Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) to złożony rodzaj uszkodzenia mózgu, który powstaje w wyniku detonacji urządzeń wybuchowych^1,2. Blast TBI stał się poważnym problemem zdrowotnym w ciągu ostatnich 15 lat w związku z niedawnymi konfliktami zbrojnymi w Iraku i Afganistanie^2,3. Ogólnie rzecz biorąc, szacuje się, że od 4,4% do 22,8% żołnierzy powracających z Iraku i Afganistanu doznało łagodnego TBI, z czego duża część jest związana z wybuchem, przy czym wskaźnik TBI wybuchu jest wyższy w siłach amerykańskich w porównaniu z siłami brytyjskimi^4,5.

Użycie improwizowanych urządzeń wybuchowych było odpowiedzialne za większość urazów związanych z wybuchem, w tym TBI wybuchu, które przeżyły siły wojskowe⁶. Detonacja ładunku wybuchowego powoduje bardzo szybki – ale przejściowy – wzrost ciśnienia, który następuje w ciągu milisekund. Wynikająca z tego fala nadciśnienia spowodowana eksplozją w rzeczywistym polu swobodnym jest modelowana przez funkcję Friedlandera, z nagłym wzrostem szczytowego nadciśnienia, po którym następuje wykładniczy zanik^7,8. Zakres ekstremalnych sił i ich szybki przebieg w czasie obserwowany w przypadku wybuchu zwykle nie występuje w urazach niezwiązanych z wybuchem^1,9. Uważa się, że szczytowe nadciśnienie, które jest maksymalnym ciśnieniem kształtu fali, oraz czas trwania fali dodatniej są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do uszkodzenia mózgu w wyniku wybuchu, a te zależą od ładunku wybuchowego i odległości od detonacji^10,11.

Uraz wynikający z wybuchu jest klasyfikowany jako cztery odrębne składniki, oznaczone jako główne, drugorzędne, trzeciorzędowe i czwartorzędowe uszkodzenie wybuchu^10,12,13,14. Każdy z tych elementów jest związany z określonymi mechanizmami urazu. Pierwotne uszkodzenie spowodowane wybuchem wynika z bezpośredniego działania fali nadciśnienia na narządy i tkanki^2,13. Wtórne obrażenia od wybuchu wynikają z uderzenia odłamków pocisku, powodując rany penetrujące i niepenetrujące^2,15. Trzeciorzędne obrażenia spowodowane wybuchem występują, gdy ciało ofiary jest przemieszczone o ziemię lub otaczające obiekty i są związane z siłami przyspieszania/zwalniania^1,10,13. Czwartorzędowe obrażenia spowodowane wybuchem opisują niejednorodną grupę urazów bezpośrednio związanych z eksplozją, które nie są objęte pierwszymi trzema opisanymi mechanizmami urazów^12,13. Obejmuje to (między innymi) urazy termiczne, wdychanie dymu, promieniowanie, fale elektromagnetyczne i niekorzystne skutki psychologiczne^13,15. Większość TBI związanych z wybuchem wynika bezpośrednio z pierwszych trzech mechanizmów urazu, podczas gdy czwartorzędowe mechanizmy uszkodzenia wybuchowego są zwykle związane z urazem ogólnoustrojowym¹³. Wpływ sił przyspieszających/zwalniających (np. urazów kręgosłupa szyjnego), i penetrujących urazowych uszkodzeń mózgu był szeroko badany w odniesieniu do innych rodzajów TBI (np. wypadki samochodowe, upadki, urazy balistyczne). Jednak pierwotna fala nadciśnienia wybuchowego jest unikalna dla uszkodzenia wybuchowego, a jej wpływ na tkankę mózgową jest znacznie mniej zrozumiały¹⁶. Pierwotne mechanizmy uszkodzeń spowodowanych wybuchem, związane z falą nadciśnienia, są pierwszymi siłami mechanicznymi, które oddziałują z mózgiem.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano liczne przedkliniczne modele TBI, które były nieocenione dla zrozumienia mechanizmów uszkodzenia i patofizjologii TBI oraz zbadania potencjalnych nowych metod leczenia, które w innym przypadku byłyby niemożliwe do wykonania wyłącznie w warunkach klinicznych^17,18,19. Chociaż żaden pojedynczy model przedkliniczny nie jest w stanie odtworzyć złożoności klinicznego urazu mózgu spowodowanego wybuchem, zazwyczaj różne przedkliniczne modele TBI odtwarzają różne aspekty TBI u ludzi. Niszczące działanie sił związanych z wybuchem może być badane w izolacji lub w połączeniu zarówno w modelach TBI wybuchów in vitro, jak i in vivo. Modele in vitro mają tę zaletę, że pozwalają na ścisłą kontrolę środowiska eksperymentalnego (warunki fizjologiczne tkanek i biomechanika urazu), co zmniejsza zmienność biologiczną i poprawia odtwarzalność, umożliwiając badanie określonych kaskad molekularnych bez czynników zakłócających obecnych w modelach zwierzęcych²⁰. Naszym celem było opracowanie modelu in vitro w celu zbadania wpływu pierwotnego wybuchu na tkankę mózgową. Naszym celem było opracowanie modelu z naddźwiękową falą uderzeniową o kształcie fali Friedlandera reprezentatywnym dla eksplozji w polu swobodnym, takiej jak ta wytwarzana przez improwizowane urządzenie wybuchowe (IED).

Eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) w Wielkiej Brytanii z 1986 roku i zostały zatwierdzone przez Animal Welfare & Ethical Review Body of Imperial College London. Opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi Imperial College London.

1. Przygotowanie i hodowla organicotypowych plastrów hipokampa

UWAGA: Ten protokół pozwala na produkcję organotypowych wycinków hipokampa zgodnie z metodą interfejsu opisaną przez Stoppiniego i współpracowników z niewielkimi modyfikacjami^21,22,23. Idealnie byłoby, gdyby nie więcej niż trzy zwierzęta zostały poddane eutanazji i sekcji podczas jednej sesji, aby upewnić się, że każdy krok zostanie wykonany szybko i uniknąć pogorszenia jakości plastrów. Przez cały czas należy stosować technikę aseptyczną.

1. Upewnij się, że przed rozpoczęciem protokołu sekcji podjęto następujące kroki.
   1. Przygotuj i przefiltruj wszystkie roztwory z wyprzedzeniem za pomocą filtra 0,22 μm.
   2. Roztwory należy utrzymywać w temperaturze 4 °C podczas przechowywania oraz podczas preparowania mózgu i przygotowywania plastrów hipokampa, trzymając pojemniki do przechowywania i szalki Petriego na metalowym radiatorze przez cały czas na mokrym lodzie.
   3. Autoklawuj wszystkie metalowe instrumenty, pierścienie i chusteczki papierowe.
   4. Upewnij się, że wszystkie instrumenty i materiały, które mają być użyte na każdym etapie protokołu, są gotowe do użycia, ułożone z wyprzedzeniem i spryskane 70% etanolem. Upewnij się, że mogą ostygnąć i wyschnąć.
2. Poddaj eutanazji 5-7-dniowe szczenię myszy C57BL/6N przez zwichnięcie szyjki macicy i krótko przetrzyj całą powierzchnię skóry sterylną chusteczką papierową nasączoną 70% etanolem. Osusz skórę i odetnij głowę szczeniakowi za pomocą nożyczek Mayo.
3. Przetnij skórę głowy nożyczkami do tęczówki wzdłuż linii środkowej głowy, zaczynając w okolicy potylicznej, a kończąc w pobliżu pyska i cofnij ją na boki.
4. Włóż końcówkę nożyczek Vannas w otwór wielki i wykonaj dwa małe boczne nacięcia na kości wzdłuż zatok poprzecznych, a następnie przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej aż do opuszki węchowej i wykonaj dwa małe nacięcia prostopadle do linii środkowej w tym obszarze.
5. Za pomocą drobno zakrzywionych kleszczy odsuń płaty kości bocznie od linii środkowej, ostrożnie wyjmij mózg małą szpatułką i przenieś go na 90-milimetrową płytkę Petriego pokrytą elastomerem silikonowym, zawierającą "podłoże preparacyjne".
   UWAGA: Pożywka preparcyjna to zbilansowany roztwór soli Geya (5 mg/ml D-glukozy, 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, z 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 mg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B).
6. Usuń móżdżek i oddziel półkule mózgowe wzdłuż linii środkowej za pomocą żyletki. Za pomocą szpatułki przenieś półkule mózgowe na nową, pokrytą elastomerem silikonowym 90 mm szalkę Petriego, wypełnioną świeżym, lodowatym podłożem preparacyjnym. Jeśli w jednej sesji ma być wykorzystane więcej niż jedno zwierzę, powtórz kroki 1.2–1.6.
