Wizualny przewodnik do badania obrony behawioralnej przed atakami patogenów u mrówek tnących liście

Podsumowanie

Prezentujemy wizualny przewodnik po zachowaniach obronnych u mrówek tnących liście, z indywidualnymi klipami i towarzyszącymi im definicjami, zilustrowanymi eksperymentalnym scenariuszem infekcji. Naszym głównym celem jest pomoc innym badaczom w rozpoznawaniu kluczowych zachowań obronnych i zapewnienie wspólnego zrozumienia dla przyszłych badań w tej dziedzinie.

Streszczenie

Skomplikowany styl życia, ewolucyjna historia zaawansowanej współpracy i ochrona przed chorobami mrówek tnących liście są dobrze zbadane. Chociaż liczne badania opisywały zachowania związane z obroną przed chorobą i związanym z tym stosowaniem chemikaliów i środków przeciwdrobnoustrojowych, nie dokonano wspólnych odniesień wizualnych. Głównym celem tego badania było nagranie krótkich klipów przedstawiających zachowania związane z obroną przed chorobą, zarówno profilaktycznie, jak i bezpośrednio skierowane do antagonisty kolonii po zakażeniu. W tym celu przeprowadziliśmy eksperyment z infekcją z udziałem podkolonii gatunku mrówek Acromyrmex echinatior i najważniejszego znanego zagrożenia chorobotwórczego dla upraw grzybów mrówek (Leucoagaricus gongylophorus), wyspecjalizowanego grzyba chorobotwórczego z rodzaju Escovopsis. Sfilmowaliśmy i porównaliśmy zakażone i niezakażone kolonie, zarówno we wczesnych, jak i bardziej zaawansowanych stadiach infekcji. Określiliśmy ilościowo kluczowe zachowania obronne w różnych terapiach i wykazaliśmy, że reakcja behawioralna na atak patogenu prawdopodobnie różni się między różnymi kastami mrówek robotnic oraz między wczesnym i późnym wykryciem zagrożenia. Na podstawie tych nagrań stworzyliśmy bibliotekę klipów behawioralnych, którym towarzyszą definicje głównych indywidualnych zachowań obronnych. Przewidujemy, że taki przewodnik może stanowić wspólny punkt odniesienia dla innych badaczy pracujących w tej dziedzinie, aby rozpoznać i zbadać te zachowania, a także zapewnić większy zakres porównywania różnych badań, aby ostatecznie pomóc lepiej zrozumieć rolę, jaką te zachowania odgrywają w obronie przed chorobą.

Wprowadzenie

Mrówki tnące liście to zaawansowane owady społeczne, tworzące jedne z najbardziej złożonych kolonii na ziemi. Są pochodną gałęzi mrówek hodujących grzyby (plemię Attini) składającą się z dwóch rodzajów Acromyrmex i Atta¹. Uprawiają gatunki grzybów Leucoagaricus gongylophorus (Basidiomycota: Agaricales), na których polegają jako na głównym źródle pożywienia^2,3. Mrówki dostarczają temu grzybowi świeżego materiału liściowego do jego wzrostu, a grzyb w zamian wytwarza bogate w składniki odżywcze, spuchnięte końcówki strzępek (gongylidia), które są spożywane przez mrówki i ich potomstwo. Kolonie są budowane pod ziemią, uprawy grzybów są utrzymywane w zewnętrznych ogrodach^4,5, a hodowcy mrówek chronią swoje uprawy przed potencjalnymi patogenami6^{,7,8,9,10,11,12}. Kolonie dzielą pracę między pracowników o różnym wzroście (kaście) i wieku^13,14,15, co rozciąga się na ochronę mrówek i upraw przed patogenami.

Możemy się spodziewać, że kolonie mrówek tnących liście powinny być podatne na choroby. Oczekuje się, że życie w grupie ułatwi rozprzestrzenianie się chorób między spokrewnionymi pracownikami ze względu na częste interakcje, a tym samym ułatwi przenoszenie¹⁶. Mrówki są podatne na entomopatogeniczne pasożyty grzybowe, takie jak gatunki Metarhizium i Beauveria bassiana⁶. Pasożyty te są generalistami i często są obecne w glebie w pobliżu gniazd^7,8. Uprawa grzybów jako monokultura^4,5 sprawia, że jest ona również podatna na choroby^17,18. Może być zainfekowany przez ogólne pasożyty grzybowe (w tym gatunki Aspergillus niger i Trichoderma³); jednak największym zagrożeniem jest wyspecjalizowany grzyb nekrotroficzny z rodzaju Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales)¹¹. Poprzez wydzielanie enzymów mykolitycznych i innych związków, Escovopsis zabija i pozyskuje składniki odżywcze z grzyba crop¹², z potencjalnie śmiertelnymi konsekwencjami dla kolonii mrówek^11,19.

Aby zwalczać zagrożenia chorobowe, mrówki mają niezwykłe mechanizmy obronne zarówno na poziomie indywidualnym, jak i kolonii, łącząc kontrolę biologiczną, obronę behawioralną i chemiczną, aby działać profilaktycznie i, gdy to konieczne, w odpowiedzi na infekcję. Łącznie te mechanizmy obronne zapobiegają lub zmniejszają wpływ infekcji zarówno patogenami ogólnymi, jak i specjalistami, takimi jak Escovopsis. Ogólnie rzecz biorąc, polegają one na unikaniu zarażania się pasożytów w środowisku²⁰, zapobieganiu przedostawaniu się pasożytów do gniazda i ograniczaniu rozprzestrzeniania się infekcji w gniazdach. Pierwsze linie obrony obejmują substancje chemiczne z wydzielin gruczołowych^{3,21,22,23,24,25,26,27}do dezynfekcji substratów roślinnych, poprzez wylizywanie ich przez pracowników przed włączeniem do ogrodu grzybowego oraz mrówki przeprowadzające zarówno samodzielne, jak i allogroomingowe. Podczas pielęgnacji, zwłaszcza po wejściu do gniazda, robotnice mogą również nakładać kwaśne wydzieliny kałowe na swoje ciało²⁷. Te profilaktyczne mechanizmy obronne są wyraźnie ważne, aby uniknąć infekcji przez zagrożenia chorobotwórcze^{6,7,8,9,10,11,12}.

