Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58429

⸱

18 października 2018

 , 
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy 3 modele uszkodzeń dorosłego danio pręgowanego i ich łączne stosowanie z leczeniem lekami immunosupresyjnymi. Udzielamy wskazówek w zakresie obrazowania regenerujących się tkanek oraz wykrywania w nich mineralizacji kości.

Streszczenie

Danio pręgowany jest w stanie zregenerować różne organy, w tym przydatki (płetwy) po amputacji. Wiąże się to z regeneracją kości, która odrasta w ciągu około dwóch tygodni po urazie. Co więcej, danio pręgowany jest w stanie szybko leczyć kości po trepanacji czaszki i naprawiać złamania, które można łatwo wprowadzić do promieni płetwy kostnej danio pręgowanego. Te testy urazów reprezentują wykonalne paradygmaty eksperymentalne do testowania wpływu podawanych leków na szybko tworzącą się kość. W tym miejscu opisujemy zastosowanie tych 3 modeli urazów i ich łączne stosowanie z ogólnoustrojowym leczeniem glikokortykosteroidami, które wywiera działanie hamujące i immunosupresyjne kości. Przedstawiamy przebieg pracy dotyczący przygotowania do leczenia immunosupresyjnego u dorosłych danio pręgowanego, ilustrujemy, jak wykonywać amputację płetwy, trepanację kości łybkowych i złamania płetw oraz opisujemy, w jaki sposób stosowanie glikokortykosteroidów wpływa zarówno na osteoblasty kościotwórcze, jak i komórki linii monocytów / makrofagów w ramach odporności wrodzonej w tkance kostnej.

Wprowadzenie

Danio pręgowany reprezentuje potężny model zwierzęcy do badania rozwoju i chorób kręgowców. Wynika to z faktu, że są to małe zwierzęta, które bardzo dobrze się rozmnażają, a ich genom jest w pełni zsekwencjonowany i podatny na manipulacje1. Inne zalety to możliwość wykonywania ciągłych badań obrazowych na żywo na różnych etapach, w tym obrazowania in vivo dorosłych ryb danio pręgowanego2, oraz możliwość wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na larwach danio pręgowanego3. Ponadto danio pręgowany posiada wysoką zdolność regeneracyjną w różnych narządach i tkankach, w tym kościach, a tym samym służy jako użyteczny system do badania chorób szkieletowych i naprawy4,5.

Osteoporoza wywołana glukokortykosteroidami (GIO) jest chorobą, która wynika z długotrwałego leczenia glikokortykosteroidami, na przykład w trakcie leczenia chorób autoimmunologicznych, takich jak astma czy reumatoidalne zapalenie stawów. GIO rozwija się u około 30% pacjentów leczonych glikokortykosteroidami i stanowi poważny problem zdrowotny6; Dlatego ważne jest, aby bardzo szczegółowo zbadać wpływ immunosupresji na tkankę kostną. W ostatnich latach opracowano szereg modeli danio pręgowanego zajmujących się patogenezą GIO. Na przykład u larw danio pręgowanego wywołano utratę masy kostnej za pośrednictwem glukokortykosteroidów, co doprowadziło do identyfikacji związków przeciwdziałających zwiększających masę kostną w badaniu przesiewowym leków7. Co więcej, efekty hamowania kości wywołane glikokortykosteroidami zostały naśladowane w łuskach danio pręgowanego zarówno in vitro, jak i in vivo8,9. Testy te są bardzo przekonującym podejściem, zwłaszcza jeśli chodzi o identyfikację nowych leków immunosupresyjnych i anabolicznych na kości. Jednak tylko częściowo uwzględniają one endoszkielet i nie zostały przeprowadzone w kontekście regeneracyjnym. W związku z tym nie pozwalają na badanie efektów za pośrednictwem glikokortykosteroidów podczas szybkich trybów tworzenia się dorosłej, regeneracyjnej kości.

