Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podostre mikrokrwotoki mózgowe wywołane wstrzyknięciem lipopolisacharydu u szczurów

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58423

⸱

17 października 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do indukowania i wykrywania CMH spowodowanych wstrzyknięciem LPS u szczurów Sprague-Dawley, który może być wykorzystany w przyszłych badaniach nad patogenezą CMH.

Streszczenie

Mikrokrwotoki mózgowe (CMH) są powszechne u starszych pacjentów i są skorelowane z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi. Etiologia CMH jest złożona, a zapalenie układu nerwowego jest często obserwowane jako współwystępowanie. W tym miejscu opisujemy podostry model szczurzy CMH indukowany przez wstrzyknięcie lipopolisacharydu (LPS), a także metodę wykrywania CMH. Systemowe wstrzyknięcie LPS jest stosunkowo proste, ekonomiczne i opłacalne. Jedną z głównych zalet iniekcji LPS jest jego stabilność w wywoływaniu stanu zapalnego. CMH spowodowane wstrzyknięciem LPS można wykryć za pomocą obserwacji ogólnej, barwienia hematoksyliną i eozyną (HE), barwienia pruskiego Perla, podwójnego znakowania błękitem Evansa (EB) i technologii obrazowania ważonego podatnością rezonansu magnetycznego (MRI-SWI). Wreszcie, w niniejszym raporcie omówiono również inne metody opracowywania modeli zwierzęcych CMH, w tym ich zalety i/lub wady.

Wprowadzenie

Klasyczne mikrokrwotoki mózgowe (CMHs) odnoszą się do maleńkich okołonaczyniowych złogów produktów degradacji krwi, takich jak hemozyderyna z czerwonych krwinek w mózgu1. Według Rotterdam Scan Study, CMH można znaleźć u prawie 17,8% osób w wieku 60-69 lat i 38,3% u osób powyżej 80 roku życia2. Częstość występowania CMH u osób starszych jest stosunkowo wysoka i ustalono korelację między akumulacją CMH a dysfunkcją poznawczą i neuropsychiatryczną3,4. Ostatnio opisano kilka modeli zwierzęcych CMH, w tym modele gryzoni wywołane przez stereotaktyczne wstrzyknięcie kolagenazy typu IV5, APP transgenic6, β-N-metyloamino-L-alanina exposure7, oraz hypertension8, z CMH wywołanymi ogólnoustrojowym zapaleniem jako jednym z najbardziej akceptowanych wyborów. Fisher i wsp.9 po raz pierwszy użył LPS pochodzącego z Salmonella typhimurium do opracowania mysiego modelu ostrego CMHs. Następnie ta sama grupa zgłosiła rozwój podostrego modelu myszy CMHs przy użyciu tego samego podejścia2.

LPS jest uważany za standaryzowany bodziec zapalny poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Wcześniejsze badania potwierdziły, że wstrzyknięcie LPS może powodować zapalenie nerwów, co znajduje odzwierciedlenie w dużych ilościach aktywacji mikrogleju i astrocytów w modelach zwierzęcych2,10. Ponadto ustalono dodatnią korelację między aktywacją aktywacji zapalenia układu nerwowego a liczbą CMHs2,10. Opierając się na tych wcześniejszych badaniach, zostaliśmy skłonieni do opracowania szczurzego modelu CMH poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie LPS.

Postęp w technologiach wykrywania spowodował wzrost liczby badań nad CMH. Do najbardziej uznanych metod wykrywania CMH należą: wykrywanie czerwonych krwinek za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (HE), wykrywanie żelaza żelazowego za pomocą barwienia błękitem pruskim9, wykrywanie osadzania się błękitu Evansa (EB) za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego oraz obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego o napięciu ważonym podatnością 7,0 Tesli (MRI-SWI)10. Niniejsze badanie ma na celu opracowanie metody badań przesiewowych w kierunku CMH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (ACUC) Szpitala Ogólnego Armii ChALW.