Jeśli początkowa obrona zawiedzie i patogen, taki jak Escovopsis, zdoła dostać się do gniazda i ogrodu grzybów, a infekcja zostanie wykryta na wczesnym etapie, mrówki używają pielęgnacji grzybów do usunięcia zarodników^25,28_. Mrówki mogą aplikować wydzieliny z gruczołów śródopłucnowych lub przenosić zarodniki do kieszonki podpoliczkowej (jamy ustnej), gdzie są one mieszane z koktajlem chemicznym zawierającym wydzieliny gruczołów śródopłucnowych i wargowych²⁶. W tych gruczołach znajduje się ponad 20 znanych związków, w tym kwasy γ-keto, karboksylowy i indolojakowy³. Są one aktywnie stosowane²⁵, mają właściwości antybiotyczne, grzybostatyczne i grzybobójcze²⁹ i mogą hamować kiełkowanie zarodników Escovopsis³⁰. Zarodniki przechowywane w kieszeni podpoliczkowej są później wydalane na zewnątrz kolonii^31,32. Większość tego usuwania grzybów po wczesnym wykryciu jest wykonywana przez nieletnich pracowników^28,33. Jeśli jednak patogenowi uda się uniknąć wykrycia i rozprzestrzeni się w ogrodzie grzybów, zarówno drobne, jak i większe robotnice odchwaszczają zainfekowane części grzyba²⁸, a ten usunięty materiał jest odkładany na zewnątrz gniazda³¹. Ponadto gatunki z rodzaju Acromyrmex do ścinania liści stosują kontrolę biologiczną w postaci antybiotyków wytwarzanych przez symbiotyczne promieniowce^34,35,36— utrzymywany na naskórku mrówki³⁷głównie młodych głównych pracowników^34,38,39,40— do wytwarzania związków zapobiegających wzrostowi grzybni Escovopsis^34,38,41. Ta produkcja antybiotyków może być z kolei upośledzona przez związki wytwarzane przez Escovopsis podczas infekcji¹⁹.

Ryc. 1: Cechy morfologiczne mrówek. Schematyczny rysunek mrówki przedstawiający struktury morfologiczne wymienione w protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obrona mrówek przed ścinaniem liści stanowi zatem zintegrowany zestaw mechanizmów behawioralnych i chemicznych, które wspólnie zapewniają tym mrówkom bardzo skuteczną ochronę przed chorobami⁴². Zrozumienie tych mechanizmów obrony jest bardzo interesujące i zostały one dokładnie zbadane^{16,20,42,43,44}. Jednak wizualna kompilacja zachowań obronnych, która pomogłaby w ich jednoznacznym zdefiniowaniu i opisie do systematycznego stosowania przez badaczy, nie jest, według naszej wiedzy, dostępna. Chociaż terminologia używana do opisywania zachowania mrówek jest stosunkowo ustandaryzowana, nie ma zatem pewności, że te same akty behawioralne są konsekwentnie wymieniane w różnych badaniach. W tym przypadku naszym głównym celem jest zaradzenie temu problemowi poprzez zapewnienie jasności i standaryzacji poprzez kompilację nagrań wideo poszczególnych zachowań profilaktycznych i obronnych wraz z powiązanymi definicjami. Nakręciliśmy te klipy podczas eksperymentu behawioralnego, w którym obserwowaliśmy i określaliśmy ilościowo zachowania w kontekście eksperymentalnych zakażeń Escovopsis podkolonii Acromyrmex echinatior, których wyniki prezentujemy również tutaj jako ilustracyjny przykład tego, jak ta kompilacja może być wykorzystana do badań behawioralnych.

Protokół

1. Izolacja Escovopsis

1. Wyizolować szczepy Escovopsis z kolonii laboratoryjnych Acromyrmex echinatior, umieszczając fragmenty ogrodu grzybów, z usuniętymi mrówkami, na szalce Petriego z wilgotną watą na kilka dni, aż Escovopsis wykiełkuje i zarodnikuje. Przenieść zarodniki na płytki agarowe z dekstrozą ziemniaczaną (PDA, 39 g/l) i inkubować w temperaturze ok. 23°C przez około dwa tygodnie.
   Uwaga: W obecnym badaniu użyto jednego szczepu.
2. Użyj sterylnej igły, aby wybrać dojrzałe zarodniki z tych pierwszych płytek. Zbierz wystarczającą ilość zarodników, aby pokryć końcówkę igły.
3. Zaszczepić zarodniki na nowych płytkach w sterylnych warunkach i inkubować w temperaturze ~ 23 °C przez około dwa tygodnie.
4. Gdy strzępki pokryją całą płytkę i wyrosną na dojrzałe brązowe zarodniki, powtórz krok 1.3, ale tym razem z zarodnikami z nowej płytki PDA.
5. Powtarzaj proces, aż do uzyskania czystego zapasu Escovopsis dla każdego szczepu (brak widocznych zanieczyszczeń rosnących na powierzchni płytki lub pod nią).

