Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58415

⸱

6 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Univ. Bordeaux UMR INTERTRYP 177 IRD CIRAD, 2IRD UMR 177 INTERTRYP CIRAD, 3CNRS, UMR 5234, Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité, Univ. Bordeaux, 4Centre Hospitalier Université Bordeaux

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda oddzielania trypanosomów od krwi zależy od tego, czy ich ładunek powierzchniowy jest mniej ujemny niż u komórek krwi ssaków. Zakażoną krew umieszcza się i poddaje działaniu środka ciężkości na kolumnie wymieniacza anionowego. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, dostarcza oczyszczonych pasożytów do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Streszczenie

Ta metoda pozwala na oddzielenie trypanosomów, pasożytów odpowiedzialnych za zwierzęcą i ludzką trypanosomatozę afrykańską (HAT), od zakażonej krwi. Jest to najlepsza metoda do diagnozowania pierwszego etapu HAT, a ponadto ta metoda oczyszczania pasożytów pozwala na badania serologiczne i badawcze.

HAT jest spowodowany przez muchę Tse-tse przenoszoną przez muchę Trypanosoma brucei gambiense i T. b. rhodesiense. Pokrewne trypanosomy są czynnikami wywołującymi trypanosomatozę zwierzęcą. Wykrywanie trypanosomów jest niezbędne w diagnostyce, leczeniu i obserwacji HAT. Opisana tutaj technika jest najbardziej czułą techniką wykrywania pasożytów, dostosowaną do warunków terenowych do diagnozy T. b. gambiense HAT i może być zakończona w ciągu jednej godziny. Krew jest nakładana warstwami na kolumnę wymieniacza anionowego (celuloza DEAE) uprzednio dostosowaną do pH 8 i dodaje się bufor elucyjny. Silnie ujemnie naładowane krwinki są adsorbowane na kolumnie, podczas gdy mniej ujemnie naładowane trypanosomy przechodzą przez nią. Zebrane trypanosomy są granulowane przez wirowanie i obserwowane pod mikroskopem. Co więcej, pasożyty są przygotowywane bez uszkodzeń komórkowych przy zachowaniu ich zakaźności.

Oczyszczone trypanosomy są wymagane do testów immunologicznych; są używane w teście trypanolizy, złotym standardzie w serologii HAT. Barwione pasożyty są wykorzystywane w karcianym teście aglutynacyjnym (CATT) w serologii terenowej. Antygeny z oczyszczonych trypanosomów, takie jak wariant glikoproteiny powierzchniowej, egzoantygeny, są również stosowane w różnych testach immunologicznych. Opisana tutaj procedura jest przeznaczona dla afrykańskich trypanosomów; W związku z tym warunki chromatografii muszą być dostosowane do każdego szczepu trypanosomów, a bardziej ogólnie, do krwi każdego gatunku ssaka gospodarza.

Te fascynujące patogeny są łatwo oczyszczane i dostępne do wykorzystania w badaniach biochemicznych, molekularnych i biologii komórki, w tym we wspólnej hodowli z komórkami gospodarza w celu zbadania relacji gospodarz-pasożyt na poziomie receptorów błonowych, sygnalizacji i ekspresji genów; testowania leków in vitro; badania delecji genów, mutacji lub nadekspresji w procesach metabolicznych, biogenezie cytoszkieletu i przeżywalności pasożytów.

Wprowadzenie

Opisana tutaj metoda pozwala na oddzielenie trypanosomów, pasożytów odpowiedzialnych za zwierzęcą i ludzką trypanosomatozę afrykańską (HAT), od krwi. Jest to najlepsza metoda diagnozowania pierwszego etapu HAT, a ponadto ta metoda oczyszczania pasożytów pozwala na solidne badania serologiczne i badawcze.

HAT jest spowodowany przez muchę Tse-tse przenoszoną przez muchę Trypanosoma brucei gambiense i T. b. rhodesiense1. Te pasożytnicze pierwotniaki namnażają się zewnątrzkomórkowo w krwiobiegu, limfie i płynach śródmiąższowych w pierwszym etapie choroby (stadium hemolimfy). Drugi etap (stadium opon mózgowo-rdzeniowych) rozpoczyna się, gdy pasożyty przekraczają barierę krew-mózg; Objawy neurologiczne, w tym zaburzenie snu, od którego pochodzi nazwa "śpiączka" tej choroby, są typowe dla tego drugiego etapu2. Pokrewne trypanosomy (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) są czynnikami sprawczymi zwierzęcej afrykańskiej trypanosomozy (AAT)3.