7. Pod mikroskopem stereoskopowym przeciąć opuszkę węchową i czubek kory czołowej żyletką i oddzielić korę mózgową od reszty tkanki mózgowej za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Ten krok pozostawia hipokamp odsłonięty na przyśrodkowej powierzchni tkanki korowej. Od tego kroku należy używać kaptura do hodowli tkanek z przepływem laminarnym (sterylizowanego ultrafioletem i czyszczonego 70% roztworem etanolu).
8. Nałóż lodowato zimne podłoże preparacyjne na płaską plastikową tarczę do krojenia i za pomocą szpatułki ustaw tkankę mózgową na dysku tak, aby przyśrodkowa powierzchnia kory była skierowana do góry, a oś hipokampa była prostopadła do osi ostrza do siekania.
9. Usuń jak najwięcej pożywki preparacyjnej z tarczy do siekania za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką.
10. Pokrój mózg na plastry o grubości 400 μm za pomocą rozdrabniacza do tkanek z prędkością i siłą rozdrabniania 50%.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby ten krok został wykonany tak szybko, jak to możliwe, ponieważ tkanka mózgowa nie jest zanurzona w pożywce preparującej.
11. Zastąp pożywkę do preparacji na szalce Petriego pokrytej elastomerem silikonowym świeżą, lodowatą pożywką.
12. Po zakończeniu rozdrabniania tkanek ostrożnie zanurz tkankę mózgową w świeżym pożywce preparacyjnej i przenieś przeciętą tkankę z powrotem na 90-milimetrową szalkę Petriego pokrytą elastomerem silikonowym za pomocą skalpela z prostym ostrzem.
13. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie oddziel plastry kory mózgowej za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Dla każdego plasterka sprawdź hipokamp pod kątem morfologii i potencjalnych uszkodzeń tkanek wynikających z rozcięcia lub krojenia.
14. Oddziel hipokampy od kory śródwęchowej i od fimbrii za pomocą kleszczy z cienką końcówką i małych nożyczek Vannas. Zazwyczaj na półkulę generowanych jest około 6 do 8 wycinków hipokampa.
15. Przenieś do 6 wycinków hipokampa do wkładki do hodowli tkankowej za pomocą pociętej pipety Pasteura i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że plasterki są rozłożone w odległości kilku milimetrów od siebie (zapewni to, że każdy plasterek będzie mógł być obrazowany indywidualnie).
16. Natychmiast dodaj lodowatą "pożywkę wzrostową" na dno każdej szalki Petriego, pod wkładką do hodowli tkankowej, tuż poniżej górnej krawędzi wkładki do hodowli tkankowej.
    UWAGA: Pożywka wzrostowa zawiera 50% minimum niezbędnego podłoża Eagle, 25% zrównoważonego roztworu soli Hanksa, 25% surowicy końskiej, 5 mg/ml D-glukozy, 2 mmol/L L-glutaminy, 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego i 10 mmol/L HEPES, miareczkowanych do pH 7,2 wodorotlenkiem sodu.
17. Zmienić pożywkę następnego dnia po rozbiorze, a następnie co 2 do 3 dni (użyć pożywki wzrostowej w temperaturze 37 °C). Upewnij się, że pożywka wzrostowa została dodana w wystarczającej ilości, ale nie na tyle, aby przelała się przez błonę wkładki do hodowli tkankowej, co mogłoby zagrozić żywotności wycinków tkanki.
18. Plastry tkanek należy przechowywać w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla w powietrzu przez 12 do 14 dni przed użyciem w eksperymentach.