2. Konfiguracja eksperymentalna

1. Użyj trzech kolonii A. echinatior.
   Uwaga: Tutaj użyto kolonii Ae160b, Ae322 i Ae263.
2. Z każdej kolonii stwórz 12 podkolonii. Stwórz sześć podkolonii do obserwacji po 0 godzinach i sześć podkolonii do obserwacji po 72 godzinach. Daje to w sumie 36 podkolonii; oznaczyć połowę podkolonii z każdej rodziny "rodzicielskiej" jako kontrolę, a drugą połowę jako "leczenie Escovopsis".
   Uwaga: Podczas gdy w koloniach rodzicielskich obecność królowej wpływa na zachowanie robotnic, spodziewamy się (chociaż nie można tego zagwarantować), że podkolonie bez królowej prawdopodobnie będą zachowywać się jak kolonie z prawem królowej przez krótki okres czasu, który trwa eksperyment.
3. Dla każdej podkolonii użyj kwadratowego pudełka o długości: ~ 3,15 cala (8 cm), szerokości: ~ 2,17 cala (5,5 cm) i głębokości ~ 1,77 cala (4,5 cm).
   Uwaga: Ważne jest, aby zapewnić mrówkom wystarczająco dużo miejsca na zewnątrz fragmentu grzyba, aby mogły żerować i wyrzucać odpady, ale jednocześnie sprawić, aby pudełko było na tyle małe, aby możliwe było filmowanie i rozpoznawanie zachowań.
4. Do każdej podkolonii dodaj kawałek centralnej części ogrodu grzybów (L. gongylophorus) z pierwotnej kolonii wielkości łyżeczki do herbaty (około 2,2 cm 3 i 1,2 g), kilka liści jeżyny i kawałek waty nasączonej wodą.
   Uwaga: Wata zapewnia wilgoć. Nie powinien kapać wodą i nie powinien dotykać ogrodu grzybów.
5. W przypadku podkolonii traktowanych Escovopsis należy użyć pętli inokulacyjnej i wypełnić otwór tak, aby był pokryty zarodnikami Escovopsis. Zaszczep zarodniki, delikatnie stukając w małą, zlokalizowaną część ogrodu grzybów dziesięć do dwudziestu razy, aby zarodniki nie były zbyt skupione.
6. W przypadku podkolonii używanych jako kontrole, naśladuj aplikację Escovopsis w ogrodzie grzybów za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej.
   Uwaga: Chociaż nie zostało to zrobione w obecnym eksperymencie, inokulację sterylnego proszku (takiego jak grafit lub talk w proszku) można przeprowadzić na tym etapie, aby odróżnić infekcję patogenem od czynnika obojętnego.
7. W przypadku obserwacji trwających 72 godziny pozostaw połowę podkolonii (zarówno kontrolnych, jak i zainfekowanych) na 72 godziny po wprowadzeniu Escovopsis przed dodaniem mrówek lub rozpoczęciem nagrywania wideo.
   Uwaga: Odczekanie 72 godzin pod nieobecność mrówek zwiększa prawdopodobieństwo wykiełkowania zarodników Escovopsis (niepublikowane dane in vitro); Chociaż zwiększa to również ryzyko innych infekcji (na przykład spowodowanych grzybem już obecnym w ogrodzie grzybów), ten okres jest preferowany, aby to leczenie reprezentowało wczesny etap ustalonej infekcji.
8. W przypadku obserwacji trwających 0 godzin, bezpośrednio po kroku 2.6 i około 30 minut przed rejestracją, do każdej skrzynki dodać jednocześnie dwa czerwie, cztery małe robotnice i cztery większe robotnice z kolonii rodzicielskiej.
   1. Użyj dwóch głównych robotnic z ogrodu, którzy są młodzi z jasnym pigmentem, z Actinobacteria pokrywającymi większość naskórka. Weź pozostałe dwa spoza ogrodu, z ciemnym pigmentem i promieniowcami pokrywającymi tylko płytki boczne szyjki macicy.
9. W przypadku obserwacji trwających 72 godziny powtórzyć czynności 2,8 i 2,8,1 na 30 minut przed zapisem, tj. 71,5 godziny po inokulacji Escovopsis.
   Uwaga: Podkolonie eksperymentalne są znacznie mniejsze niż zadomowione naturalne kolonie Acromyrmex. Jest to konieczne, aby dokładnie rejestrować zachowanie. Chociaż może to wpływać jakościowo na częstotliwość niektórych zachowań, skład podkolonii został wybrany tak, aby odzwierciedlić mieszankę robotnic w naturalnych koloniach, aby z większym prawdopodobieństwem jakościowo odzwierciedlić interakcje behawioralne.

3. Zachowania związane z nagrywaniem i ocenianiem wideo

1. Użyj endoskopu USB podłączonego do laptopa (lub jego odpowiednika) i zapewnij wystarczającą ilość światła.
2. Dla każdej podkolonii należy nagrywać wideo przez 4 godziny (zaczynając od 0 godziny lub 72 godzin po zakażeniu).
3. Po nagraniu 36 podkolonii przejrzyj łącznie 144 godziny materiału filmowego i oceń wszystkie interesujące zachowania dla wszystkich osobników w każdej podkolonii.
   Uwaga: W obecnym przykładzie eksperymentalnym musieliśmy wykluczyć dwie podkolonie (kontrolę z kolonii Ae160b i podkolonię traktowaną z kolonii Ae322) z powodu zakażenia grzybami innymi niż Escovopsis, zmniejszając całkowitą liczbę godzin obserwacji do 136.
4. Za każdym razem, gdy obserwuje się zachowanie, zapisuj je jako 1 wystąpienie.
   nuta: Zachowanie może trwać krótko lub długo, ale ocenia je jako > 1 tylko wtedy, gdy zostanie przerwane przez inne zachowanie lub jeśli mrówka jest pasywna przez pewien czas.

4. Zachowania

Uwaga: Definicje zachowań zostały stworzone przy użyciu kombinacji opisów z poprzednich badań^{23,27,28,31,45} i osobistych obserwacji. Szczegółowa ilustracja przedstawiająca ważne struktury morfologiczne używane w protokole rozpoznawania zachowań znajduje się w Rysunek 1.