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) dąży do wyeliminowania HAT jako problemu zdrowia publicznego do 2020 roku i zatrzymania transmisji do 2030 roku4. Niedawne wprowadzenie szybkich testów diagnostycznych poprawiło diagnostykę serologiczną1,4,5. Opracowano kilka molekularnych testów diagnostycznych, ale ich rola w diagnostyce terenowej nie została jeszcze ustalona5. Służą one do identyfikacji podgatunków z grupy brucei i trypanosomatozy atypowej wywoływanej przez pasożyty odpowiedzialne za trypanosomozę zwierzęcą6.

Wykrycie pasożyta jest niezbędne do diagnozy, leczenia i obserwacji, ponieważ badania serologiczne mogą dawać fałszywie pozytywne i niestety fałszywie ujemne wyniki1. Bezpośrednia obserwacja mikroskopowa tych protistów hemoflagellate jest trudna w przypadkach HAT wywoływanych przez T. b. gambiense (ponad 95% przypadków), ponieważ regułą są niskie parazytemie, podczas gdy w przypadku HAT wywołanych przez T. b. rhodesiense duża liczba pasożytów jest często obecna we krwi. Zastosowano różne techniki zagęszczania, takie jak wirowanie w grubej kropli i kapilarnej probówce (CTC), ale najbardziej czułą metodą jest oddzielenie pasożytów od krwi za pomocą kolumny wymieniacza anionowego (celulozy DEAE), a następnie odwirowanie i obserwacja mikroskopowa osadu, (można wykryć około 50 pasożytów/ml krwi)1,7. W związku z tym oczyszczanie trypanosomów metodą wymieniaczy anionowych (celuloza DEAE) jest najlepszą i jak dotąd referencyjną metodą wizualizacji i izolacji pasożytów z krwi w diagnostyce HAT. W warunkach polowych z powodzeniem zastosowano mini-kolumnę z celulozy DEAE, a kilka ulepszeń ułatwiło obserwację mikroskopową7,8.

Metoda oddzielania trypanosomów od krwi, opisana poniżej, zależy od ładunku powierzchniowego pasożyta, który jest mniej ujemny niż w przypadku komórek krwi ssaków9. Co ciekawe, metoda ta została opracowana 50 lat temu, w 1968 roku przez dr Sheilę Lanham, i pozostaje złotym standardem w wykrywaniu i przygotowywaniu trypanosomów krwi. Jest szybki i powtarzalny dla trypanosomów ślinowych od szerokiej gamy ssaków, co pozwala na diagnozę trypanosomatozy zarówno zwierzęcej, jak i ludzkiej10.

Aby uzyskać żywe, oczyszczone pasożyty, do kolumny wymieniacza anionowego dodaje się zakażoną krew. Warunki chromatograficzne (głównie pH, siła jonowa/pożywek) muszą być dostosowane do każdego rodzaju trypanosomów, a bardziej ogólnie, do każdej mieszaniny komórek krwi ssaków i trypanosomów10. Bufor elucyjny jest precyzyjnie dostosowany do pH 8 dla większości afrykańskich trypanosomów10. Metoda ta sprzyja stężeniu pasożytów znajdujących się we krwi pacjentów, ponieważ parazytemie mogą być zbyt niskie, aby można je było wykryć za pomocą samej obserwacji mikroskopowej, a także umożliwia badania laboratoryjne. Praca ze świeżo wyizolowanymi trypanosomami i na krwi zakażonych zwierząt, przy użyciu tej techniki, jest bardziej odpowiednia dla różnych badań niż badania z pasożytami, które były hodowane w warunkach aksenicznych w laboratorium przez czas nieokreślony.