1. Materiały

  1. Przygotowanie iniekcji LPS
    1. Dodać 25 ml wody destylowanej do 25 mg proszku LPS pochodzącego z S. typhimurium do końcowego stężenia 1 mg/ml. Wstrzyknięcie należy przechowywać w sterylnej probówce o temperaturze 4 °C.
      UWAGA: LPS jest toksyczny.
    2. Przygotować 2% roztwór EB w normalnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej, aby utrzymać wstrzyknięcie EB w stężeniu roboczym.

2. Zwierzęta

  1. Podawać LPS samcom szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 10 tygodni (średnia waga: 280 ± 20 g) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
    UWAGA: Jeśli szczury są kupowane od innej organizacji, faza adaptacyjna nie powinna być krótsza niż 7 dni.

3. Zastrzyki LPS

  1. Każdemu szczurowi należy wstrzyknąć LPS dootrzewnowo w dawce 1 mg/kg mc. i umieścić szczury z powrotem w klatce domowej.
    UWAGA: Znieczulenie nie jest konieczne.
  2. Sześć godzin później wstrzyknij szczurom tę samą dawkę zastrzyku LPS.
  3. Szesnaście godzin później wstrzyknij szczurom tę samą dawkę LPS.
    UWAGA: Wstrzykiwanie szczurom SD LPS w dawce 1 mg/kg mc. może spowodować 5% śmiertelność. Śmiertelność może jeszcze bardziej wzrosnąć u młodszych lub starszych szczurów lub ciężarnych samic szczurów.
  4. Po wstrzyknięciu LPS szczury należy umieścić z powrotem w klatkach i zapewnić im dostęp do jedzenia i picia ad libitum.
    UWAGA: Szczury będą wykazywać wyraźną ogólnoustrojową reakcję zapalną, dlatego ważne jest, aby klatki pozostały czyste przez cały czas trwania eksperymentu. Szczury powinny często (2x dziennie) monitorować wagę, ogólny wygląd i nastawienie po pierwszym wstrzyknięciu LPS. Jeśli szczury zaczną wykazywać zgarbioną postawę, niechęć do poruszania się, znaczną utratę masy ciała (>20%), porfiryna plami, że zostaną humanitarnie poddane eutanazji przed 7-dniowym punktem końcowym badania EB.

4. Pobieranie próbek

  1. Iniekcja EB
    1. Siedem dni po pierwszym wstrzyknięciu należy znieczulić szczura dootrzewnowo zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC.
    2. Odczekaj 1-2 minuty, aż szczury nie będą wykazywać odruchów rogówkowych. Wykonaj nakłucie serca o głębokości 5–8 mm u każdego szczura; Punkt nakłucia powinien znajdować się 5 mm do lewego brzegu mostka w 3. i 4. przestrzeni międzyżebrowej.
    3. Poczekaj, aż zaobserwuje się regenerację krwi, a następnie wstrzyknąć EB w dawce 0,2 ml/100 g masy ciała do lewej komory serca.
      UWAGA: Nakłucie serca i wstrzyknięcie EB należy wykonać ostrożnie. EB może być wstrzykiwany do klatki piersiowej lub osierdzia zamiast do lewej komory serca.
      1. Odessać z powrotem pustą rurkę i zastąpić tę objętość rurką EB przed wstrzyknięciem, aby zmniejszyć wskaźnik niepowodzeń (np. błędne wstrzyknięcie do klatki piersiowej
        2. ).
    4. Trzymaj szczura w pozycji leżącej na plecach przez 10 min.
      UWAGA: Jeśli próbka nie jest używana do wykrywania wycieku EB w obrazowaniu immunofluorescencyjnym, ten krok można pominąć.
  2. Obserwacja ogólna
    1. Wykonaj perfuzje serca za pomocą lodowatego 1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS), aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu i mózg.
      1. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie brzucha na całej długości przepony.
      2. Przetnij żebra po lewej stronie linii środkowej klatki piersiowej
        3. .
      3. Otwórz klatkę piersiową. Użyj zacisków, aby odsłonić serce i ułatwić drenaż krwi i innych płynów.
      4. Trzymając stabilnie serce kleszczami (serce powinno nadal bić), bezpośrednio wbij igłę w występ lewej komory, aby przedłużyć go do około 5 mm. Zabezpiecz igłę w tej pozycji, zaciskając w pobliżu miejsca wprowadzenia.
        UWAGA: Nie należy nadmiernie wysuwać igły, ponieważ może ona przebić ścianę wewnętrzną i utrudnić krążenie roztworów.
      5. Zwolnij zawór, aby umożliwić przepływ lodowatego roztworu PBS (200–300 ml) z powolną i stałą szybkością około 20 ml/min za pomocą pompy perfuzyjnej. Jeśli zwierzęta wymagają fiksacji zamiast ogólnej obserwacji, należy użyć tej samej dawki lodowatego 0,9% roztworu soli fizjologicznej.
      6. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj nacięcie w przedsionku, upewniając się, że roztwór stale płynie. Jeśli płyn nie przepływa swobodnie lub wypływa z nozdrzy lub pyska zwierzęcia, zmień położenie igły.
    2. Badanie przesiewowe CMH według obserwacji brutto.
      UWAGA: Jeżeli próbka nie jest używana do obliczania liczby CMH na podstawie obserwacji brutto, etap ten można pominąć.
  3. Utrwalenie
    1. Wykonaj perfuzje serca przy użyciu lodowatego 0,9% roztworu soli fizjologicznej (200-300 ml), aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu i mózgu.
    2. Wykonaj perfuzje serca przy użyciu lodowatego 4% paraformaldehydu do utrwalenia.
    3. Odetnij głowę szczurowi, odizoluj mózg i zanurz mózg w 20% roztworze sacharozy na co najmniej 6 godzin.
    4. Zmień roztwór na 30% sacharozy i utrwalaj na kolejne 6 godzin.
  4. Przygotuj skrawki tkanek mózgowych o grubości 10 mm za pomocą kriostatu.