1. Samodzielna pielęgnacja i czyszczenie anteny (Wideo 1)
   1. Zwróć uwagę, czy mrówka zatrzymuje ruch nóg, aby zainicjować samodzielną pielęgnację. Sprawdź, czy anteny są przeciągnięte przez czyściki do anten na przednich nogach (Rysunek 1), struktura przypominająca zacisk znajdująca się na stawie piszczelowo-stępowym, składająca się z wycięcia skierowanego w stronę ostrogi z włosiem i grzebieniami o różnych rozmiarach^45,46.
   2. Po wyczyszczeniu anteny obserwuj, że mrówka wyczyści nogi i czyściki do anteny, przeciągając nogi przez aparaty gębowe, usuwając cząstki i potencjalne patogeny za pomocą glossy ( Rysunek 1).
      Uwaga: Samodzielna pielęgnacja może polegać na czyszczeniu anteny, a następnie środków do czyszczenia anteny (Rysunek 1), ale także na użyciu aparatów gębowych do czyszczenia nóg. Kiedy mrówka czyści nogi, najczęściej czyści wszystkie sześć nóg po kolei.
2. Pielęgnacja grzybów (wideo 2)
   1. Zwróć uwagę, czy mrówka zatrzymuje ruchy nóg w ustalonym punkcie w ogrodzie grzybów. Zauważ, że czułki są nieruchome i równolegle skierowane w stronę grzyba, tak że kąt między scape a funiculus (Rysunek 1) wynosi około 45°, a końcówki czułków prawie stykają się ze sobą, blisko końcówek żuchwy (Rysunek 1).
   2. Zauważ, że górny (szczęka) i dolny (warg sromowy) aparat gębowy są otwarte, a glossa (Ryc. 1) wyłania się, aby lizać grzyba.
3. Allogrooming (Wideo 3)
   1. Obserwuj to zachowanie, gdy jedna lub więcej mrówek zbliżyło się do innej mrówki (biorcy) lub odwrotnie. Podczas tego zachowania mrówki zatrzymują ruch i stoją blisko siebie w kontakcie fizycznym. Mrówka (mrówki) pielęgnująca może się nieznacznie poruszać, aby pokryć większy obszar ciała mrówki biorcy.
   2. Zauważ, że czułki aktora (aktorów) mogą być nieruchome i skierowane w określony punkt mrówki odbiorczej lub poruszać się i lekko stukać w odbiornik. Kąt między krajobrazem a funiculus (Rysunek 1) wynosi około 45°, w zależności od tego, czy są one zamocowane w określonym punkcie, czy stuknięte. Końcówki czułków aktora są zwykle blisko siebie, a końcówki żuchwy (Ryc. 1).
   3. Zauważ, że górny (szczęka) i dolny (warg sromowy) aparat gębowy są otwarte, a glossa (Ryc. 1) wyłania się, aby polizać mrówkę odbiorczą.
4. Pielęgnacja gruczołów śródopłucnowych (wideo 4)
   1. Obserwuj, kiedy mrówka przestaje się poruszać, aby zainicjować pielęgnację gruczołu śródopłucnowego (Rysunek 1). Zauważ, że mrówka przechyla się na bok, aby dotrzeć do jednej z przednich nóg z tyłu, aby pocierać otwór (przewód) gruczołu śródopłucnowego (na przykład prawą przednią nogę).
      Uwaga: Druga przednia noga jest jednocześnie (w tym przykładzie lewa przednia noga) lizana przez glossę (Rysunek 1).
   2. Sprawdź, czy mrówka przechyla się na przeciwną stronę, zamienia nogami i powtarza ten sam ruch z przeciwnymi nogami. Mrówka kontynuuje przesuwanie przednich nóg do gruczołów śródopłucnowych, a następnie do glossy, stale przełączając się między nogami (Rysunek 1).
      Uwaga: W tym przykładzie mrówka przekaże teraz lewą przednią nogę do gruczołu śródopłucnowego, a prawą przednią nogę do glossy (Rysunek 1). Po pielęgnacji gruczołu śródopłucnowego (Rysunek 1) mrówka często inicjuje samodzielną pielęgnację (Krok 4.1).
5. Pielenie zarodników (wideo 5)
   1. Obserwuj to zachowanie, gdy mrówka zatrzymuje ruchy nóg w ustalonym punkcie w ogrodzie grzybowym. Zauważ, że czułki są nieruchome i równoległe, skierowane w stronę grzyba tak, że kąt między pejzażem a funiculusem wynosi około 45°, a końcówki czułków prawie stykają się ze sobą i końcami żuchw (Ryc. 1).
   2. Sprawdź, czy mrówka otwiera swoje żuchwy (Rysunek 1), aby złapać widoczne zarodniki Escovopsis i oderwać je od uprawy grzyba, odrywając je. Mrówka wynosi skupisko zarodników z gniazda, podczas gdy czułki delikatnie poruszają się w celu orientacji. Anteny mogą być czyszczone za pomocą czyścików do anten (Rysunek 1; patrz Wideo 1) podczas trzymania skupiska zarodników. Mrówka upuszcza zarodniki na stos odpadów.
      Uwaga: Rejestrowanie aktywności wokół hałdy odpadów nie zostało wykonane w obecnym eksperymencie, ale byłoby odpowiednim rozszerzeniem obecnego protokołu.
6. Pielenie grzybów (Wideo 6)
   1. Obserwuj to zachowanie, gdy mrówka zatrzymuje ruchy nóg w ustalonym punkcie grzyba. Czułki są luźno skierowane w stronę części grzyba, którą mrówka próbuje usunąć, jednocześnie lekko stukając w kawałek grzyba.
   2. Zauważ, że mrówka używa swoich żuchw do przecinania plonu grzyba, aby oderwać określony obszar, lub do chwytania części kawałka grzyba żuchwami (Rysunek 1). Mrówka będzie jednocześnie kołysać się z boku na bok na nogach, jednocześnie odrywając kawałek grzyba.
      Uwaga: Pielenie może być wykonywane przez wielu pracowników, zarówno przez nieletnich, jak i głównych. Jeśli tak, niektóre mrówki wykonują cięcie grzyba, inne wykonują ruch kołysania i ciągnięcia. Oderwana część grzyba jest wynoszona na zewnątrz gniazda i wyrzucana na stos odpadów. Rejestrowanie składowania odpadów nie zostało wykonane w obecnym eksperymencie, ale byłoby odpowiednim rozszerzeniem obecnego protokołu.
7. Pielęgnacja płynów kałowych (wideo 7)
   1. Obserwuj to zachowanie, gdy mrówka zatrzymuje ruchy nóg w ustalonym punkcie w ogrodzie grzybowym. Mrówka zgina gaster (Rysunek 1) i kieruje się do siebie, aby nałożyć kroplę płynu kałowego na aparat gębowy.
   2. Zauważ, że mrówka ciągnie przednie nogi przez żuchwy (Rysunek 1), pojedynczo. Następnie mrówka przesuwa czułki przez czyściki do anten (Rysunek 1) znajdujące się na stawie piszczelowo-stępowym przednich nóg.
8. Niedomykalność kropelkowa (Wideo 8)
   1. Obserwuj to zachowanie, gdy mrówka zatrzymuje ruchy nóg w ustalonym punkcie grzyba. Czułki są nieruchome i równoległe, skierowane w stronę grzyba tak, że kąt między pejzażem a funiculusem wynosi około 45°, a końcówki czułków prawie stykają się ze sobą i końcami żuchw (Ryc. 1).
   2. Obserwuj, że mrówka zwraca kroplę płynu na grzyba, od przezroczystej do jasnożółtej, a nawet brązowej, z aparatu gębowego.