Relacje między gospodarzem a pasożytem najlepiej badać z pasożytem infekującym swojego naturalnego gospodarza, dlatego T. musculi, naturalny pasożyt myszy, który jest reprezentatywny dla trypanosomów zewnątrzkomórkowych, ma wiele zalet, ponieważ zakażenie mysie występuje u małego zwierzęcia laboratoryjnego i nie wymaga warunków poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL). T. musculi nie zabija myszy immunokompetentnych, w przeciwieństwie do wielu innych gatunków Trypanosoma, w tym ludzkich patogenów. T. musculi nie są eliminowane u myszy pozbawionych limfocytów T, a parazytemie mogą być zwiększone u zakażonych myszy poprzez modyfikację spożycia pokarmu i składników odżywczych11. Pasożyt ten moduluje odpowiedź immunologiczną w koinfekcjach innymi patogenami12. T. musculi od zakażonych myszy wykazują różnice w stosunku do hodowanych T. musculi, na przykład ekspresja receptorów błonowych Fc jest tracona w kulturach aksenicznych T. musculi, w porównaniu z pasożytami oczyszczonymi z zakażonych myszy13,14. Czynniki wydzielane przez wydalanie (ESF) są również jakościowo i ilościowo mniej wyrażane w kulturach trypanosomów aksenowych i różnią się między szczepami izolowanymi na obszarach endemicznych15. ESF są pierwszymi antygenami, które są wyświetlane układowi odpornościowemu gospodarza i dlatego odgrywają ważną rolę w początkowej odpowiedzi immunologicznej gospodarza16.

U eksperymentalnie zakażonych zwierząt do badań laboratoryjnych, ten protokół ułatwia eksperymentowanie na większej liczbie pasożytów, minimalizując liczbę wymaganych myszy, zwłaszcza przy użyciu zwierząt z obniżoną odpornością. Wariantowe glikoproteiny powierzchniowe (VSG), które są używane w teście aglutynacji kart w kierunku trypanosomatozy (CATT) w masowych badaniach przesiewowych, są nadal oczyszczane z trypanosomów, które rozmnażają się u szczurów. Dwa szybkie testy diagnostyczne (indywidualnie pakowane kasety), które są obecnie dostępne do użytku w terenie, nadal wykorzystują infekcyjne źródło modelu natywnych VSG, a nie trypanosomów hodowanych in vitro1,4,5. Postęp w badaniach nad immunologią i biologią trypanosomów został ułatwiony, ponieważ te oczyszczone z celulozy pasożyty DEAE można łatwo uzyskać w dużych ilościach od naturalnie lub eksperymentalnie zakażonych żywicieli, a w szczególności gryzoni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania zgodne z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Publikacja NIH nr 85±23, poprawiona w 1996 roku). Protokoły zostały zatwierdzone przez naszą lokalną komisję etyczną.

1. Zwierzęta

  1. Samice myszy szwajcarskich (OF-1) w wieku od ośmiu do dziesięciu tygodni, ważące 20-25 g, należy przechowywać w pomieszczeniach dla zwierząt piętnaście dni przed każdym eksperymentem. Umieść je w wentylowanych skrzynkach, które są przechowywane w chronionym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 °C) i wilgotności (50%), z 12-godzinnym cyklem włączania/wyłączania światła.
  2. Zapewnij zwierzętom swobodny dostęp do jedzenia i wody. Zminimalizuj ból, cierpienie i niepokój oraz wzbogac środowisko.
  3. Do trzymania używaj klatek o przezroczystych ściankach, wzbogacania drewnianymi patyczkami i kartonowych tuneli. Delikatnie wciągnij zwierzę do tunelu, aby przenieść je z klatki na dłoń.
  4. Wykonuj codzienne monitorowanie, aby ocenić oznaki pokłonu, izolacji społecznej, obrażeń ciała, potarganych włosów lub braku pielęgnacji.
  5. Waż każde zwierzę raz w tygodniu. Wykonuj regularne kontrole przez lekarza weterynarii.
  6. W przypadku pasożytów naturalnych należy pobrać krew w szczytowym momencie parazytemii, a w przypadku pasożytów powodujących śmierć zwierzęcia należy pobrać krew dzień przed domniemaną śmiercią.
    UWAGA: Wszystkie eksperymenty z czynnikami zakaźnymi są przeprowadzane w dedykowanych pomieszczeniach, zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez uczelnię.

2., preparaty pożywek

  1. Odważyć każdą substancję i dodać wodę destylowaną do następujących:
    1. Przygotować skoncentrowany roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (2x):
      Na2HPO4 (bezwodny) (MW 141,96 g) 10,14 g
      NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,62 g
      NaCl (MW 58,44 g) 2,55 g
      Destylowany H2O do 1 L
    2. Przygotować buforowaną fosforanami sól fizjologiczną glukozy:
      Na2HPO4 (bezwodny) (MW 141,96 g) 5,39 g
      NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,31 g
      NaCl (MW 58,44 g) 1,70 g
      Glukoza (MW 180 g) 10 g
      Destylowany H2O do 1 L
    3. Przygotować 1 m KH2PO4.
    4. Przygotować bufor elucyjny: Uzupełnij buforowaną fosforanem sól fizjologiczną glukozy za pomocą
      Penicylina (100 μg/ml), streptomycyna (100 μg/ml) i czerwień fenolowa (5 μg/ml).