2. Przygotowanie wycinków organotypowych hipokampa do eksperymentalnego protokołu TBI Blast

UWAGA: Wszystkie etapy tej sekcji, z wyjątkiem obrazowania, odbywają się w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym.

1. Włóż wykonane na zamówienie pierścienie ze stali nierdzewnej do płytki 6-dołkowej (po jednym na dołek).
   UWAGI: Pierścienie mają obręcz z wycięciem (które powinno znajdować się w pozycji godziny 12) i ściśle przylegają do studzienek, podczas gdy wkłady do hodowli tkankowych łatwo mieszczą się w tej obręczy. Upewnij się, że pierścienie zostały umyte bakteriobójczym środkiem dezynfekującym, dokładnie spłukane oczyszczoną wodą, autoklawowane i pozostawione do wcześniejszego ostygnięcia.
2. Napełnić studzienkę 6-dołkowej płytki wstępnie podgrzanym (37 °C) "eksperymentalnym podłożem" bez surowicy z jodkiem propidyny.
   UWAGA: Pożywka doświadczalna z jodkiem propidyny to: 75% Minimum niezbędne podłoże Eagle, 25% zrównoważony roztwór soli Hanksa, 5 mg/ml D-glukozy, 2 mmol/L L-glutamina, 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 10 mmol/L HEPES i 4,5 μmol/L jodku propidyny, miareczkowane pH do 7,2 wodorotlenkiem sodu.
3. Upewnij się, że poziom medium nie sięga powyżej wycięcia pierścienia. Przenieść 6-dołkową płytkę z pierścieniami z powrotem do inkubatora na 1 godzinę, aby upewnić się, że pożywka ma temperaturę 37 °C bezpośrednio przed przeniesieniem wkładek do kultur tkankowych.
4. Przenieść wkładki do kultur tkankowych z plastrami organotypowymi z szalek Petriego o średnicy 35 mm na płytkę 6-dołkową z pierścieniami i pożywką doświadczalną za pomocą kleszczy.
5. Zrób kropkę na brzegu wkładki w pozycji godziny 3 za pomocą markera permanentnego.
   UWAGA: Wkładki zostaną usunięte z płytki 6-dołkowej podczas eksperymentu, a ten krok ułatwia powrót wkładki do pierwotnej pozycji po ekspozycji na falę uderzeniową i łatwe śledzenie każdego wycinka przez cały protokół.
6. Oznacz każdą 6-dołkową płytkę unikalną nazwą i datą oraz sporządź mapę dołków każdej płytki, nazywając każdą studzienkę (np. A, B, C itp.) i każdy plasterek w każdym dołku (np. 1, 2, 3 itd.), tak aby każdy plasterek miał unikalny identyfikator (np. A1, A2, A3 itp.).
7. Przenieść 6-dołkową płytkę do inkubatora na 1 godzinę, aby upewnić się, że plastry mają temperaturę 37 °C bezpośrednio przed obrazowaniem.
   UWAGA: Unikaj przelewania się pożywki lub pęcherzyków powietrza pod membraną wkładki do hodowli tkankowej, co mogłoby zagrozić żywotności plastrów.
8. 1 godzinę po przeniesieniu na pożywkę eksperymentalną należy zobrazować każdy plasterek indywidualnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw 2X, NA 0,06) wyposażonego w odpowiedni filtr wzbudzenia (BP 535/50 nm) i emisyjny (LP 610 nm) w celu oceny stanu warstwy przed przeprowadzeniem protokołu urazu.
   UWAGI: Plastry, które na tym etapie wykazują obszary gęstego czerwonego zabarwienia, należy uznać za wykazujące zagrożoną żywotność i powinny być wyłączone z dalszej analizy (zazwyczaj stanowią one mniej niż 10% całkowitej liczby wygenerowanych plasterków). Upewnij się, że obrazowanie jest wykonywane w sposób sekwencyjny i tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować czas, w którym plastry znajdują się poza inkubatorem (zwykle obrazowanie 6 dołków powinno zająć nieco poniżej 30 minut).
9. Pokrywkę płytki 6-dołkowej należy zawsze założyć. Po wewnętrznej stronie pokrywy może gromadzić się pewna kondensacja. Jeśli tak się stanie, krótko użyj suszarki do włosów na niskim ustawieniu.
10. Upewnij się, że wszystkie warunki obrazowania są identyczne w różnych dniach i między eksperymentami.
    UWAGA: Celem obrazowania jest ilościowe określenie fluorescencji tkanek, dlatego ten krok jest ważny, aby zapewnić odtwarzalność wyników i umożliwić porównanie uzyskanych danych.

