Produkcja powlekanego nafionem, zredukowanego tlenku grafenu/polianiliny czujnika chemiorezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji mikrobiologicznej

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy protokół produkcji chemicznie zredukowanego mikroczujnika pH z powłoką Nafion, funkcjonalizowanego polianiliną, elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu. Ten półprzewodnikowy czujnik pH oparty na chemiorezystorze może wykrywać zmiany pH w czasie rzeczywistym podczas procesu fermentacji Lactococcus lactis.

Streszczenie

Tutaj przedstawiamy inżynierię półprzewodnikowego mikroczujnika pH opartego na funkcjonalizowanym polianiliną, elektrochemicznie zredukowanym tlenku grafenu (ERGO-PA). Elektrochemicznie zredukowany tlenek grafenu działa jako warstwa przewodząca, a polianilina działa jako warstwa wrażliwa na pH. Przewodność polianiliny zależna od pH występuje w wyniku domieszkowania podczas protonowania i dozieszywania podczas deprotonacji. Stwierdziliśmy, że elektroda półprzewodnikowa ERGO-PA nie działała jako taka w procesach fermentacji. Elektrochemicznie aktywne gatunki, które bakterie wytwarzają podczas procesu fermentacji, zakłócają odpowiedź elektrody. Z powodzeniem zastosowaliśmy Nafion jako warstwę przewodzącą protony zamiast ERGO-PA. Elektrody z powłoką nafionową (ERGO-PA-NA) wykazują dobrą czułość 1,71 Ω/pH (pH 4 - 9) do pomiarów za pomocą czujników chemiorezystancyjnych. Przetestowaliśmy elektrodę ERGO-PA-NA w czasie rzeczywistym w fermentacji Lactococcus lactis. Podczas wzrostu L. lactis pH pożywki zmieniło się z pH 7,2 na pH 4,8, a rezystancja elektrody półprzewodnikowej ERGO-PA-NA zmieniła się z 294,5 Ω do 288,6 Ω (5,9 Ω na 2,4 jednostki pH). Odpowiedź pH elektrody ERGO-PA-NA w porównaniu z reakcją konwencjonalnej elektrody pH na bazie szkła pokazuje, że bezreferencyjne układy mikroczujników półprzewodnikowych działają z powodzeniem w fermentacji mikrobiologicznej.

Wprowadzenie

pH odgrywa istotną rolę w wielu procesach chemicznych i biologicznych. Nawet niewielkie zmiany wartości pH zmieniają proces i niekorzystnie wpływają na jego wynik. W związku z tym konieczne jest monitorowanie i kontrolowanie wartości pH na każdym etapie eksperymentów. Elektroda pH na bazie szkła jest z powodzeniem stosowana do monitorowania pH w wielu procesach chemicznych i biologicznych, chociaż zastosowanie elektrody szklanej stwarza kilka ograniczeń w pomiarze pH. Elektroda pH na bazie szkła jest stosunkowo duża, delikatna i możliwe są niewielkie wycieki elektrolitu do próbki. Co więcej, elektroda i elektronika są stosunkowo drogie w zastosowaniach w 96-dołkowych systemach fermentacji przesiewowej. Co więcej, czujniki elektrochemiczne są inwazyjne i zużywają próbkę. W związku z tym korzystniejsze jest stosowanie nieinwazyjnych, bezreferencyjnych czujników.

Obecnie zminiaturyzowane systemy reakcji są preferowane w wielu zastosowaniach inżynierii chemicznej i biotechnologii, ponieważ te mikrosystemy zapewniają lepszą kontrolę procesu, a także wiele innych zalet w porównaniu z ich analogami makrosystemów. Monitorowanie i kontrolowanie parametrów w zminiaturyzowanym systemie jest trudnym zadaniem, ponieważ rozmiary czujnika do pomiaru, na przykład pH i_O2, również muszą zostać zminimalizowane. Skuteczna produkcja mikroreaktorów dla systemów biologicznych wymaga różnego rodzaju narzędzi analitycznych do monitorowania procesów. W związku z tym rozwój inteligentnych mikroczujników odgrywa znaczącą rolę w przeprowadzaniu procesów biologicznych w mikroreaktorach.