Wyniki

Głównym celem tego badania było stworzenie krótkich klipów ilustrujących zachowania związane z obroną przed chorobami u mrówek tnących liście, aby wygenerować katalog, który będzie używany jako punkt odniesienia dla przyszłych badań. Ponadto w badaniu wykorzystano przykład konfiguracji eksperymentalnej, w ramach której zachowania te zostały określone ilościowo, aby pokazać, w jaki sposób ten katalog może być wykorzystany w badaniach behawioralnych, których reprezentatywne wyniki podsumowujemy tutaj.

Podkolonie zostały założone do obserwacji we wczesnym stadium (0 godzin) i późnym stadium (72 godziny) infekcji. Ze względu na ciężkie zakażenia grzybami innymi niż Escovopsis po 72 godzinach, wykluczono dwie podkolonie (jedną kontrolną dla kolonii Ae160b i jedną leczniczą dla kolonii Ae322), dlatego skupiamy się na prezentacji wyników w punkcie czasowym 0 h i kładziemy mniejszy nacisk na zachowania obserwowane po 72 godzinach. Po sfilmowaniu wszystkich podkolonii i ocenie zachowań obronnych, znaleźliśmy różnice we wzorcach zachowań związanych z czasem po infekcji i kontekstem, w tym różne sposoby, w jakie były one wykorzystywane przez mniejsze i większe robotnice. W przeciwieństwie do tego, samopielęgnacja była wykonywana przez cały czas zarówno w podkoloniach kontrolnych, jak i zakażonych. Było to również powszechne, gdy mrówki szukały i próbowały usunąć strzępki lub zarodniki Escovopsis. Ponieważ to zachowanie było tak powszechnie obserwowane i częste we wszystkich sytuacjach, nie określiliśmy go ilościowo.

Oceniliśmy wszystkie inne zachowania opisane w protokole i przedstawiliśmy obliczone całkowite i średnie częstości dla mniejszych i większych robotnic na podkolonię (Tabela 1). Odkryliśmy, że w grupie kontrolnej drobni robotnicy pielęgnowali uprawy ogrodowe częściej niż główni robotnicy (Rysunek 2a) i anegdotycznie zaobserwowaliśmy, że spędzali więcej czasu w ogrodzie grzybowym. W koloniach zakażonych Escovopsis występowała tendencja do wzmożonej pielęgnacji grzybów w stosunku do kolonii kontrolnych, ale nie było to istotne (F_1,23 = 2,80, p = 0,1077; Tabela 2; Rysunek 2a). Stwierdzono nieistotny wzrost pielęgnacji kału z infekcją (F_1,23 = 0,60, p = 0,4455; Tabela 1), ale nie ma różnicy między mniejszymi i większymi pracownikami (Rysunek 2b). Zaobserwowaliśmy oczyszczanie kału, gdy pracownicy weszli do grzyba, a nie gdy byli na grzybie lub całkowicie z dala od niego przez dłuższy czas.

Rysunek 2: Częstotliwość zabiegów pielęgnacyjnych. Średnia liczba (± błędów standardowych (SE); n = 9) (a) czynności związanych z pielęgnacją grzybów i (b) czynnościami związanymi z oczyszczaniem płynów kałowych w ciągu czterech godzin po inokulacji, porównując drobnych i głównych pracowników w grupie kontrolnej i leczeniu Escovopsis. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kilka zachowań było niezwykle rzadkich. Oczyszczanie gruczołów śródopłucnowych zaobserwowaliśmy tylko cztery razy, a wszystkie przypadki wystąpiły po 72 godzinach; raz w grupie kontrolnej i trzy razy w koloniach z zakażeniem Escovopsis (Tabela 1). Prawie równie rzadko odkryliśmy, że mrówki zwracały kropelkę płynu na ogród grzybowy i kilka razy na zewnątrz grzyba (Tabela 1). W grupach 0 h zdarzyło się to raz w podkolonii kontrolnej i dwa razy w zakażonych koloniach - we wszystkich trzech przypadkach zachowanie było wykonywane przez głównego robotnicę. Pewnego razu drobny pracownik zwymiotował kroplę w rogu pudełka, a raz główny pracownik zrobił to samo z liściem jeżyny, w obu przypadkach w leczeniu Escovopsis. W koloniach 72-godzinnych nigdy nie zaobserwowano niedomykalności kropelek na grzybie w koloniach kontrolnych, ale zdarzyło się siedem razy w zakażonych koloniach. Sześć z nich zostało wykonanych przez głównych pracowników, a trzy z nich przez jedną osobę, która dodała kropelki poza ogrodem grzybów.

Pielenie zarodników (Rysunek 3a) i pielenie grzybów (Rysunek 3b) były rzadko spotykane. Chociaż nie stwierdzono znaczącej różnicy w częstości odchwaszczania grzybów między zakażonymi koloniami a grupą kontrolną, istniała tendencja do zwiększania się pielenia wraz z upływem czasu od infekcji (F_1,23 = 2,91, p = 0,1014; Tabela 2). Nasze obserwacje skupiły się na odchwaszczaniu zarodników Escovopsis, które nie zmieniało się znacząco w czasie, ale istniała tendencja do większej częstości w koloniach zakażonych Escovopsis niż w niezakażonych kontrolach (F_1,23 = 3,27, P = 0,0838; Tabela 2). Mniej podkolonii zakażonych Escovopsis miało widoczne zarodniki pozostałe po okresie obserwacji z infekcją we wczesnym stadium (gdy mrówki zostały wprowadzone po 0 godzinach od zaszczepienia zarodników), przy czym mrówki usunęły wszystkie zarodniki w prawie połowie podkolonii (4 z 9; Rysunek 3c). W późniejszych stadiach infekcji (gdzie mrówki zostały wprowadzone po 72 godzinach inokulacji zarodników), mrówki nie były w stanie całkowicie usunąć zarodników w żadnej z podkolonii. Podsumowując, obserwacje te sugerują tendencję mrówek do przechodzenia od pielenia zarodników do pielenia grzybów w trakcie infekcji.

