, ryjówek drzewnych^11,30 i małp³¹. Niemniej jednak, w przyszłych badaniach zdecydowanie zaleca się projektowanie między obiektami w okresie abstynencji, aby wykluczyć efekt wygaszania powtarzanych pomiarów.

Oprócz zwiększonych wejść, wyniki CPP przy niskich dawkach morfiny (1 mg/kg i 3 mg/kg) zwiększały się stopniowo w okresie abstynencji¹⁷. Wyniki te sugerują, że paradygmat CPP może również modelować inkubację zjawiska łaknienia. Jednak zwiększony wynik CPP może również reprezentować zwiększoną pamięć dla bodźca warunkowego. W tym aspekcie wejścia do komór bocznych w aparacie trójkomorowym, które są podobne do reakcji aktywnych w paradygmacie samodzielnego podawania, bardziej przypominają poszukiwanie narkotyków lub nagradzające działanie leków. Interesujące byłoby sprawdzenie tendencji wejść do bocznych komór w okresie abstynencji w szczurzych paradygmatach CPP niższych dawek morfiny. Przyszłe badania z innymi lekami i myszami powinny zostać przeprowadzone, aby zweryfikować, czy zjawisko to jest konserwatywne w przypadku nadużywanych narkotyków/gatunków.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morfina	Shenyang Pierwsza fabryka
Aparatura CPP / Kamera	Anlai Technology Company
SPSS	IBM Inc