Ostatnio podjęto kilka prób opracowania inteligentnych czujników pH wykorzystujących chemiooporne materiały pomiarowe, takie jak nanorurki węglowe i polimery przewodzące¹. Te czujniki chemiorezystancyjne nie wymagają elektrody referencyjnej i można je łatwo zintegrować z obwodami elektronicznymi. Skuteczne czujniki chemiorezystancyjne umożliwiają produkcję inteligentnych czujników, które są ekonomiczne i łatwe w produkcji, wymagają niewielkiej objętości do testowania i są nieinwazyjne.

Tutaj przedstawiamy metodę opracowania elektrody z funkcjonalizowanego polianiliną, elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu. Elektroda chemiorezystancyjna działa jako czujnik pH podczas fermentacji L. laktis. L. lactis jest bakterią wytwarzającą kwas mlekowy, stosowaną w procesach fermentacji żywności i konserwacji żywności. Podczas fermentacji produkcja kwasu mlekowego obniża pH, a bakteria przestaje rosnąć przy niskim pH^2,3,4.

Medium fermentacyjne to złożone środowisko chemiczne, które zawiera peptydy, sole i cząsteczki redoks, które mają tendencję do zakłócania powierzchni czujnika5^,6,7,8,9. Badanie to pokazuje, że czujnik pH oparty na materiale chemiorezystancyjnym z odpowiednią warstwą ochronną powierzchni może być używany do pomiaru pH w tego rodzaju złożonych pożywkach fermentacyjnych. W tym badaniu z powodzeniem wykorzystujemy Nafion jako warstwę ochronną dla powlekanego polianiliną, elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu do pomiaru pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji L. laktis.

Protokół

1. Przygotowanie tlenku grafitu

UWAGA: Tlenek grafitu jest przygotowywany zgodnie z metodą Hummersa^10,11.

1. Dodać 3 g grafitu do 69 ml stężonego_H2SO4 i mieszać roztwór, aż grafit całkowicie się rozproszy. Dodać 1,5 g azotynu sodu i odstawić na 1 godzinę, mieszając. Następnie umieść pojemnik w łaźni lodowej.
2. Dodać 9 g nadmanganianu potasu do dyspersji i wyjąć pojemnik z łaźni lodowej. Pozwól, aby roztwór rozgrzał się do temperatury pokojowej.
3. Najpierw dodaj kroplami 138 ml wody destylowanej. Następnie kontynuuj dodawanie 420 ml wody destylowanej. Utrzymuj temperaturę 90 °C przez 15 minut za pomocą płyty grzejnej. Dodaj 7,5 ml 30% nadtlenku wodoru do dyspersji.
4. Zebrać produkt przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 20 minut i wyrzucić roztwór sklarowanego osadu. Umyj granulat 4x ciepłą wodą podwójnie destylowaną i 2x 10% roztworem HCl (v/v). Na koniec umyj go 2x etanolem i wysusz w temperaturze 50 °C w piekarniku.

2. Przygotowanie elektrody zdeponowanej GO

1. Rozpuścić 10 mg tlenku grafitu w 10 ml wody, a następnie poddać go sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 6 godzin.
2. Usunąć niezłuszczone płatki tlenku grafitu przez odwirowywanie przez 30 minut przy 2 700 x g. Po odwirowaniu wyrzucić cząstki stałe i użyć supernatantu do dalszych doświadczeń.
   UWAGA: Użyliśmy tej złuszczonej dyspersji płatków GO jako roztworu podstawowego.
3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy GO dwukrotnie. Zawsze należy przygotowywać świeży roztwór roboczy GO z roztworu podstawowego.
4. Dodać 2 μl roztworu roboczego GO na odsłoniętą międzypalcową złotą elektrodę (Rysunek 1A i Rysunek 2). Po odlaniu kroplowym suszyć elektrodę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Jest to elektroda osadzona metodą GO.