Rysunek 3: Częstotliwość odchwaszczania. Średnia częstość (± błędy standardowe (SE); n = 9) a) odchwaszczania zarodników (zarodników Escovopsis) i b) odchwaszczania grzybów (Escovopsis lub innych grzybów) podczas 4-godzinnego okresu obserwacji, porównując osobniki młodsze i większe z grup poddanych działaniu substancji, oraz c) liczby podkolonii z widocznymi zarodnikami Escovopsis w grupach poddanych działaniu środka pod koniec okresu obserwacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

	Pracownicy niepełnoletni – kontrola	Pracownicy młodociani – leczenie	Główni pracownicy - kontrola	Pracownicy najważniejsi - leczenie
0h
Pielęgnacja grzybów	84 (9.333)	131 (14,56)	37 (4.111)	66 (7.333)
Zakwaterowanie w pomieszczeniach	6 (0,6667)	14 (1,556)	5 (0,5556)	6 (0,6667)
Pielenie zarodników	0	3	0	5 (0,5556)
Pielenie grzybów	0	0	0	0
Pielęgnacja płynów kałowych	46 (5.111)	69 (7.667)	27 (3.000)	48 (5,333)
Aplikacja kropelkowa	0	0	1 (0,1111)	2 (0,2220)
Pielęgnacja gruczołów śródopłucnowych	0	0	0	0
72h
Pielęgnacja grzybów	10 (1,429)	45 (5.000)	24 (3,429)	38 (4,222)
Zakwaterowanie w pomieszczeniach	2 (0,2857)	10 (1.111)	1 (0,1110)	4 (0,4440)
Pielenie zarodników	0	0	0	1 (0,1110)
Pielenie grzybów	0	1 (0,1110)	0	2 (0,2220)
Pielęgnacja płynów kałowych	19 (2.714)	38 (4,222)	30 (4,286)	30 (3.333)
Aplikacja kropelkowa	0	1 (0,1110)	0	6 (0,6667)
Pielęgnacja gruczołów śródopłucnowych	0	2 (0,2220)	1 (0,1429)	1 (0,1110)

Tabela 1: Liczba zachowań w ciągu czterech godzin obserwacji po 0 i 72 godzinach od zaszczepienia Escovopsis.Średnia całkowita liczba obserwacji (ze średnią częstością na osobę w nawiasach), porównujących odpowiednio drobnych i głównych pracowników z podkolonii kontrolnych i zakażeń Escovopsis (n = 9).

pkt. pkt. ziarna pkt. pkt. TGL pkt. pkt. jedn. pkt. TGL pkt. TGL pkt. jedn. pkt. jedn. TGL TGL TGL pkt. TGL pkt. TGL pkt. TGL

Testy 3 stałych efektów
		Pielęgnacja grzybów				Allogrooming				Pielęgnacja kału				Pielenie zarodników				Pielenie grzybów
Efekty		Num DF	Den DF	Wartość F	Pr > F	Num DF	Den DF	Wartość F	Pr > F	Num DF	Den DF	Wartość F	Pr > F	Num DF	Den DF	Wartość F	Pr > F	Num DF	Den DF	Wartość F	Pr > F
Kolonia		cyfra arabska	23	0,77	0,4733	cyfra arabska	23	0,52	0,5989	cyfra arabska	23	0,54	0,5903	cyfra arabska	23	0,51	0,6052	cyfra arabska	23	Pytanie 1,17	0,3272
Podkolonia (kolonia)		6	23	0,93	0,4892	6	23	0,51	0,7978	6	23	0,63	0,7067	6	23	1,67	0,1742	6	23	Pytanie 1,53	0,2127
Leczenie		1	23	2.8	0,1077	1	23	1,85	0,1875	1	23	0,6	0,4455	1	23	3,27	0,0838	1	23	1	0,3275
Czas		1	23	Lokal 6,53	0,0177	1	23	0,88	0,3574	1	23	0,97	0,3361	1	23	0,53	0,4742	1	23	Różnica w cenie 2,91	0,1014

Tabela 2: Wyniki statystyczne mieszanych testów ANOVA dotyczące różnych zachowań, dla których można przeprowadzić analizy statystyczne. Stałymi efektami były: kolonia, podkolonia (zagnieżdżona w kolonii), leczenie i czas. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Film 1: Samodzielna pielęgnacja i czyszczenie anteny. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.

Wideo 2: Pielęgnacja grzybów. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.

Wideo 3: Allogrooming. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.

Wideo 4: Pielęgnacja gruczołów śródopłucnowych. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.

Wideo 5: Pielenie zarodników. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.

Wideo 6: Pielenie grzybów. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.

Wideo 7: Pielęgnacja płynów kałowych. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.

Wideo 8: Niedomykalność kropelkowa. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.