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający badaczom badanie wpływu glukokortykosteroidów na kości dorosłego danio pręgowanego poddawanego regeneracji. Modele urazów obejmują częściową amputację płetwy ogonowej danio pręgowanego, trepanację czaszki, a także tworzenie złamań promienia płetwy (Rysunek 1A-1C) i są połączone z ekspozycją na glikokortykosteroidy poprzez inkubację ( Figura 1E). Ostatnio wykorzystaliśmy fragment tego protokołu do opisania konsekwencji ekspozycji na prednizolon, jeden z powszechnie przepisywanych leków kortykosteroidowych, na dorosłe rybyki pręgowane regenerujące płetwy i kości czaszki10. U danio pręgowanego podawanie prednizolonu prowadzi do zmniejszonej proliferacji osteoblastów, niepełnego różnicowania osteoblastów i szybkiej indukcji apoptozy w linii monocytów/makrofagów10. W tym protokole opisujemy również, w jaki sposób złamania mogą być wprowadzane do pojedynczych segmentów promienia płetwy kostnej11, ponieważ takie podejście może być przydatne podczas badania wpływu glikokortykosteroidów na kość występującego podczas naprawy złamań. Przedstawione tu metody pomogą w dalszym badaniu mechanizmów leżących u podstaw działania glikokortykosteroidów w szybko regenerujących się kościach i mogą być również stosowane w innych sytuacjach ogólnoustrojowego podawania leków w kontekście regeneracji tkanek danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Landesdirektion Dresden (numery zezwoleń: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1- 5131/354/87).

1. Przygotowanie materiałów i rozwiązań

UWAGA: Prednizolon, podobnie jak inne glikokortykosteroidy, prowadzi do immunosupresji. W związku z tym należy podjąć środki ostrożności w celu zapobieżenia zakażeniu u leczonych zwierząt podczas doświadczenia. W tym celu przed rozpoczęciem eksperymentu należy przelać w autoklawie szklane naczynia i "wodę dla ryb" (tj. wodę używaną do hodowli dorosłego danio pręgowanego).

  1. Oblicz liczbę danio pręgowanego, która zostanie użyta w doświadczeniu. Pamiętaj, aby uwzględnić osoby, które służą jako kontrole.
  2. Autoklaw Szklane zlewki o pojemności 600 ml, które są pokryte folią aluminiową z taśmą autoklawową. Danio pręgowany będzie traktowany indywidualnie, dlatego na danio pręgowanego wymagana jest 1 szklana zlewka.
  3. Oblicz ilość wody dla ryb potrzebną do eksperymentu. Wymagane jest 300 ml na osobę dziennie. Weź pod uwagę czas trwania eksperymentu (np. 1 tydzień/7 dni).
  4. Napełnij szklane butelki wodą rybną, zamknij je i autoklaw butelek taśmą autoklawową. Najlepiej używać butelek o pojemności 2 litrów, ale można również użyć innych butelek, takich jak 1 l lub 5 l.
    UWAGA: Jeśli eksperymenty są długie (np. 4 tygodnie/28 dni), a ilość szklanych butelek jest ograniczona, upewnij się, że przygotowujesz butelki przez co najmniej kilka dni na raz i powtarzaj proces (1,3 do 1,4) przez cały czas trwania eksperymentu.
  5. Przygotować roztwór podstawowy prednizolonu sterylnie przefiltrowanego 100 mM prednizolonu w dimetylosulfotlenku (DMSO). Zamrozić wywar w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1 ml lub 2 ml podwielokrotności.
    UWAGA: Podczas pracy z prednizolonem należy zawsze nosić odzież ochronną (rękawice ochronne, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny).
  6. W pierwszym dniu eksperymentu przygotuj roztwory inkubacyjne odpowiednio z prednizolonem i DMSO. W tym celu rozmrozić wymaganą ilość 100 mM roztworu podstawowego prednizolonu i dodać prednizolon do autoklawowanej wody dla ryb w końcowym stężeniu 50 μM.
    1. W przypadku zabiegów kontrolnych dodać odpowiednią objętość DMSO do autoklawowanej wody dla ryb. Na przykład, aby wyprodukować 2 litry prednizolonu zawierającego wodę dla ryb, dodaj 1 ml 100 ml prednizolonu do 2 l wody dla ryb. Do kolejnej 2-litrowej butelki wody rybnej dodaj odpowiednio 1 ml DMSO.
    2. Pracuj w odpowiednim miejscu, które jest przeznaczone do wykonywania zabiegów odwykowych, najlepiej w pomieszczeniu o temperaturze 27 °C.