3. Redukcja GO do elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu

1. Włóż elektrodę do uchwytu elektrody z polidimetylosiloksanu (PDMS) (dolna część). Umieść drugą część uchwytu elektrody, która służy jako zbiornik roztworu, na górze elektrody, jak pokazano na Rysunek 1A - 1C. Zmontuj uchwyty, spinając ze sobą dwie części za pomocą dwóch spinaczy do papieru. Upewnij się, że uchwyt PDMS nie zakrywa części elektrody zdeponowanej przez GO.
2. Odmierzyć pipetą 300 μl 0,2 M buforu fosforanowego (pH 7) do zbiornika. Następnie umieść elektrodę odniesienia i przeciwelektrodę w roztworze w taki sposób, aby elektrody były umieszczone blisko powierzchni folii GO, jak pokazano na Rysunek 1C. Układ ten służy jako ogniwo elektrochemiczne do przeprowadzania elektrochemicznej redukcji GO i osadzania polianiliny.
3. Połącz elektrody z potencjostatem podłączonym do komputera w celu akwizycji danych. Do redukcji elektrochemicznej należy użyć woltamperometrii cyklicznej: wybierz od 0 do -1,2 V jako zakres potencjału i 50 mV/s jako szybkość skanowania. Przełączaj napięcie na elektrodzie w zakresie od 0 do -1,2 V 10x (Rysunek 3).
4. Po eksperymencie wyjmij elektrodę z uchwytu i kilkakrotnie umyj ją wodą podwójnie destylowaną. Następnie suszyć elektrodę w piecu w temperaturze 101 °C przez 12 godzin.
5. Gdy elektroda wyschnie, wyjmij ją z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie zmierz przewodność elektrody za pomocą multimetru. Elektroda jest obecnie określana jako elektrochemicznie zredukowana elektroda tlenku grafenu (ERGO).

4. Funkcjonalizacja polianiliny elektrody ERGO

1. Przygotować 10 mM monomeru aniliny do funkcjonalizacji polianiliny. Rozpuścić 5 μl 10 mM aniliny w 5 ml 1 M H₂SO₄.
2. W celu funkcjonalizacji polianiliny dodać 300 μl monomeru aniliny do zbiornika roztworu. Umieść elektrodę osadzoną ERGO w uchwycie elektrody zgodnie z opisem w procedurze redukcji GO.
3. Użyj woltamperometrii cyklicznej do elektropolimeryzacji aniliny w celu funkcjonalizacji ERGO w polianilinę ERGA (ERGO-PA): wybierz od 0 do 0,9 V jako zakres potencjału i 50 mV/s jako szybkość skanowania. Przełączaj napięcie na elektrodzie w zakresie od 0 do 0,9 V przez 50x (Rysunek 4).
4. Po osadzeniu polianiliny wyjmij elektrodę i kilkakrotnie przemyj ją wodą podwójnie destylowaną. Następnie wysuszyć elektrodę w temperaturze 80 °C w piekarniku przez 12 godzin.
5. Wyjmij elektrodę z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej przed pomiarem przewodności elektrody za pomocą multimetru.
6. Przygotować roztwór buforowy o pH 5, dodając 0,2 M NaOH do roztworu buforowego Brittona-Robinsona do uzyskania pH 5 (patrz krok 5.1). Trzymaj elektrodę w buforze o pH 5 przez 24 godziny.
   1. Aby przygotować uniwersalny roztwór buforowy Brittona-Robinsona, wymieszaj 0,04 mola kwasu fosforowego, 0,04 mola kwasu octowego i 0,04 mola kwasu borowego w 0,8 l ultraczystej wody. Dodawać kroplami 0,2 M wodorotlenku sodu do roztworu buforowego, aż do osiągnięcia pożądanego pH⁴. Dodaj ultraczystą wodę, aż ostateczna objętość wyniesie 1 l.

5. Testowanie elektrod ERGO-PA przy różnych pH (wstępna kalibracja przed nałożeniem powłoki Nafion)

1. Po kondycjonowaniu elektrody w roztworze buforowym o pH 5, zmierz rezystancję elektrody w roztworach o innym pH (od pH 4 do pH 9; patrz Rysunek 5).
   1. W celu wykonania tego pomiaru zanurz elektrodę bezpośrednio w roztworze buforowym i podłącz drugą część elektrody do sterowanego komputerowo potencjostatu w celu uzyskania danych. Zmienić pH, miareczkując 0,2 M NaOH.
   2. Z listy technik należy wybrać chronopotencjometrię lub amperometrię i zastosować do elektrody różnicę potencjałów 100 mV.
      UWAGA: Potencjostat mierzy prąd w funkcji czasu. Oprogramowanie sterujące potencjostatem zapewnia graficzne odwzorowanie prądu w funkcji czasu.
   3. Użyj prawa Ohma (rezystancja równa się napięciu podzielonemu przez prąd), aby obliczyć wartość rezystancji na podstawie zmierzonego prądu i przyłożonego napięcia.
2. Po pomiarach suszyć elektrodę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.