Dyskusja

Głównym celem tego badania było zaobserwowanie i zarejestrowanie charakterystycznych zachowań obronnych mrówek podczas ścinania liści w obecności infekcji grzybiczej Escovopsis, tworząc klipy referencyjne do wykorzystania przez szerszą społeczność naukową. Należy zauważyć, że zachowania te nie są wyłączne dla obrony kolonii przed Escovopsis, ale mogą również odgrywać rolę w obronie przed innymi zanieczyszczeniami i infekcjami 6,7,8,9,10,11,12 oraz w obronie samych mrówek⁴². Nasz protokół stanowi tło dla szerszych badań nad mechanizmami obronnymi u mrówek hodujących grzyby. Prawdopodobnie będzie to szczególnie przydatne: (i) dla młodych badaczy, którzy nie są zaznajomieni z tymi zachowaniami; (ii) zapewnienie spójnych definicji i obserwacji zachowań; (iii) ułatwienie porównań między badaniami i gatunkami mrówek; (iv) ponieważ pewna liczba tych zachowań może występować tak rzadko, że nawet doświadczeni badacze mogli nigdy ich nie zaobserwować; (iv) ponieważ zrozumienie i rozpoznanie zachowań w kontrolowanych warunkach w laboratorium pomaga w badaniach in situ, gdzie warunki są trudniejsze do kontrolowania.

Wyniki naszego badania behawioralnego są zgodne z wcześniejszymi pracami, które wykazały, że nieletni pracownicy pielęgnują grzyby - co jest kluczowe, jeśli infekcja zostanie wcześnie wykryta - bardziej niż główni pracownicy 25,28,32. W tym przypadku główni pracownicy zwiększyli ilość pielęgnacji grzybów po zakażeniu Escovopsis (ryc. 2a). Sugeruje to, że nieletni robotnicy są dominującymi pielęgnatorami grzybów, ale główni pracownicy mogą pomóc w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się bardziej ugruntowanych infekcji. Większe duże robotnice mogą szybciej usuwać zarodniki, podczas gdy mniejsze robotnice mogą być bardziej odpowiednie do usuwania mniej dostępnych zarodników. Odkryliśmy również, że robotnicy z powodzeniem usunęli zarodniki w około połowie zakażonych podkolonii (czterech z dziewięciu), gdy zostały one wprowadzone w momencie infekcji, a zatem mogli wcześnie wykryć patogen (Figura 3c). Ogólnie rzecz biorąc, wskazuje to na szereg reakcji behawioralnych, w których mrówki najpierw próbują zatrzymać infekcję Escovopsis, usuwając zarodniki (i robiąc to, zanim infekcja się rozprzestrzeni), a nie usuwając części ogrodu grzybów (ryc. 3a,b). Zmienia się to z czasem, jeśli infekcja postępuje, kiedy mrówki są bardziej skłonne do usuwania części ogrodu grzybów²⁸. Chociaż nasze próby były zbyt małe, aby były rozstrzygające i nie możemy wykluczyć, że jednoczesne infekcje indukowały zachowania związane z odchwaszczaniem, nasze dane potwierdzają ten trend, przy czym pielenie grzybów jest głównie obecne na późniejszych etapach infekcji (Rysunek 3a). Ogólnie niski poziom odchwaszczania grzybów może sugerować, że mrówki używały innych mechanizmów obronnych (np. chemikaliów), aby zahamować dalszy wzrost Escovopsis, lub że żadna z naszych eksperymentalnych podkolonii nie była zbyt poważnie zainfekowana (co sprawia, że bardziej destrukcyjne obrony są niepotrzebne).

Nasze odkrycia sugerują, że samopielęgnacja płynem kałowym jest charakterystyczna dla mrówek wchodzących do ogrodu grzybów i stosowana jako środek profilaktyczny, a nie wiąże się z infekcją. Podobne obserwacje zaobserwowano u samic założycielek, które pielęgnują się i przenoszą kropelki kału ustami na nogi, podczas wchodzenia do gniazda lub obchodzenia się z plonem²⁷. Infekcja powinna teoretycznie zwiększyć aktywność pracowników na skraju ogrodu grzybowego, jeśli usunięty zainfekowany materiał zostanie wyniesiony i wrzucony na stosy odpadów. W związku z tym pielęgnacja płynów kałowych może również pośrednio wzrosnąć podczas infekcji, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się choroby. Spodziewalibyśmy się odwrotnego wzorca w przypadku ciężkich infekcji, ze zmniejszonym ruchem na skraju ogrodu grzybowego, ponieważ pracownicy albo porzucają grzyba, albo stosują bardziej ekstremalne środki, takie jak obrona chemiczna.

Podczas gdy płyny kałowe mogą służyć jako ważna profilaktyczna substancja chemiczna dla danej osoby, allogrooming jest używany przez kolegów z gniazda na innych robotnicach, jeśli wykryją obce cząstki lub drobnoustroje. Istotna różnica, którą zaobserwowaliśmy między częstością (Tabela 1) pielęgnacji płynów kałowych (n = 304) a allogroomingu (n = 48) może wskazywać na różnicę w wykrywaniu patogenów. Mrówki nie są w stanie łatwo wykryć patogenów na sobie za pomocą czułków; Z drugiej strony allogrooming jest wykonywany przez współlokatorów, którzy mogą sprawdzić całe ciało mrówki i zdecydować się na pielęgnację tylko wtedy, gdy jest to konieczne. Ponieważ Escovopsis jest pasożytem ogrodu grzybowego, a nie mrówek, może to również wyjaśniać niską ilość allogroomingu.

Rzadko obserwowaliśmy pielęgnację gruczołów śródopłucnowych i to tylko w późniejszych stadiach infekcji. Gatunki mrówek hodujących grzyby z liczną pokrywą bakteryjną Pseudonocardia pielęgnują gruczoły śródopłucnowe w mniejszym stopniu niż gatunki z mniejszą pokrywą lub bez pokrycia^25,47. Ponieważ A. echinatior ma obfitość symbiontu⁴⁷, może to wyjaśniać niską częstotliwość pielęgnacji gruczołów. Wydzielina gruczołu śródopłucnowego jest również kosztowna do wytworzenia³⁰ i może być przechowywana w kieszeni podpoliczkowej przez dłuższy czas, co oznacza, że potrzeba pielęgnacji gruczołu śródopłucnowego może być rzadka. Podczas pielęgnacji gruczołu śródopłucnowego mrówki jednocześnie zmieniają nogi i liżą nogę, która właśnie oczyściła gruczoł; zarodniki są w ten sposób przenoszone do kieszeni podpoliczkowej, gdzie wydzieliny gruczołowe mają kluczowe znaczenie dla hamowania potencjału Escovopsis do późniejszego kiełkowania²⁵. Mniejsze robotnice są liczniejsze w gnieździe i mają większe gruczoły śródopłucnowe na jednostkę masy ciała³⁰, co sugeruje, że są odpowiedzialne za większość wydzielin gruczołów śródopłucnowych. Może to również wyjaśniać, dlaczego w naszym badaniu najwyższa częstotliwość pielęgnacji grzybów występowała wśród nieletnich pracowników.