2. Generowanie urazów u płetw zebry danio pręgowanego

UWAGA: Aby zranić kość w płetwach danio pręgowanego, wykonaj resekcję płetwy (amputacja, zwykle w płetwie ogonowej) lub złam poszczególne promienie płetwy kostnej (model złamania). W tym celu należy najpierw znieczulić dorosłego danio pręgowanego.

  1. amputacja
    1. Aby znieczulić dorosłego danio pręgowanego, należy przygotować szalkę Petriego o średnicy 100 mm zawierającą 0,02% MS-222 (metanosulfonian etylo-3-aminobenzoesanu) w wodzie dla ryb (woda ta nie musi być sterylizowana w autoklawie).
      1. Za pomocą sieci rybackiej należy przenieść jednego danio pręgowanego na raz do MS-222 zawierającego szalkę Petriego i inkubować go, aż położy się na boku bez ruchu i nie będzie reagował na dotyk. Przetestuj to ostatnie, dotykając płetwy odbytowej kleszczami.
      2. Poczekaj, aż osiągnięty zostanie 4 poziom znieczulenia, który jest odpowiednim poziomem do resekcji płetwy12. Na tym etapie szybkość ruchu operkularnego jest zmniejszona, napięcie mięśniowe zostaje utracone, a ryba nie porusza się po dotknięciu12.
    2. Weź kleszcze i ostrożnie przenieś znieczulonego danio pręgowanego na odwróconą pokrywę 100-milimetrowej szalki Petriego. Umieść danio pręgowanego na bocznej stronie. Upewnij się, że danio pręgowany zawsze leży w tej samej orientacji, na przykład na prawym boku ciała. Za pomocą skalpela lub żyletki odetnij 50% płetwy (Rysunek 1A, 2A).
      UWAGA: Szybkość regeneracji płetwy danio pręgowanego zależy od ilości wyciętej tkanki płetwy, tj. im więcej tkanek płetwy jest recinowanych, tym szybciej płetwa się regeneruje13. Dlatego, aby zminimalizować różnice w regeneracji płetwy, należy zawsze pamiętać o wycięciu płetwy na tym samym poziomie u wszystkich danio pręgowanych.
    3. Przenieś zranionego danio pręgowanego do autoklalawowanej szklanej zlewki zawierającej 300 ml prednizolonu lub DMSO zawierającej autoklawowaną wodę dla ryb. Przykryj szklaną zlewkę folią aluminiową, aby uniknąć ucieczki danio pręgowanego.
    4. Powtarzać kroki od 2.1.2 do 2.1.3 aż do osiągnięcia wymaganej liczby danio pręgowanego dla doświadczenia.
  2. Złamanie płetwy
    1. Przygotować pokrytą agarozą płytkę Petriego o średnicy 100 mm, podgrzewając 2% roztwór agarozy w wodzie dla ryb lub E3 (pożywka zarodkowa 3, 50 mM chlorku sodu, 0,17 mM chlorek potasu, 0,33 mM chlorek wapnia, 0,33 mM siarczan magnezu). Ostrożnie wlej około 10-15 ml roztworu na szalkę Petriego. Dno naczynia powinno być całkowicie przykryte. Niech agaroza stężeje.
    2. Znieczulenie danio pręgowanego należy przeprowadzić zgodnie z opisem w punkcie 2.1.
    3. Weź kleszcze i ostrożnie przenieś znieczulonego danio pręgowanego na pokrytą agarozą 100-milimetrową szalkę Petriego. Umieść danio pręgowanego na bocznej stronie. Pod mikroskopem preparacyjnym całkowicie rozłóż płetwę ogonową, aby móc zidentyfikować wyraźne promienie płetwy kostnej i segmenty promieni płetwy. Upewnij się, że danio pręgowany zawsze leży w tej samej orientacji, na przykład na prawym boku ciała.
    4. Za pomocą igły iniekcyjnej (0,3 mm x 13 mm) wprowadzić złamanie w środku segmentu promienia kostnej płetwy (Ryc. 1B). Aby to zrobić, igłę lekko wciska się w segment, aż pojawi się pęknięcie (strzałka w Rysunek 2B). Podczas gdy delikatny nacisk prowadzi do złamania tylko jednej z dwóch przeciwległych półkul, silniejszy nacisk doprowadzi do złamania obu segmentów półkuli.
      1. Nie wprowadzaj zbyt wielu złamań w płetwach, ponieważ znacznie pogorszy to stabilność płetwy. Jako sugestię, należy stosować złamania tylko w promieniach od 3 do 5 płetw.
      2. Zawsze wywołuj pęknięcia w odpowiednich segmentach w różnych promieniach płetwy i danio pręgowanego, na przykład w promieniach płetwy grzbietowej 3, 7 (lub 8) i promieniach płetwy brzusznej 3. Proksymalny i dystalny poziom złamania jest idealny w 3 segmentach proksymalnych do punktu rozwidlenia promieni płetwy 11.
    5. Przenieś zranionego danio pręgowanego do autoklalawowanej szklanej zlewki zawierającej 300 ml prednizolonu lub DMSO zawierającej autoklawowaną wodę dla ryb. Przykryj szklaną zlewkę folią aluminiową, aby uniknąć ucieczki danio pręgowanego.
    6. Powtarzać kroki od 2.2.2 do 2.2.5 aż do osiągnięcia wymaganej liczby danio pręgowanego do przeprowadzenia doświadczenia.

