Method Article

Identyfikacja, charakterystyka histologiczna i sekcja płatów prostaty myszy dla modeli hodowli sferoidalnych 3D in vitro

DOI:

10.3791/58397

⸱

September 18th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Urology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, SUNY Upstate Medical University, 3Laboratory of Comparative Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 4Boulder BioPATH, Inc

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetycznie modyfikowane myszy są użytecznymi modelami do badania mechanizmów raka prostaty. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji i preparowania płatów prostaty z układu moczowo-płciowego myszy, różnicowania ich na podstawie histologii oraz izolowania i hodowli pierwotnych komórek prostaty in vitro jako sferoid do dalszych analiz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) służą jako skuteczne modele przedkliniczne do badania większości typów nowotworów u ludzi, w tym raka prostaty (PCa). Zrozumienie anatomii i histologii prostaty myszy jest ważne dla efektywnego wykorzystania i właściwej charakterystyki takich modeli zwierzęcych. Prostata myszy ma cztery odrębne pary płatów, z których każdy ma swoje własne cechy. W artykule przedstawiono prawidłową metodę preparacji i identyfikacji płatów prostaty myszy do analizy choroby. Po rozbiorowaniu komórki prostaty mogą być dalej hodowane in vitro w celu zrozumienia mechanistycznego. Ponieważ pierwotne komórki prostaty myszy mają tendencję do utraty swoich normalnych cech podczas hodowli in vitro, przedstawiamy tutaj metodę izolowania komórek i hodowania ich jako kultur sferoidalnych 3D, która jest skuteczna w zachowaniu fizjologicznych cech komórek. Te hodowle 3D mogą być wykorzystywane do analizy morfologii i zachowania komórek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, badania zmienionych poziomów i lokalizacji kluczowych białek i szlaków zaangażowanych w rozwój i postęp choroby oraz przyglądania się reakcjom na leczenie farmakologiczne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Społeczność naukowa od dziesięcioleci próbuje wyjaśnić skomplikowany mechanizm rozwoju nowotworów u ludzi. Podczas gdy identyfikacja potencjalnych kluczowych graczy i celów leków rozpoczyna się od badań nad komórkami i tkankami pacjentów, translacyjne zastosowanie takich wyników często wymaga wykorzystania przedklinicznych modeli zwierzęcych. Wykorzystanie genetycznie modyfikowanych modeli myszy (GEMM) do modelowania nowotworów u ludzi stale rośnie od czasu ustanowienia Konsorcjum Mysich Modeli Nowotworów Ludzkich (NCI-MMHCC), komitetu, który starał się opisać i ujednolicić cechy mysich modeli raka dla naukowców na całym świecie1,2. Modele mysie zaspokajają potrzebę badań mechanistycznych w badaniach przedklinicznych większości typów raka, aby zrozumieć rozwój, progresję, odpowiedź na leczenie i nabytą oporność3.

Rak prostaty jest najczęściej występującym nowotworem u mężczyzn, dotykającym ponad 160 000 mężczyzn każdego roku4. Agresywne formy choroby pochłaniają każdego roku dziesiątki tysięcy istnień ludzkich. Jednak mechanizm progresji choroby jest nadal słabo poznany. Powoduje to poważny brak skutecznych opcji leczenia zaawansowanego i przerzutowego raka prostaty, o czym świadczy wysoka śmiertelność u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty4. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na modele przedkliniczne do badania raka prostaty. Jednak ze względu na nieodłączne różnice między prostatą mysią a ludzką, modelowanie raka prostaty w GEMM nie zyskało popularności do czasu wprowadzenia systemu klasyfikacji Bar Harbor w 2004 roku, który nakreślił zmiany histopatologiczne w prostacie myszy po manipulacji genetycznej, identyfikacji zmian nowotworowych i ich związku z etapami progresji raka u ludzi5. Jedną z ważnych cech prostaty myszy, którą należy wziąć pod uwagę podczas badania dowolnego modelu GEMM prostaty, jest obecność czterech odrębnych par płatów: przedniego, bocznego, brzusznego i grzbietowego. Płaty wykazują znaczące różnice w histopatologii i wzorcu ekspresji genów6. Wzorzec ekspresji białka probasin może się różnić między płatami u młodych myszy po okresie dojrzewania7, co należy wziąć pod uwagę, ponieważ modele GEMM oparte na Cre są w większości projektowane przy użyciu promotora opartego na probasinie o nazwie Pb-Cre47. Wynikające z tego przestrzenne i czasowe różnice w ekspresji Cre często prowadzą do różnic w czasie inicjacji i progresji guza, a także różnic w zmianach nowotworowych między płatami. Dlatego ważne jest, aby uwzględnić takie różnice podczas badania rozwoju guza w prostacie GEMMs, a poszczególne płaty mogą wymagać osobnej oceny w celu uzyskania powtarzalnych wyników. W pierwszej części tego artykułu opisano właściwe metody preparowania prostaty myszy, identyfikacji i oddzielenia każdego płata oraz rozpoznania różnic histologicznych między płatami.