Spodziewaliśmy się zaobserwować zachowania wskazujące na aktywne stosowanie antybiotyków z bakteryjnego symbionta Pseudonocardia, powszechnie obserwowanego na naskórku pracowników Acromyrmex i znanego z odgrywania roli w obronie przed Escovopsis 36,39,40. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem braku zaobserwowania takiego zachowania jest to, że stosowanie tych antybiotyków może być włączone do innych zachowań, takich jak samodzielna pielęgnacja, a następnie pielęgnacja grzybów i / lub pielenie, co może utrudnić zaobserwowanie go jako odrębnego zachowania.

Zaobserwowaliśmy niezwykłe zachowanie zwracanych kropelek płynu do ogrodu grzybów. Zwracanie pokarmu dla członków gniazda zostało już wcześniej opisane u mrówek tnących liście²². W naszym eksperymencie kropelki różniły się kolorem od przezroczystego do ciemnobrązowego, co sugeruje, że mogą być źródłem pożywienia dla innych mrówek i/lub dostarczać wodę. Zaobserwowaliśmy tylko dwa przypadki, w których inne mrówki piły z kropelek, więc nie możemy określić, czy kropelki przynoszą korzyści innym mrówkom, czy służą do nawodnienia grzyba, gdy wilgotność jest niska. Większość obserwacji tego zachowania miała miejsce podczas infekcji Escovopsis, które mogą sugerować rolę obronną, taką jak pobudzanie immunologiczne poprzez niedomykalność peptydów przeciwdrobnoustrojowych^16,48. Nie możemy wyciągnąć jednoznacznych wniosków na ten temat, ponieważ takie zachowanie było rzadkie, ale byłby to interesujący kierunek do dalszych badań, na przykład poprzez ustalenie, czy kropelki mają właściwości przeciwdrobnoustrojowe.

Biorąc pod uwagę, że badania obserwacyjne złożonych zachowań obronnych mrówek tnących liście, w tym jakiekolwiek porównanie z infekcją grzybiczą w ogrodzie i bez niej, byłyby niezwykle trudne do przeprowadzenia w terenie, dane eksperymentalne mogą dostarczyć cennych informacji na temat tych zachowań w bardziej kontrolowanych warunkach. Chociaż obserwacje wykonane w warunkach laboratoryjnych mogą różnić się od zachowań stwierdzonych w warunkach naturalnych, narzędzia takie jak nasz katalog kluczowych zachowań obronnych muszą zostać opracowane, aby w przyszłości ulepszyć zarówno badania eksperymentalne, jak i terenowe. Podejście eksperymentalne może jednak częściowo wyjaśniać, dlaczego niektóre zachowania były niezwykle rzadkie (np. allogrooming, pielęgnacja gruczołów śródopłucnowych) w naszej demonstracji stosowania tych definicji behawioralnych. Przyszłe badania mogą zatem rozważyć ograniczenia tej eksperymentalnej konfiguracji, aby znaleźć sposoby na dokonywanie bardziej naturalnych obserwacji. Do obecnego protokołu można również włączyć dodatkowe czynniki, takie jak rozróżnienie między pracownikami przenoszącymi promieniowce (młodszymi) a starszymi pracownikami z mniej obfitą osłoną, którzy mogą inaczej reagować na zagrożenie zakażeniem Escovopsis . Istnieją kompromisy między zwiększeniem dokładności obserwacji (na przykład poprzez punktację osobników ogniskowych) lub posiadaniem większego rozmiaru podkolonii (większej liczby robotnic), a ilością czasu lub liczbą podkolonii lub osobników, które można sfilmować w danym momencie. Niemniej jednak, chociaż zestaw można rozszerzyć w przypadku większych badań behawioralnych z naciskiem na odniesienie się do celu behawioralnego, w tym przypadku skupiliśmy się na skutecznym zaprezentowaniu metody rejestrowania i definiowania określonych zachowań obronnych.

Udokumentowaliśmy zachowania, które przyczyniają się do obrony mrówek ścinających liście, a co ważniejsze, systematycznie zidentyfikowaliśmy, opisaliśmy i uchwyciliśmy zachowania obronne na filmie. Nasze reprezentatywne wyniki wzmacniają inne badania w tej dziedzinie, sugerujące, dlaczego patogenowi trudno jest skutecznie zainfekować kolonie mrówek hodujących grzyby, gdy ma do czynienia z obszernym zestawem zachowań obronnych i związanym z nimi stosowaniem związków przeciwdrobnoustrojowych. Naszym głównym celem było dostarczenie nowego narzędzia do przyszłych prac w tej dziedzinie i mamy nadzieję, że katalog behawioralny okaże się cenny dla zapewnienia konsensusu i usprawnionych definicji, obserwacji i interpretacji zachowań, aby służyć jako ważne źródło dla przyszłych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pudełka	plastikowe N/A	N/A	Przezroczyste. Długość: 3,15 cala (8 cm), szerokość: 2,17 cala (5,5 cm), głębokość: 1,77 cala (4,5 cm)
Szalki	Petriego Sarstedt	82,1472	3,62x0,63 cala (9,2x1,6 cm)
Pętle inokulacyjne	Labsolute	7696431	jednorazowe 1uL. Długość: 7,67 cala (19,5 cm)
Kamery	DBPower	NTC50HD_8,5 mm	Endoskop USB
Uchwyty do kamer	N / A	N / A Stary	stojak na zacisk zlewki.
Laptop	HP	N/A	Ogólny laptop do zapisywania nagrań.
Program używany na laptopie	Windows Movie maker	N/A
Kleszcze	Vermandel	50.054	Miękki
bulion dekstrozowy	Sigma-Aldrich	P6685-1KG	24 g/L