3. Generowanie urazów czaszki w obrębie kości kalwarycznej (trepanacja)

UWAGA: Kalwarie u danio pręgowanego są homologiczne do kości kalwarycznych u ssaków. Tak więc te kości egzoszkieletowe14 reprezentują tkankę szczególnie interesującą podczas badania patogenezy GIO. Aby zranić czaszkę, trepanację przeprowadza się poprzez wywiercenie otworu w Os frontale i/lub Os parietale (Rysunek 1C, 2C) za pomocą mikrowiertarki11.

  1. Znieczulić danio pręgowanego zgodnie z punktem 2.1.
  2. Trzymaj znieczulonego danio pręgowanego pionowo za pomocą kleszczy, tak aby kości kalwaryjne były dobrze widoczne pod mikroskopem preparacyjnym z góry (Rysunek 1C).
  3. Zlokalizuj obracające się mikrowiertło na środku kości czołowej (Os frontale) i dotknij kości. Wykonany otwór jest wielkości frezu do mikrowiertła (500 μm, Rysunek 2C, Rysunek 3B).
    UWAGA: Pamiętaj, aby nie przesuwać mikrowiertła na boki podczas powodowania obrażeń. Zatrzymaj się również natychmiast, gdy opór kości nagle spadnie. Nie drąż dalej, bo mózg zostanie uszkodzony 15.
  4. Przenieś rannego danio pręgowanego do klatki wypełnionej wodą dla ryb, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia. Przyjrzyj się temu uważnie.
  5. Przenieś zranionego danio pręgowanego do wody dla ryb wraz ze szklaną zlewką zawierającą prednizolon lub DMSO.

4. Leczenie danio pręgowanego podczas inkubacji

UWAGA: Podczas stosowania prednizolonu/DMSO, lek zawierający wodę dla ryb musi być codziennie zmieniany, a danio pręgowany musi być regularnie karmiony.