Chociaż analiza wzrostu guza i histopatologii może dostarczyć cennych informacji na temat rozwoju guza, nie dostarczają one zbyt wielu informacji o mechanizmach molekularnych. Aby zbadać mechanizm rozwoju i progresji guza, często przydatna jest analiza komórek nowotworowych in vitro. Na przestrzeni lat zasugerowano kilka metod, które obejmują hodowle tych komórek, w tym hodowle zawiesinowe, kultury 3D8, a ostatnio regularne kultury 2D9. Podczas gdy większość z tych metod skutkuje dobrymi wskaźnikami przeżycia i proliferacji komórek, hodowle 3D zapewniają środowisko najbardziej zbliżone do warunków fizjologicznych. W kulturach 3D lub sferoidalnych hodowanych w macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej (ECM) w pełni zróżnicowane komórki luminalne mają zwykle bardzo niski wskaźnik przeżycia; Jednak komórki podstawowe i pośrednie (głównie komórki macierzyste) są zdolne do rozmnażania się i wytwarzania klastrów komórkowych zwanych sferoidami10. To sprawia, że nadaje się do badań nad rakiem, ponieważ uważa się, że nowotwory nabłonkowe pochodzą z komórek macierzystych (popularnie znanych jako rakowe komórki macierzyste)11. Druga część tego protokołu opisuje metodę hodowli komórek prostaty myszy w hodowlach 3D. Uzyskane w ten sposób kule mogą być wykorzystywane do kilku rodzajów dalszych analiz, w tym do badania morfologii i zachowania organoidów za pomocą obrazowania żywych komórek, barwienia immunofluorescencyjnego dla różnych białek oraz badania odpowiedzi na leczenie chemioterapeutyczne.

Ogólnie, celem tego protokołu jest nakreślenie optymalnych metod wykorzystania modeli mysich w raku prostaty poprzez opisanie anatomii i technik preparacji prostaty myszy oraz przetwarzania tkanki do hodowli sferoidalnych i analizy in vitro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zawartymi w instytucjonalnych protokołach zatwierdzonych przez IACUC na Uniwersytecie Medycznym SUNY.

1. Rozwarstwienie układu moczowo-płciowego (UGS)

Uwaga: Schemat jest przedstawiony w Rysunek 1.