6. Przygotowanie elektrody ERGO-PA pokrytej nafionem

1. Dodać 5 μl 5% wag. Nafionu na elektrodę ERGO-PA i suszyć elektrodę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.
2. Po nałożeniu powłoki Nafion należy trzymać elektrodę w roztworze buforowym o pH 5 przez 24 godziny przed pomiarem pH.
3. Po kondycjonowaniu w pH 5 wyjmij elektrodę ERGO-PA pokrytą nafionem (ERGO-PA-NA) i zmierz rezystancję elektrody od pH 4 do pH 9, jak wspomniano w sekcji 5.1 (Rysunek 6).

7. Przygotowanie pożywki hodowlanej L. lactis

1. Dodaj 9,3 g proszku M17 do 250 ml ultraczystej wody. Powoli mieszać roztwór, aż proszek całkowicie się rozpuści. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
2. Wziąć wysterylizowaną kolbę o pojemności 250 ml z mieszadłem magnetycznym i dodać 50 ml wysterylizowanej pożywki M17 do kolby. Następnie dodać 8 ml autoklawizowanego 1 M roztworu glukozy. Zaszczepić roztwór 10 μl kultury L. lactis, uprzednio wyhodowanej w tej samej pożywce hodowlanej.
   UWAGA: Szczep bakteryjny został uzyskany od Jana Koka, genetyki molekularnej, Uniwersytetu w Groningen.
3. Umieścić kolbę z zaszczepioną pożywką hodowlaną na 18 godzin na mieszadle magnetycznym w piecu inkubacyjnym w temperaturze 30 °C, mieszając i monitorując pH.

8. Testowanie reakcji pH ERGO-PA-NA w eksperymencie fermentacji L. lactis

1. Umieść elektrodę ERGO-PA-NA w kulturze L. lactis i zamknij ją bawełnianym zatyczką. Następnie umieść zestaw w termostacie w temperaturze 30 °C, aby wyhodować L. lactis.
2. Przyłóż 100 mV do elektrody i zmierz prąd w funkcji czasu.
3. Pobrać próbki o pojemności 0,5 ml w różnych punktach czasowych (patrz na przykład Rysunek 7), aby zmierzyć off-line gęstość optyczną przy 600 nm i pH za pomocą konwencjonalnej elektrody szklanej. Kontynuuj pomiary, aż gęstość optyczna kultury stanie się stała, co wskaże, że bakterie już się nie rozwijają.

Wyniki

Pojawienie się silnego piku redukcji w okolicach -1,0 V (Rycina 3) ilustrowało redukcję GO do ERGO^12,13,14,22. Intensywność piku zależy od liczby warstw GO na elektrodzie. Gruba czarna warstwa całkowicie pokryła złote druty na elektrodzie. W tym momencie dwie izolowane elektrody złote stały się przewodzące, ponieważ GO połączyło oba...

Dyskusja

Istotne jest, aby warstwy GO całkowicie zakrywały złote druty elektrody po osadzeniu GO. Jeśli złote elektrody nie są pokryte GO, polianilina będzie osadzać się nie tylko na ERGO, ale także bezpośrednio na widocznych drutach złotych elektrod. Osadzanie się polianiliny na drutach elektrody złotej może mieć wpływ na działanie elektrody. Po redukcji GO do ERGO, elektroda jest suszona w temperaturze 100 °C w celu wzmocnienia wiązania między warstwą ERGO a drutami elektrody złotej. Rezystancja każdej elektrody różni się w zal...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płatki grafitowe	Sigma Aldrich
Kwas siarkowy (H2SO4)	Merck
Azotyn sodu (NaNO2)	Sigma Aldrich
Nadmanganian potasu (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	Merck
Anilina	Sigma Aldrich
5wt % Nafion	Sigma Aldrich
M17 w proszku	BD Difco
Kwas fosforowy (H3PO4)	Kwas borowy Sigma Aldrich
(HBO3)	Kwas octowy Merck
	Merck
Wodorotlenek sodu	Sigma Aldrich
Diwodorofosforan potasu	Sigma Aldrich
Dipostassium wodorofosforan	Sigma Aldrich
Au Elektrody międzypalcowe	Technologia BVT - CC1 W1
Potencjostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)