  1. Podmiany wody
    1. Aby wymienić wodę dla ryb, rozmrozić 100 mM prednizolonu i przygotować wymaganą ilość 50 μM prednizolonu w autoklawowanej wodzie dla ryb na świeżo każdego dnia okresu leczenia. Przygotować odpowiednio DMSO zawierające wodę dla ryb dla kontrolnego danio pręgowanego.
    2. Pobrać szklaną zlewkę zawierającą pojedynczego ryba danio pręgowanego w jego roztworze inkubacyjnym i przenieść roztwór, w tym danio pręgowanego, do odpowiedniego pojemnika, na przykład klatki tymczasowej.
      UWAGA: Zawsze używaj oddzielnych pojemników tymczasowych odpowiednio dla danio pręgowanego i danio pręgowanego traktowanego DMSO, aby upewnić się, że danio pręgowany kontrolowany DMSO nie jest narażony na działanie prednizolonu i odwrotnie.
    3. Napełnij szklaną zlewkę świeżym lekiem zawierającym wodę dla ryb (300 ml).
    4. Przenieść danio pręgowanego z pojemnika tymczasowego do szklanej zlewki zawierającej świeży roztwór do inkubacji za pomocą sieci rybackiej. Odłóż folię, aby uniknąć ucieczki danio pręgowanego.
    5. Jeśli czas trwania eksperymentu przekracza 2 tygodnie, wymień szklane zlewki.
  2. Żywienie
    1. Podczas krótkich zabiegów (do 2 dni) nie należy karmić danio pręgowanego. Podczas dłuższych eksperymentów karm danio pręgowanego. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia roztworu inkubacyjnego. Dlatego karm Artemia ssp., a nie pokarmem w płatkach i tylko co drugi dzień.
      UWAGA: Artemia jest regularnie używana do karmienia młodych danio pręgowanego i powinna być dostępna w kantarze danio pręgowanego.
      1. Około 2 godziny przed wymianą wody dla ryb nakarm danio pręgowanego Artemia ssp w szklanych zlewkach. W tym celu należy użyć plastikowej pipety i podawać od 0,5 do 1 ml wyklętego roztworu artemii na szklaną zlewkę.
      2. Odczekać 2 godziny i wymienić roztwór inkubacyjny na świeży lek zawierający wodę dla ryb zgodnie z punktem 4.1.

5. Analizy próbek

UWAGA: Po inkubacji zranionego danio pręgowanego odpowiednio w wodzie zawierającej prednizolon i DMSO, wykonaj analizy mineralizacji/zwapnienia kości (5.1 do 5.3) lub przeprowadź obrazowanie na żywo zebry pod mikroskopem preparacyjnym (5.4)10,11,16. Wykorzystaj obrazowanie na żywo, aby określić długość regeneracji płetw i wykryć różnice w ekspresji genu reporterowego u transgenicznego danio pręgowanego.