5. Barwienie HE

UWAGA: Ta procedura jest wykonywana przy użyciu zestawu do barwienia HE.

  1. Umyj szkiełka w wodzie destylowanej.
  2. Barwieć w roztworze hematoksyliny przez 8 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
  3. Różnicować w 1% kwaśnym alkoholu przez 30 s. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 1 min.
  4. Plamić w 0,2% wodzie amoniakalnej (niebieszczenie) lub nasyconym roztworze węglanu litu przez 30 s do 1 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
  5. Spłucz w 95% alkoholu (10 zanurzeń).
  6. Barwienie przeciwstawne roztworem eozyny przez 30 s do 1 minuty.
  7. Odwodnić przez 95% alkohol, dwie zmiany alkoholu bezwodnego, przez 5 minut każda.
  8. Klarować w ksylenie przez 30 s.
  9. Zamontuj za pomocą metody Liu9.
  10. Analiza za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jasnego pola.
    UWAGA: Czerwone krwinki uwalniane z naczyń krwionośnych, które są składnikami CMH, pojawiają się na czerwono-pomarańczowo pod barwieniem HE.

6. Perl Pruski niebieski kolor

UWAGA: Ta procedura jest wykonywana przy użyciu zestawu do barwienia Perls.

  1. Umyj szkiełka wodą destylowaną.
  2. Barwienie w roztworze reakcyjnym równą mieszaniną żelazocyjanku i kwasu solnego przez 10 min.
  3. Odwodnić, wyczyścić, zamontować i przeanalizować szkiełka zgodnie z opisem w krokach 5.7–5.10.

7. Podwójne barwienie EB

UWAGA: Ta procedura jest zgodna z krokiem 4.1.3.

  1. Umyj szkiełka PBS trzy razy po 5 minut każda.
  2. Inkubować szkiełka z roztworem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj szkiełka roztworem PBS trzy razy po 5 minut każde, a następnie zamontuj szkiełka roztworem PBS-glicerolu.
  4. Analizuj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym. Osadzanie się EB jest wskazywane przez czerwoną fluorescencję; Jądra są oznaczone niebieską fluorescencją.