  1. Poddaj eutanazji 3-miesięcznego samca myszy C57BL/6 przy użyciu metody eutanazji wziewnej CO2 lub innej zatwierdzonej techniki.
    Uwaga: Myszy w wieku od 3 do 12 miesięcy mogą być z powodzeniem wykorzystane w eksperymencie. Starsze myszy (> 6 miesięcy) najprawdopodobniej będą miały więcej tłuszczu wokół UGS, który będzie musiał zostać usunięty. Identyfikacja i oddzielenie płatów jest często trudne u myszy młodszych niż 3 miesiące. Do eksperymentu można również użyć innych szczepów.
  2. Połóż mysz na plecach i zabezpiecz nogi za pomocą szpilek, tak aby brzuszna strona zwierzęcia była odsłonięta.
  3. Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem i wytrzyj go do czysta.
    Uwaga: Golenie włosów na brzuchu przed sekcją nie jest wymagane.
  4. Podnieś skórę z brzucha wraz z warstwą mięśniową za pomocą pary średnio kleszczy i wykonaj odwrócone nacięcie w kształcie litery Y na brzuchu za pomocą nożyczek.
    1. Najpierw wykonaj proste nacięcie ostrymi nożyczkami od momentu tuż nad penisem do mostka (Rysunek 2a).
    2. Ciąć od podstawy nacięcia w kierunku każdego palca u nogi, aż do ud (Rysunek 2b). Odchyl skórę po obu stronach i na dole, aby wyświetlić cały obszar brzucha (Rysunek 2c-e).
      Uwaga: Rozmiar cięcia różni się w zależności od wieku i rozmiaru myszy. Wielkość początkowego prostego nacięcia może wynosić od 1,5 do 4 cm, w zależności od wielkości myszy.
  5. Przesuń się nad innymi narządami, aby odsłonić PMG. Podnieś i przesuń brązowo-żółte jelita (Rysunek 2f). Podnieś kleszczem poduszeczki tłuszczowe brzucha (nieprzezroczystą, białą, gąbczastą tkankę) i przesuń je na boki (Rysunek 2g).
    Uwaga: PMG składa się z pęcherzyków nasiennych, cewki moczowej, prostaty, przewodu nasieniowodowego i pęcherza moczowego. Można go rozpoznać po charakterystycznej parze nieprzezroczystych białych półkolistych łuków (które są pęcherzykami nasiennymi), z wypełnionym płynem workiem pęcherza moczowego przyczepionym do podstawy. Półprzezroczysta tkanka znajdująca się tuż pod pęcherzykami nasiennymi to prostata.
  6. Zlokalizuj PMG, mocno chwyć pęcherz moczowy kleszczami i podnieś cały PMG do góry z brzucha myszy.
    Uwaga: Jeśli pęcherz jest pełny, najpierw opróżnij go małą strzykawką, aby zapewnić lepszy chwyt kleszczyków i zmniejszyć ryzyko pęknięcia pęcherza.
  7. Kontynuując podciąganie na pęcherzu, wsuń nożyczki pod pęcherz i prostatę aż do kręgosłupa i wykonaj cięcie. Przeciąć wszystkie pozostałe połączenia z jamą brzuszną (Rysunek 2h i 2i). Uważaj, aby nie ciąć zbyt blisko PMG, aby uniknąć przypadkowego przecięcia tkanki prostaty.
    Uwaga: Podczas wykonywania cięcia pod UGS nożyczki należy włożyć aż do tyłu myszy, tak aby cięcie zatrzasnęło również kręgosłup. Metoda ta powoduje przecięcie prawie wszystkich połączeń między PMG a jamą brzuszną za jednym wycinkiem, skracając czas potrzebny na wydobycie tkanki od myszy.
  8. Usuń PMG i umieść go w 2-6 ml (wystarczająco dużo, aby pokryć tkankę) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco (DMEM, wysoka glukoza) na 6 cm szalce Petriego (Ryc. 2j i 2k) i przenieś do mikroskopu preparacyjnego (powiększenie 10x).
    Uwaga: Zmień media preparujące zgodnie z wymaganiami w pozostałych krokach.

2. Sekcja prostaty

  1. Usuń cały tłuszcz zarówno z grzbietowej, jak i brzusznej strony za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji (Rysunek 3a). Użyj podobnych narzędzi chirurgicznych do pozostałej części protokołu sekcji.
    Uwaga: Tłuszcz jest często ściśle spleciony z PMG (można go rozpoznać po białym, gąbczastym wyglądzie); Dlatego ten krok należy wykonać ostrożnie, aby uniknąć przypadkowego odcięcia tkanki prostaty. Usunięcie całego tłuszczu może zająć do 10-15 minut.
  2. Przytrzymaj i pociągnij pęcherz kleszczami i odetnij go u podstawy nożyczkami (Rysunek 3b).
  3. Umieść pozostałą tkankę brzuszną stroną do góry. Przytrzymaj jeden przewód pokarmowy za pomocą kleszczy, prześledź go nożyczkami do podstawy i odetnij (Rysunek 3c), a następnie powtórz po drugiej stronie. Usuń przewód nasieniowodowy, pozostawiając prostatę (półprzezroczystą i robaczą), pęcherzyki nasienne (nieprzezroczyste i białe, półkoliste) i cewkę moczową (różowo-czerwoną i nieprzezroczystą rurkę) (Rysunek 3d i 3e).
  4. Włóż kleszcze między wewnętrzny łuk pęcherzyków nasiennych a przednie płaty tkanki prostaty. Podważ pęcherzyki nasienne i prostatę, a w razie potrzeby odetnij tkankę łączną (Rysunek 3f). Prześledź pęcherzyki nasienne do ich podstawy w cewce moczowej i usuń je (Ryc. 3g i 3h). Uważaj, aby ich nie przebić.
  5. Przystąp do wypreparowania poszczególnych płatów prostaty.