  1. Utrwalanie tkanek będących przedmiotem zainteresowania
    1. Do utrwalenia płetw i/lub czaszek należy przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS i zamrozić w temperaturze -20 °C do przechowywania. Użyj świeżo przygotowanego 4% PFA w PBS lub rozmroź wymaganą ilość przed użyciem. Alternatywnie można użyć 2% PFA w PBS.
      UWAGA: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie pod wyciągiem. Nosić odzież ochronną.
    2. Do utrwalenia żeberek przygotuj małą szalkę Petriego (np. 30 mm) z zimnym 4% PFA w PBS i upewnij się, że dno naczynia jest całkowicie przykryte. Do utrwalenia czaszek przygotuj mały szklany słoik z pokrywką lub tubkę z zimnym 4% PFA w PBS.
      UWAGA: Roztwory zawierające PFA należy obchodzić tylko pod wyciągiem, ponieważ jest to toksyczne. Nosić odzież ochronną.
    3. Zbierz tkankę, która Cię interesuje.
      1. W celu pozyskania regenerującej się tkanki płetwy lub płetw ze złamaniami należy znieczulić danio pręgowanego zgodnie z sekcją 2.1 lub poddać eutanazji danio pręgowanego zgodnie z punktem 5.1.5.
      2. Przenieś znieczulonego danio pręgowanego na pokrywę szalki Petriego. Używając skalpela lub żyletki, zbierz płetwę regeneracyjną. Upewnij się, że tkanka kikuta jest włączona do regenerujących się płetw, aby ułatwić obchodzenie się z pobraną tkanką.
    4. Ustabilizować żebra płasko na szalce Petriego zawierającej PFA w temperaturze 4 °C przez noc. Płaskie mocowanie pozwala uniknąć zwijania się tkanki płetwy podczas fiksacji.
      1. Aby przymocować płasko, chwyć tkankę płetwy jednym cienkim kleszkiem na grzbietowej lub brzusznej krawędzi kikuta i zanurz ją w roztworze utrwalającym. Chwyć przeciwległą krawędź kikuta drugimi cienkimi kleszczami i lekko dociśnij chusteczkę na dno naczynia.
      2. Przytrzymaj przez 10 do 20 s przed zwolnieniem. Tkanka płetwy nie powinna się już zwijać. Jeśli tak, powtórz czynność.
    5. Poddaj eutanazji danio pręgowanego w celu zebrania uszkodzonej tkanki czaszki. Przygotować szalkę Petriego o średnicy 100 mm zawierającą 0,1% MS-222 w wodzie dla ryb. Przenieś jednego danio pręgowanego na raz do MS-222 zawierającego szalkę Petriego za pomocą sieci rybackiej. Gdy osiągnięty zostanie 6 poziom znieczulenia (zapadnięcie rdzenia), odczekaj co najmniej 10 minut, aby upewnić się, że próbka umrze12.
    6. Za pomocą skalpela odetnij głowę oraz trochę tkanki tułowia od reszty ciała. Zanurz pobraną tkankę w przygotowanym 4% roztworze PFA w szklanym słoiku lub plastikowej tubie. Fix na 24 h w temperaturze 4 °C z delikatnym kołysaniem.
    7. Aby przechowywać próbki przez długi czas po utrwaleniu, należy je przemyć PBS (3 x 20 min w temperaturze pokojowej) i poddać działaniu metanolu w zwiększającej się serii metanolu (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% metanolu w PBS przez 20 minut każda).
      1. Przechowuj je w 100% metanolu w temperaturze -20 °C. W przeciwnym razie bezpośrednio przystąp do barwienia kości lub innych analiz po umyciu PBS.
  2. Techniki barwienia kości I (barwienie czerwienią alizarynową)
    UWAGA: To barwienie jest wykonywane zgodnie z van Eeden et al. 199617 oraz Walker & Kimmel 200718 z modyfikacjami.
    1. W celu barwienia czerwienią alizarynową płetw lub czaszek osobników dorosłych należy pobrać i utrwalić tkankę zgodnie z opisem w punkcie 5.1.
    2. Jeżeli próbki były przechowywane w metanolu w temperaturze -20 °C, należy je ponownie uwodnić, wykonując odwrotną serię metanolu (70%, 50% i 30% w PBS, każda 1x20 min) i przemyć dwukrotnie po 20 minut PBS. Myć próbki przez minimum 5 minut wodą dejonizowaną.
    3. Aby zabarwić czaszki na czerwono alizaryną, należy potraktować próbki 50 mg / ml trypsyny w 30% nasyconym Na2B4O7 w temperaturze pokojowej przez noc. Próbki skał w tym czasie. Przepłukać próbki w 30% nasyconym roztworze Na2B4O7. Umyj próbki wodą dejonizowaną 2 razy przez 5 minut każda. Ten krok nie jest wykonywany w przypadku tkanki płetwy.
    4. Dodać czerwony roztwór alizaryny (część B: 0,5% proszek czerwieni alizarynowej S, 10% glicerolu w wodzie dejonizowanej) i wstrząsnąć próbkami podczas inkubacji w temperaturze pokojowej. Sprawdzić, czy nie ma zabarwienia po 1, 2, 4 godzinach lub przez noc.
    5. Aby usunąć próbki, należy je potraktować zmniejszającą się 1% serią wodorotlenek potasu:glicerol (3:1 przez noc, 1:1 przez noc, 1:3 przez noc).