3. Przygotowanie DEAE-celulozy

  1. Zaplanuj około 5 godzin na przygotowanie DEAE-celulozy.
  2. Przemyć 100 g DEAE-celulozy wodą destylowaną w kolbie z wąską szyjką i pozostawić do osiadania, a następnie wyrzucić drobne cząstki. Powtarzać mycie, aż supernatant będzie klarowny.
  3. Dodaj 3 l zagęszczonej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i wymieszaj.
  4. Doprowadzić pH do 8,0 za pomocą 1 M KH2PO4 i odrzucić supernatant.
  5. Umyj dwukrotnie wodą destylowaną i pozostaw do osiadania.
  6. Przemyć i pozostawić do dwukrotnego osadzenia się 3 litrami soli fizjologicznej i glukozy buforowanej fosforanami i wyrzucić supernatanty.
  7. Zmierzyć objętość celulozy i dodać równą objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, rozprowadzić do plastikowych butelek i przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Pasożyty

  1. Zbieraj szczepy trypanosomów na obszarach endemicznych dla trypanosomatozy ludzkiej i zwierzęcej. Utrzymuj pasożyty zamrożone w ciekłym azocie.
    UWAGA: Trypanosoma musculi nie jest patogenny dla ludzi i jest zewnątrzkomórkowym trypanosomem stosowanym do bezpiecznego zastępowania patogennych trypanosomów w różnych eksperymentach laboratoryjnych.
  2. W przypadku badań laboratoryjnych wymagających obecności czynników chorobotwórczych u ludzi, należy przeprowadzać doświadczenia z ostrożnością, w specjalnych warunkach i środkach ostrożności na odpowiednim poziomie zagrożenia biologicznego (BSL); BSL2 dla T. b. gambiense i BSL3 dla T. b. rhodesiense. W warunkach polowych ustala się standardową praktykę mikrobiologiczną: bezpieczne pobieranie próbek, pipetowanie mechaniczne, częste odkażanie powierzchni i sterylizację odpadów.

5. Infekcja myszy

  1. Pasożyty należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
  2. Obserwuj kroplę rozmrożonej zakażonej krwi pod mikroskopem. Oceń żywotność pasożyta, mierząc procent form ruchliwych17.
  3. Wstrzyknąć pasożyty dootrzewnowo myszom (0,5 ml na mysz). Każdego dnia, po zakażeniu, należy pobrać 20 μl krwi z ogona przez nakłucie igłą i obserwować pod mikroskopem. Oceń parazytemię według Herberta i Lumsdena18, licząc pasożyty w kilku polach mikroskopowych lub używając hemocytometru.
  4. Gdy parazytemia osiągnie próg, który jest zdefiniowany dla każdego szczepu, należy zebrać krew (1 ml / mysz) w buforze elucyjnym (5 ml / mysz) zawierającym heparynę (10 U / ml).
    UWAGA: Oryginalna i nowatorska praca Lanhama i Godfreya opisała optymalną siłę jonową buforowanej fosforanem glukozy soli dla kilku gatunków żywiciela/pasożyta z roztworu podstawowego o pH 8,0.

6. Separacja pasożytów

UWAGA: Wszystkie eksperymenty od tego momentu muszą być wykonywane w kapturze do hodowli tkankowej w rękawiczkach. Temperatura i wilgotność w pomieszczeniach laboratoryjnych wynosiły odpowiednio 22 °C i 45%. W warunkach polowych separację pasożytów udało się przeprowadzić w temperaturze 34 °C.