3. Ogólna anatomia prostaty i mikrodysekcja poszczególnych płatów (Rysunki 3i-n, Rysunek 4)

  1. Odwróć tkankę za pomocą kleszczy tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, pokazując płaty grzbietowe, które będą przypominać skrzydła motyla.
  2. Zbierz płaty grzbietowe, przytrzymując płat kleszczami i przecinając podstawę nożyczkami (Rysunek 3j).
  3. Odwróć pozostałą tkankę na stronę brzuszną.
  4. Zbierz płaty boczne, które są małe i zwykle owijają cewkę moczową z boku, które są zaklinowane między płatem przednim, brzusznym i grzbietowym (Rysunek 3k).
  5. Następnie zbierz płaty brzuszne, które są większe niż płaty boczne i leżą brzusznie na cewce moczowej (Ryc. 3l).
  6. Na koniec zbierz płaty przednie, największe z czterech, przecinając i odrzucając cewkę moczową (Rysunek 3m).
  7. Przetwarzaj kawałki tkanek zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Przejdź do sekcji 4 dla histologii lub do sekcji 5 dla hodowli sferoidalnej.

4. Identyfikacja i morfologia płatów na podstawie preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną

  1. Napraw tkankę prostaty i zanurz ją w parafinie. Kontynuuj barwienie szkiełek hematoksyliną i eozyną (H&E), aby wyświetlić i zidentyfikować różnice w płatach prostaty na podstawie histologii, przy użyciu cech opisanych przez Oliveira i wsp. 12 (Rysunek 5).

5. Przetwarzanie tkanki do hodowli 3D10

Uwaga: Jest to opisane w Rysunek 6.

  1. Kontynuuj hodowlę całej prostaty lub poszczególnych płatów zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Przenieś tkankę prostaty do 10 cm naczynia zawierającego 2-3 ml DMEM. Za pomocą skalpela zmielić kanaliki krokowe tak drobno i równomiernie, jak to możliwe pod mikroskopem preparacyjnym.
  2. Kontynuuj pozostałe kroki pod kapturem do hodowli tkankowej, w sterylnych warunkach.
  3. Przenieś kawałki tkanki wraz z DMEM do probówki o pojemności 15 ml i zwiększ objętość do 9 ml za pomocą DMEM. Dodaj 1 ml 10-krotnego roztworu podstawowego kolagenazy do mieszaniny DMEM-tkanka i zwiruj do mieszania.
    Uwaga: Podstawowy roztwór kolagenazy wynosi 10 mg/ml w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI), a końcowe stężenie w probówce 15 ml wynosi 1 mg/ml.
  4. Umieścić probówkę na wytrząsarce żyratorowej lub rotatorze rurki na 2 godziny w temperaturze 37 °C, aby kolagenaza mogła zdegradować macierz zewnątrzkomórkową.
  5. Odwirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml ciepłej 0,05% trypsyny-EDTA, aby rozszczepić zrosty komórka-komórka i macierz komórkowa. Przenieść probówkę do temperatury 37 °C na 5 min.
    Uwaga: Jeśli kawałki tkanki są zbyt duże, aby dobrze się wymieszać, odetnij końcówkę pipety żyletką, aby uzyskać szerszy otwór.
  7. Rozbij wszelkie grudki tkanek, pipetując pipetą P1000 8-10 razy, a następnie powtórz za pomocą pipety P200.
  8. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 3 ml kompletnego DMEM. Dodaj 500 j. DNAazy I i dobrze wymieszaj.
  9. Przepuścić przez strzykawkę 5 ml 5-10 razy za pomocą igły 18 G. Następnie przetrzyj 5 razy za pomocą igły 20 G.
  10. Powtórz kroki 4-8 jeszcze raz, jeśli roztwór nadal zawiera duże kawałki tkanki.
  11. Przefiltrować zawiesinę komórek przez filtr 40 μm umieszczony na probówce o pojemności 50 ml. Przepłukać probówkę o pojemności 15 ml 5 ml DMEM i przepuścić przez ten sam filtr. Powtórz płukanie.
  12. Wyrzucić filtr i odwirować probówkę zawierającą przepływowy płyn o stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