3. Zanurzenie i transport wkładek kultur tkankowych z plastrami organotypowymi hipokampa

1. Natychmiast po obrazowaniu, w kapturze z przepływem laminarnym, wyjmij jedną wkładkę do hodowli tkankowej z płytki 6-dołkowej za pomocą kleszczy.
2. Ostrożnie przenieś wkładkę do sterylnego worka polietylenowego (3" x 5") wstępnie wypełnionego 20 ml ciepłego (37 °C) eksperymentalnego podłoża świeżo bąbelkowanego 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.
   UWAGA: Upewnij się, że pożywka doświadczalna wzbogacona w tlen i dwutlenek węgla była bąbelkowana przez co najmniej 40 minut z 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla za pomocą bełkotki ze spiekanego szkła wewnątrz butelki Dreschel i przeniesiona do sterylnych worków polietylenowych wewnątrz kaptura do hodowli tkanek z przepływem laminarnym za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z filtrem bakteryjnym i dołączoną sterylną rurką do napełniania (127 mm). Natychmiast zszczelnić worki i przenieść je do inkubatora o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę przed przeniesieniem wkładki do hodowli tkankowej.
3. Upewnij się, że każdy sterylny worek jest prawidłowo oznakowany (z tabliczką i identyfikacją studzienki). Powtórz ten krok dla każdej wkładki do hodowli tkankowej. Ostrożnie wyklucz pęcherzyki powietrza po zamknięciu sterylnych torebek (zrób to bezpiecznie, przekręcając górną część worków i nakładając plastikowy zacisk).
4. Sterylne worki z wkładkami do kultur tkankowych i 6-dołkowymi płytkami z pożywką doświadczalną należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
5. Po upływie 1 godziny ostrożnie zapakować sterylne worki z wkładkami do kultur tkankowych w plastikowe pudełka wewnątrz termoregulowanego pudełka wypełnionego wodą dejonizowaną o temperaturze 37 °C, aby utrzymać plastry organotypowe w temperaturze fizjologicznej przez cały protokół ekspozycji na falę uderzeniową.