  1. Umieść strzykawkę o pojemności 10 ml w pionowym wsporniku i dodaj wcześniej wyciętą okrągłą bibułę, kawałek bibuły filtracyjnej, watę szklaną lub gąbkę celulozową.
  2. Wlać celulozę DEAE do strzykawki aż do osiągnięcia poziomu 8 ml, a następnie przemyć 25 ml buforu elucyjnego.
  3. Ostrożnie dodać 2 ml rozcieńczonej krwi na górze kolumny, a następnie dodać pożywkę elucyjną. Regularnie dodawać bufor elucyjny zgodnie z pasażem trypanosomów.
  4. Zbieraj krople ścieków z kolumn w probówce wirówkowej i regularnie sprawdzaj pod mikroskopem obecność pasożytów.
  5. Gdy pasożyty nie zostaną już wykryte w ściekach z kolumny, należy odwirować probówkę (1 800 x g, 10 minut, w temperaturze 4 °C w laboratorium i w temperaturze otoczenia w warunkach polowych).
  6. Usunąć supernatant i zawiesić pasożyty w 1 ml odpowiedniej pożywki wymaganej do następnego etapu badania.
  7. Policz pasożyty za pomocą hemocytometru i w razie potrzeby rozcieńcz je w odpowiednim podłożu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oczyszczone trypanosomy były wykorzystywane w testach farmakologicznych. Pasożyty przenosi się dołków hodowlanych zawierających szeregowe rozcieńczenia określonych leków, podawanych pojedynczo lub w kombinacjach19. Obserwacje mikroskopowe, w których ocena ruchliwości służy jako marker żywotności, mogą być stosowane w przypadku testowania niewielkiej liczby leków, natomiast test żywotności komórek AlamarBlue jest doskonałą metodą do przeprowadzania masowych analiz r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oczyszczone trypanosomy stanowią potężny środek do studiowania immunologii, biochemii, biologii komórkowej i molekularnej. Duże ilości danych i wyników uzyskano z trypanosomów, co następnie pomogło w uzyskaniu informacji z innych komórek eukariotycznych30. Trypanosomy są również przedmiotem ważnych i interesujących badań, ponieważ opracowali liczne mechanizmy, które pozwalają im przetrwać i rosnąć w dwóch bardzo różnych środowiskach: wektora muchy tse-tse i gospodarza ssaków23,31...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Badania te były finansowane ze środków wewnętrznych Uniwersytetu w Bordeaux oraz ze strony ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 oraz Association pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale i Service de coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangi (Centrafrique).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipety 10 ml Pipety Falcon357,551
2 ml Falcon352,507
Probówka wirówkowa 50 mlFalcon352,070
WirówkaSigma Aldrich4K15
DEAE celulozaSanta Cruzs/c- 211213100 G
bibuła filtracyjna Whatman1,001,125
Kolba z płaskim dnem wąska szyjkaDuran21 711 766000 ml
Glukoza VWR101174Y500 G
HeparinSigma AldrichH3149-50KU5 000 U
KH2PO4VWR120 26936.260500 G
Mikroskop OlympusCH-20
Szkiełka nakrywkowe do mikroskopówThermofisher scientificCB00100RA020MNT0
Szkiełka mikroskopoweThermofisherAGAA000001
naukowy Na2HPO4 VWR100 28026; 260500 G
NaClVWR27800.2911 KG
NaH2PO4 VWR110 33616; 262500 G
Plastikowe butelki na media Nalgene rozmiar 125 mlThermofisher scientific342024-0125
Nalgene Plastikowe butelki na media rozmiar 500 mlThermofisher scientific342024-0500
Pipeta PasteuraVWRBRND125400
Penicylina 10 000 UI / Streptomycyna 10 000 i mikro; gEUROBIOCABPES01 OU100 ml
czerwień fenolowaSigma AldrichP0290100 ml
Syringue DutscherSS+10S21381
Kaptur do hodowli tkankowychThermoelectro CorporationMSC-12
Trypanosoma brucei bruceiInstitute of Tropical Medicine (Antwerpia, Belgia).ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambienseInstytut Medycyny Tropikalnej (Antwerpia, Belgia).ITMAP 1893
Trypanosoma musculiLondon School of Hygiene and Tropical Medicine (Wielka Brytania)Partinico II

Bibliografia

  1. Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
  2. Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
  3. Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
  4. Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454(2017).
  5. Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
  6. Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256(2013).
  7. Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
  8. Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471(2009).
  9. Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
  10. Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
  11. Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
  12. Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
  13. Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
  14. Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
  15. Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
  16. Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778(2018).
  17. Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
  18. Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
  19. Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125(2016).
  20. Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
  21. Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
  22. Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
  23. De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731(2013).
  24. Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
  25. Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105(2008).
  26. Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710(2017).
  27. Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
  28. Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
  29. Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587(2013).
  30. Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686(2018).
  31. Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
  32. Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
  33. Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
  34. Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
  35. Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
  36. Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie trypanosom wwymiennik anionowyceluloza DEAEafryka skie trypanosomyseparacja krwiobserwacja mikroskopowawirowaniebufor elucyjnydetekcja paso yt winterakcja gospodarz paso yt
Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.