6. Posiewanie i hodowla komórek

  1. Zawiesić osad w 0,5 ml kompletnego podłoża do wzrostu komórek nabłonka prostaty (PrEGM). Policz gęstość komórek za pomocą licznika komórek lub hemocytometru i rozcieńcz komórki do 5 x 105 komórek/ml w pełnym PrEGM.
    Uwaga: Wydajność z 3-miesięcznej myszy całej prostaty może wynosić od 3 x 10 5-10 6 komórek. Dlatego ważne jest, aby początkowo ponownie zawiesić osad w nie więcej niż 0,5 ml PrEGM (jak wspomniano powyżej), aby można było osiągnąć pożądaną gęstość komórek, nawet przy niskiej wydajności.
  2. Wymieszaj wymaganą objętość komórek z ECM błony podstawnej w stosunku objętościowym 2:3 (60% ECM błony podstawnej i 40% zawiesiny komórek) i płytkę na płytce wielodołkowej lub szkiełku komorowym zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi.
    Uwaga: W przypadku barwienia immunologicznego płytkę na szklanym dnie lub szkiełka komorowe, zakrywające całą studzienkę lub środek studzienki. Płytkę wokół krawędzi studzienki, jeśli liczysz powstałe organoidy, lub płytkę w postaci kilku kropelek na całej studzience, jeśli posiewasz większe objętości. Uważaj, aby nie rozprowadzać go zbyt grubo ani zbyt cienko. Umieścić na płytce co najmniej 100 μl mieszaniny komórek matrycowych na 1cm2 powierzchni posiewu; Na przykład w szkiełku komorowym o powierzchni 2 cm2-dołkowej należy posiać 200 μl mieszaniny matryca-komórka zawierającej 5 x 104 komórek.
  3. Przenieść płytkę/szkiełko do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 30 minut, aby ECM membrany podstawowej zestalił się. Następnie dodaj wstępnie podgrzany kompletny PrEGM, aby przykryć studnię, uważając, aby nie naruszyć wtyczki ECM membrany podstawnej.
  4. Usuń połowę pożywki i dodawaj nową pożywkę co 2-3 dni. Hoduj sferoidy przez 5-10 dni.
  5. Kontynuuj zbieranie (krok 7), barwienie immunologiczne (krok 8) i/lub obrazowanie do dalszych zastosowań.

7. Zbieranie kul

  1. Aby zebrać kulki, należy ostrożnie zassać pożywkę, nie naruszając korka żelowego ECM błony podstawnej i dodać 1 ml roztworu dyspazy 1 mg/ml w PrEGM na 100 μl błony podstawnej ECM.
    Uwaga: Łatwiej jest zbierać sferoidy, jeśli są one platerowane na środku studzienki lub na brzegu (zamiast przykrywać całą studzienkę), aby zapewnić dodanie odpowiedniej ilości roztworu dypazy do studzienki.
  2. Zeskrobać spód płytki za pomocą skrobaka do komórek, aby usunąć żel ECM z membrany podstawnej do roztworu dispase-PrEGM.
  3. Odpipetować cały roztwór w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl o szerokim otworze lub pipety o pojemności 5 ml, aby rozbić korek żelowy na mniejsze kawałki.
    Uwaga: Odetnij końcówkę końcówki do pipety o pojemności 1000 μl żyletką, aby uzyskać końcówkę o szerokim otworze.
  4. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1-2 godziny, aż do całkowitego rozpuszczenia ECM błony podstawnej.
    Uwaga: Można to zapewnić poprzez oględziny dna studzienki podczas przechylania płytki, aby upewnić się, że nie pozostały już żadne kawałki żelu.
  5. Zawiesinę komórkową należy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  6. Odwirować kule przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i kontynuować dalsze aplikacje.

8. Barwienie immunologiczne sfer13

Uwaga: Po tym, jak sferoidy rosną przez pożądany czas, ECM błony podstawnej mogą zostać rozpuszczone, a kule mogą zostać zabarwione, jak opisano w Colicino et al.13.