4. Przygotowanie rurki uderzeniowej i ekspozycji na falę uderzeniową z organicotypowego plastra hipokampa

1. Nosić buty ochronne ze stalowymi palcami, fartuch laboratoryjny i rękawice podczas przygotowywania rurki uderzeniowej i ekspozycji na falę uderzeniową.
2. Przykręć sterylną ramę uchwytu worka do dystalnego kołnierza rurki amortyzatora, upewniając się, że środkowy otwór jest wyrównany z wylotem rurki amortyzującej (za pomocą pręta zaślepiającego).
3. Zamontuj promieniowo dwa przetworniki ciśnienia: czujnik 1, w środkowej części sekcji napędzanej i czujnik 2 w dystalnym kołnierzu rury uderzeniowej (Rysunek 1A). Podłącz przetworniki ciśnienia do oscyloskopu za pomocą zasilacza źródła prądu.
4. Upewnij się, że wszystkie zawory spustowe rurki uderzeniowej i regulatory przepływu są zamknięte.
5. Otwórz zewnętrzny przewód sprężonego powietrza i naładuj zawór elektromagnetyczny do 2,5 bara.
6. Otwórz zawór bezpieczeństwa butli ze sprężonym powietrzem i powoli otwórz regulator ciśnienia, aby zwiększyć ciśnienie do około 5 barów.
   UWAGA: Ciśnienie ustawione dla tego regulatora powinno być nieco wyższe od najwyższego ciśnienia rozrywającego membrany.
7. Przygotuj membrany, tnąc arkusze poliestru o grubości 23 μm na kwadraty o wymiarach 10 x 10 cm². Przygotuj uchwyty za pomocą taśmy autoklawu i przyklej je do góry i dołu każdej membrany.
8. Umieść jedną membranę (pojedynczy slot konfiguracji z podwójnym zamkiem - pojedynczą membraną) lub dwie membrany (obie szczeliny konfiguracji z podwójnym zamkiem - podwójną membraną) w zamku (Rysunek 1B).
9. Wyśrodkuj membrany i zaciśnij je za pomocą czterech i nakrętek M24, mocując je sekwencyjnie w symetryczny sposób po przekątnej i upewniając się, że membrany są wolne od zmarszczek.
10. Zacisnąć każdą sterylną torbę indywidualnie w pozycji pionowej na ramie uchwytu, upewniając się, że powierzchnia wkładek do hodowli tkankowych z organotypowymi plastrami hipokampa jest skierowana w stronę wylotu rurki szokowej, a wkładka do hodowli tkankowej jest wyśrodkowana wewnątrz sterylnej torby (Rysunek 1C). Upewnij się, że sterylna torba jest bezpiecznie zaciśnięta dookoła, aby zapewnić mocne i równomierne unieruchomienie.
11. Nosić ochronniki słuchu i okulary ochronne podczas naciskania na rurkę amortyzującą. Włącz zasilacz źródła prądu i oscyloskop, aby uzyskać dane fali uderzeniowej (szybkość akwizycji 50 mega-próbek/s, długość rekordu 20 ms, 1 milion punktów) i zamknij zawór elektromagnetyczny.
12. Za pomocą pokrętła regulacji przepływu na panelu sterowania rurki amortyzatora powoli zwiększaj ciśnienie w sekcji głośności przetwornika rurki amortyzatora w przypadku konfiguracji z pojedynczą membraną lub zarówno w sekcji głośności przetwornika, jak i w sekcji z podwójnym zamkiem rury amortyzatora w przypadku konfiguracji z podwójną membraną.
    UWAGA: W przypadku konfiguracji z pojedynczą membraną ciśnienie rozrywające będzie zależeć tylko od materiału i grubości membrany, a membrana pęknie spontanicznie po osiągnięciu ciśnienia rozrywania materiału. W przypadku konfiguracji z podwójną membraną ciśnienie rozrywające będzie również zależało od różnicy ciśnień gazu zarówno w komorze kierowcy, jak i w podwójnej komorze zamkowej, a aby membrany pękały w kontrolowany sposób, zawór bezpieczeństwa z podwójnym zamkiem jest otwierany ręcznie po osiągnięciu ciśnienia docelowego.
13. Gdy tylko membrana pęknie (wytwarzając głośny dźwięk), szybko zamknij przepływ sprężonego powietrza za pomocą pokrętła przepływu i otwórz zawór elektromagnetyczny.
    UWAGA: Całkowita objętość sekcji sterującej może być modyfikowana przez wstawienie segmentów zaślepiających, co pozwala na uzyskanie szerszego zakresu szczytowego nadciśnienia fali uderzeniowej i czasu trwania. Idealna kombinacja parametrów fali uderzeniowej powinna wystarczyć, aby spowodować uszkodzenie tkanki, ale nie na tyle wysoka, aby spowodować zniekształcenie lub pęknięcie wkładki do hodowli tkankowej lub sterylnego worka.
14. Każdą sterylną torbę z wkładką do hodowli tkankowej należy wystawić na działanie pojedynczej fali rurki uderzeniowej i natychmiast umieścić ją z powrotem w pudełku regulowanym termicznie, zanim nowy sterylny worek zostanie wyjęty z pudełka i zaciśnięty na ramie uchwytu. Upewnij się, że kroki 4.10–4.14 są wykonywane tak płynnie i szybko, jak to możliwe (w ciągu kilku minut), aby zapobiec wyschnięciu pożywki doświadczalnej, ponieważ temperatury poniżej 37 °C mogą zakłócać rozwój urazu.
15. Gdy wszystkie wkładki do kultur tkankowych zostaną wystawione na działanie fali uderzeniowej (lub protokołu pozorowanego), należy umieścić wkładki do hodowli tkankowej na oryginalnej płytce 6-dołkowej i do odpowiedniego dołka (wewnątrz kaptura do hodowli tkanek z przepływem laminarnym) i wrócić do inkubatora.
16. Przechowywać 6-dołkową płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w powietrzu w temperaturze 37 °C do czasu dalszego obrazowania.
17. Uwzględnij pozorowane kontrole dla każdego eksperymentu, wraz z ekspozycją na falę uderzeniową wycinka.
    UWAGA: Plastry Sham są traktowane identycznie jak plastry wystawione na działanie fali uderzeniowej (zamknięte w sterylnych workach z pożywką eksperymentalną, transportowane do laboratorium rurki szokowej w tym samym pudełku z regulacją termiczną i zawieszane na metalowej ramie przez równoważny okres czasu), ale rurka szokowa nie jest wypalana.