8. Rezonans magnetyczny (MRI-SWI)

  1. Wykonaj rezonans magnetyczny na magnesie 7-T wyposażonym w aktywnie ekranowany system gradientowy (średnica wewnętrzna 16 cm).
  2. Siedem dni po zabiegu znieczulij szczury poprzez inhalację 1,5–2,0% izofluranu za pomocą systemu znieczulenia izofluranem.
  3. Nałóż maść weterynaryjną na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  4. Utrzymuj szczury w pozycji leżącej i wykonaj skan MRI-SWI.
  5. Uzyskaj skany ważone SWI przy użyciu sekwencji echa o szybkim wirowaniu, używając następujących parametrów: czas echa (TE) 8 ms, czas powtarzania (TR) 40 ms, kąt odwrócenia = 12°, pole widzenia (FOV) 35 mm × 35 mm, matryca akwizycji 384 × 384, aby uzyskać warstwy o grubości 1 mm.
  6. Zidentyfikuj CMH w MRI-SWI według Greenberga i wsp.11, który zawierał następujące kryteria: (1) średnica ≤10 mm oraz (2) okrągłe, izolowane i o niskiej intensywności sygnału.
  7. Pod koniec eksperymentu należy poddać szczury eutanazji metodą przedawkowania dwutlenku węgla (przy przepływie 6 l/min lub 30% objętości pojemnika).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mikrowylewy mózgowe (CMHs) można wykrywać za pomocą różnych podejść. Do najszerzej akceptowanych metod należą: (1) obserwacja makroskopowa i ocena powierzchniowych CMHs (pokazane na Rysunku 1, panel górny); (2) barwienie HE w celu wykrycia erytrocytów (pokazane na Rysunku 2A, panel górny) lub barwienie pruskie wykrywające żelazo trójwartościowe pochodzące z lizy erytrocytów (Rysunku 2A, panel dolny);...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ciągu ostatnich kilku lat nasiliły się badania naukowe nad CMH. Jednak mechanizm CMH pozostaje niejasny, co skłoniło naukowców do stworzenia modeli zwierzęcych, które symulują ten konkretny stan. Na przykład Hoffmann i wsp. opracowano mysi model CMH wywołany niedotlenieniem, który pokazuje, że CMH są spowodowane niedotlenieniem i zakłóceniem autoregulacji naczyń mózgowych12. Reuter i wsp.5 ustanowiło model CMHs u myszy transgenicznych APP23, który wykaza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy nauczycielowi Jian Feng Lei i kolegom ze Stołecznego Uniwersytetu Medycznego za wskazówki podczas rezonansu magnetycznego. Dziękujemy również Jing Zeng z Oddziału Neurologii Drugiego Szpitala Ludowego w Yichang za udzielenie wsparcia technicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LPSSigma-AldrichL-2630do indukcji stanu zapalnego
EBSigma-aldrichE2129do wykrywania wycieków EB
Roztwór do barwienia DAPIPożywka zliczającaServicbioG1012
Perl' s Barwienie pruskieSolarbioG1424Zestaw do barwienia pruskiego
Barwienie HESolarbioG1120Zestaw do barwienia HE
hydrat chloraluSigma-Aldrich47335UDo znieczulenia
bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)SolarbioP1022rodzaj roztworu buforowego powszechnie stosowanego w eksperymencie
0,9% roztworusoli fizjologicznejHainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., Chinyroztwór do perfuzji
paraformaldehyduSigma-Aldrich158127rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania
20% roztworu sacharozySolarbioG2461rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania
30% roztworu sacharozySolarbioG2460rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania
maść weterynaryjnaSolcoseryl żel pod oczy, Bacel, Szwajcariado ochrony oczu szczurów
dla IF

Bibliografia

  1. Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).
  2. Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
  3. Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
  4. Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
  5. Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
  6. Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).
  7. Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22(2018).
  8. Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
  9. Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
  10. Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
  11. Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
  12. Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441(2016).
  13. Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).
  14. Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).
  15. Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
  16. Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
  17. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  18. El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
  19. Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
  20. Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
  21. Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
  22. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  23. Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822(2017).
  24. Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Barwienie b kitem Evansabarwienie hematoksylin i eozynbarwienie b kitem pruskimobrazowanie metod rezonansu magnetycznegoobrazowanie wa one podatno ciperfuzja sercasekcjonowanie tkanki m zgowejmikroskopia fluorescencyjna
Podostre mikrokrwotoki mózgowe wywołane wstrzyknięciem lipopolisacharydu u szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.