  1. Na krótko przepłukać kultury PBS i dodać 4% paraformaldehydu (PFA) bezpośrednio do zatyczki żelowej ECM z membraną podstawną. Inkubować przez 30-90 minut w temperaturze pokojowej, powoli wstrząsając, aż do całkowitego rozpuszczenia ECM błony podstawnej, zastępując świeży PFA co 30 minut.
    Uwaga: PFA rozpuści korek żelowy i naprawi sferoidy podczas tego procesu.
  2. Następnie przemyj PBS 3 razy i dodaj 50 mM chlorku amonu przez 10 minut, aby ugasić autofluorescencję z PFA. Powtórz dla 3 prań z PBS.
  3. Przepuszczać 0,1% detergentem niejonowym przez 5 min i blokować PBSAT (PBS, 1% BSA, 0,5% Triton X-100) przez 30 min.
  4. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w PBSAT przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie 3 przemywania PBSAT i przeciwciałem drugorzędowym w PBSAT przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. W razie potrzeby powtórz pranie za pomocą PBSAT i zabejcuj DAPI zgodnie z protokołem producenta. Umyj 3 lub więcej razy za pomocą PBS.
  6. Dodać PBS z 200 mM odczynnikiem przeciw blaknięciu 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO) i przystąpić do obrazowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płaty prostaty myszy można zidentyfikować i wypreparować na podstawie ich lokalizacji względem pęcherzyków nasiennych i cewki moczowej. Prostata myszy składa się z 4 par płatów położonych grzbietowo i brzusznie do pęcherzyków nasiennych i cewki moczowej. Rysunek 4a i 4b (na górze) pokazują widok grzbietowy i brzuszny nienaruszonej prostaty, wraz z pęcherzykami nasiennymi i cewką moczową. Dolne panele (Rysunek 4c i 4d

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metody preparacji prostaty myszy i identyfikacji poszczególnych płatów. Opisano również protokół hodowli mysich komórek prostaty w hodowli 3D do analizy in vitro .

Krytycznym krokiem w protokole sekcji jest (1) pobranie całego PMG od myszy i oddzielenie poszczególnych narządów pod mikroskopem preparacyjnym. Tkanka prostaty jest bardzo mała i otoczona resztą PMG; W związku z tym praktycznie niemożliwe jest pobranie narządu bezpośrednio z jamy ciała przy jednocz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant z National Cancer Institute, R01CA161018 dla LK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Instrumenty chirurgiczne myszy (zestaw do preparowania myszy)World Precision InstrumentsMOUSEKIT
Mikroskop
RPMI mediumThermofisher Scientific11875093
Pożywka preparcyjna (DMEM + 10% FBS)Thermofisher Scientific11965-084
Surowica bydlęcapłodu Thermofisher Scientific
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Thermofisher Scientific10010031
KolagenazaThermofisher Scientific17018029Zrób 10x zapas (10 mg / ml) w RPMI, przefiltruj sterylizację, porcję i przechowuj w temperaturze -20 &; C
Trypsyna-EDTA (0,05%)Thermofisher Scientific25300054
DNase ISigma-Aldrich10104159001 
Fisher Scientific
Fisherbran  Sterylne sitka do komórek, 40μ mFisher Scientific22-363-547
Zestaw pocisków PrEGM LonzaCC-3166Dodaj wszystkie składniki, porcję i przechowuj w temperaturze -20 °C.
Matrigel membrana matrycowaThermofisher ScientificCB-40234
Dispase II w proszkuThermofisher Scientific17105041Zrób 10x zapas (10 mg / ml) w PrEGM, wysterylizuj filtr, podwielokrotność i przechowuj w temperaturze -20 &; Z
preparacyjny10438018 Strzykawki i igły ROCHE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
  2. Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111(2009).
  3. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  4. Society, A. C. Cancer Facts and Figures. , (2018).
  5. Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
  6. Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
  7. Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
  8. Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
  9. Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
  10. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
  11. Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
  12. Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
  13. Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
  14. Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
  15. Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238(2011).
  16. Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26(2012).
  17. Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Prostate LobesProstate Dissection3D Spheroid CultureCell IsolationTissue DigestionBasement MembraneExtracellular MatrixProstate Epithelial CellsOrganoid FormationBeta Catenin Staining

Related Articles