5. Kwantyfikacja uszkodzeń plastrów organotypowych w hipokampie

1. Po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach zobrazuj plasterki zgodnie z opisem w krokach 2.8 i 2.9.
2. Po obrazowaniu po 72 godzinach od ekspozycji na falę uderzeniową, wyrzuć tkankę zgodnie z lokalnymi protokołami odpadów biologicznych, a następnie zdezynfekuj i autoklawuj metalowe pierścienie.

Rurka uderzeniowa używana w tej metodzie pozwala na generowanie stanów przejściowych nadciśnienia, które symulują rzeczywiste eksplozje w otwartym polu, modelowane przez funkcję Friedlandera7,8. Uzyskano naddźwiękowe fale uderzeniowe o prędkości 440 m/s (Mach 1,3) (Rysunek 2A). Zgłaszane dane dotyczące kształtu fali pochodzą z czujnika 2, umieszczonego promieniowo na końcu napędzanej sekcji rury uderzeniowej.

Korzystając z protokołu opisanego powyżej, organotypowe kultury wycinków hipokampa wystawione na pojedynczą falę uderzeniową (Rysunek 2A) rozwijają znaczne obrażenia określone ilościowo za pomocą jodku propidyny, wysoce polarnego barwnika fluorescencyjnego, który przenika do komórek tylko z uszkodzonymi błonami komórkowymi24,25 (Rysunek 2B, C).

Nawet w optymalnych warunkach i zgodnie z innymi modelami opublikowanymi przez OHSC21,22, występuje niski poziom fluorescencji jodku propidyny, częściowo spowodowany niewielkimi uszkodzeniami wynikającymi z manipulacji tkankami (takimi jak zmiany podłoża podczas okresu hodowli lub usunięcie z inkubatora w celu obrazowania). Ten protokół TBI obejmuje znaczną manipulację, która obejmuje zanurzenie plastrów w podłożu wewnątrz sterylnych worków i znaczny stopień obsługi podczas protokołu ekspozycji na falę uderzeniową (np. Zaciskanie sterylnych worków na ramie uchwytu). Jeśli jednak wszystkie kroki zostaną wykonane ostrożnie, ta dodatkowa manipulacja nie ma wpływu na podstawowe zdrowie OHSC, ponieważ nie zaobserwowano znaczących różnic między grupą kontrolną plastrów trzymanych w płytkach 6-dołkowych przez cały czas (tj. wkładki nie były zanurzone ani dotykane) a grupą pozorowaną, która obejmowała plastry zanurzone w sterylnych workach zaciśniętych na rurce uderzeniowej (Rysunek 2B).

Dwie wybrane fale uderzeniowe, przy szczytowym nadciśnieniu 50 kPa i 55 kPa, spowodowały znaczne (odpowiednio p <0,05 i p <0,0001) i powtarzalne obrażenia w porównaniu do nieuszkodzonych pozorowanych plastrów we wszystkich punktach czasowych po protokole ekspozycji na wybuch (Rysunek 2B) bez powodowania jakichkolwiek uszkodzeń wkładek do hodowli tkankowych lub sterylnych worków. W celu określenia czułości modelu na niewielkie różnice w nadciśnieniu szczytowym, zdecydowaliśmy się wybrać wartości, które różniły się o ~10%. Wyniki te pokazują również, że zgodnie z oczekiwaniami uraz wynikający z 55 kPa jest wyższy niż po fali uderzeniowej o natężeniu 50 kPa.

Dane są wyrażone jako średnia ± błąd standardowy średniej. Istotność oceniono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji powtarzanych pomiarów przy użyciu testu post hoc Holma-Sidak. Czynnikiem 1 był czynnik grupowy (kontrolny, pozorowany, wybuchowy), a czynnikiem 2 był czas po urazie (-1 h, 24 h, 48 h i 72 h), gdzie czynnik 1 był czynnikiem powtarzającym się. Zastosowano korektę wartości p dla porównań wielokrotnych. Wartości P mniejsze niż 0,05 zostały przyjęte, aby wskazać na istotną różnicę między grupami. Testy statystyczne zostały zrealizowane przy użyciu pakietu oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk.

Rysunek 1: Schemat urządzenia z rurką uderzeniową z ramą sterylnego uchwytu worka. (A). Rura uderzeniowa to rura ze stali nierdzewnej o długości 3,8 m, zbudowana z trzech odcinków o długości 1,22 m, połączonych uszczelkami i kołnierzami, o średnicy wewnętrznej 59 mm. (B) Wstawka przedstawia podwójny zespół zamka. Jedna lub dwie membrany Mylar mogą być mocowane w zespole za pomocą uszczelki dostarczanej przez gumowe o-ringi. (C) Sterylna rama uchwytu na torbę. Korpus ramy składa się z dwóch metalowych płytek z wyśrodkowanym okrągłym otworem (średnica 59 mm), który jest wyrównany z wylotem rury amortyzatora. Pomiędzy dwiema metalowymi płytkami zamontowane są dwa cienkie (4 mm) arkusze elastomeru silikonowego. Celem tych arkuszy jest zapewnienie równej i antypoślizgowej powierzchni do zaciskania sterylnych worków. Odległość między torbą a wylotem rurki amortyzującej wynosi 7 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Typowa fala uderzeniowa i wynikające z niej uszkodzenia w organotypowych kulturach plastrów hipokampa. (A) Reprezentatywny przykład fali uderzeniowej uzyskanej przy użyciu folii poliestrowej o grubości 23 μm, ciśnienie rozrywające 2,16 bara, szczytowe nadciśnienie 55 kPa, dodatni czas trwania fali 0,4 ms, impuls 10,1 kPa·ms. Dane dotyczące kształtu fali uzyskano z czujnika 2 zamontowanego promieniowo na dystalnym kołnierzu sekcji napędzanej rurą uderzeniową. Prędkość fali uderzeniowej wynosiła 440 m/s (Mach 1,3). (B) Rozwój urazu jest proporcjonalny do intensywności fali uderzeniowej. Zarówno szczytowe fale uderzeniowe nadciśnienia 50 kPa, jak i 55 kPa spowodowały znaczne obrażenia, które rozwinęły się w całym protokole 72 godzin w porównaniu z grupą pozorowaną. Uraz wynikający z ekspozycji na szczytową falę nadciśnienia 55 kPa był istotnie wyższy niż po 50 kPa po 48 i 72 godzinach. Fałszywe plastry zostały potraktowane identycznie jak plastry wybuchowe, ale rura uderzeniowa nie została wystrzelona. Warstwy kontrolne utrzymywano na 6-dołkowych płytkach w inkubatorze bez żadnej manipulacji. Słupki reprezentują wartości średnie, a słupki błędów są błędami standardowymi (n = 7, kontrole; n = 48, pozorowane; n = 30, wybuch 50 kPa; n = 51, wybuch 55 kPa; n = liczba wycinków, z 6 oddzielnych eksperymentów). *p <0,05, p <0,0001 w porównaniu z pozorowanym. #p <0.05, ##p <0.01 w porównaniu do wybuchu 55 kPa. (C) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne jodku propidyny wycinków organotypowych z grup (i) pozorowanych, (ii) wydmuchiwanych 50 kPa i (iii) wydmuchiwanych 55 kPa po upływie 72 godzin od urazu. Plaster pozorny wykazuje niski poziom fluorescencji, tj. uraz, a plasterki narażone na wybuch wykazują wysoki poziom uszkodzenia rozproszonego, bardziej wyraźny na wycinku narażonym na nadciśnienie szczytowe 55 kPa (pasek skali = 500 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.