    6. Próbki należy przechowywać w roztworze 1:1 zawierającym 0,1% wodorotlenek potasu: 80% glicerolu i połączyć je z 80% glicerolem do obrazowania.
      UWAGA: W przypadku połączonego barwienia błękitem alcyjskim/czerwienią alizarynową próbki należy potraktować roztworem do barwienia błękitu Alcian (część A: końcowe 0,02% błękitu alcyjskiego, 50 mM MgCl2, 70% etanolu) po ponownym uwodnieniu (sekcja 5.2.2) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Traktować żebra ze zmniejszającą się serią etanolu w 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, każda 1x 15 min) i myć je przez co najmniej 1 godzinę (3x 20 min) w wodzie dejonizowanej. Kontynuować barwienie czerwienią alizarynową (punkt 5.2).
  3. Techniki barwienia kości II (barwienie kalceiny)
    UWAGA: Aby wykryć odkładanie się wapnia w złamaniach płetw i urazach czaszki, żywe ryby inkubuje się w roztworze zawierającym kalceinę.
    1. Przygotuj wymaganą ilość 0,2% kalceiny w wodzie dejonizowanej (pH 7,5). Upewnij się, że pH jest neutralne. Użyj 1 M NaOH, aby dostosować pH.
    2. Inkubować do 3 danio pręgowanego jednocześnie w 100 ml roztworu kalceiny przez 20 minut w szklanej zlewce pokrytej folią aluminiową.
    3. Przenieś danio pręgowanego do zlewki z wodą dla ryb. Pozwól im krótko popływać przed przeniesieniem ich do nowej zlewki z wodą dla ryb. Pozwól im pływać w tej nowej zlewce przez 20 minut, aby się umyły. Zrób zdjęcia (patrz punkt 5.4).
  4. Obrazowanie na żywo danio pręgowanego
    1. Użyj tego podejścia, aby uzyskać obrazy regenerującej się tkanki kostnej, takiej jak płetwa lub czaszka w trakcie eksperymentu, bez poświęcania danio pręgowanego. Znieczulić danio pręgowanego zgodnie z punktem 2.1.
    2. Aby uzyskać obrazy regenerujących się płetw, przenieś znieczulonego danio pręgowanego na pokrytą agarozą szalkę Petriego (patrz sekcja 2.2.1 i Rysunek 1B).
    3. Aby uzyskać obrazy regenerujących się kości czaszki, umieść danio pręgowanego pionowo w gąbce (Ryc. 1D) lub umieść go w naczyniu pokrytym agarozą, które zostało przygotowane do trzymania pnia danio pręgowanego.
    4. Uzyskuj obrazy w żądanym powiększeniu i rozdzielczości za pomocą stereomikroskopowej konfiguracji.
    5. Umieść danio pręgowanego z powrotem w pojemniku ze świeżą wodą lub wodą zawierającą lek
      6. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony tutaj protokół był wielokrotnie stosowany do indukowania szybkiego tworzenia kości w procesie regeneracji płetwy i czaszki danio-ostrobramkowego10,11,16. W połączeniu z opisaną metodą podawania prednizolonu możliwe jest prowadzenie badań nad wpływem tego związku na regenerację kości. Przykładowo można przeprowadzić badania nad formowaniem i mineralizacją kości w regeneracie. Predniz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Danio pręgowany okazał się przydatny w badaniach szkieletowych pod wieloma względami. Wybrane mutanty naśladują aspekty chorób ludzkich, takie jak wrodzona łamliwość kości lub choroba zwyrodnieniowa stawów 23,24,25,26,27, a larwy i łuski są wykorzystywane do identyfikacji związków anabolicznych kości w badaniach przesiewowych małych cząsteczek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant Centrum Terapii Regeneracyjnych w Dreźnie ("Danio pręgowany jako model do odkrycia mechanizmów utraty masy kostnej wywołanej glukokortykosteroidami") oraz dodatkowo przez grant Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projekt 387653785) dla FK. Jesteśmy bardzo wdzięczni Janowi Kaslinowi i Avinashowi Chekuru za ich wskazówki i pomoc w wykonywaniu trepanacji kalwarii i złamań w promieniach kostnych płetw. Eksperymenty zostały zaprojektowane, przeprowadzone i przeanalizowane przez KG i FK. FK napisał rękopis. Chcielibyśmy również podziękować Katrin Lambert, Nicole Cudak i innym członkom laboratoriów Knopf i Brand za pomoc techniczną i dyskusję. Podziękowania kierujemy również do Mariki Fischer i Jitki Michling za doskonałą opiekę nad rybami oraz do Henriette Knopf i Josha Currie za korektę rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PrednizolonSigma-AldrichP6004
Dimetylosulfoksydek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Metanosulfonian etylu-3-aminobenzoesanu (MS-222)Sigma-AldrichA5040
kleszczeAesculapBD027R
Drobne kleszczeDumont91150-20
SkalpelBraun5518059
AgaroseBiozym840004
Igła iniekcyjna (0,3 mm x 13 mm)BD Beckton Dickinson30400
MikrowiertłoCell PointScientific 67-1000dystrybuowane np. firmy Harvard
Apparatus Frezy stalowe (0,5 µ średnica m)Narzędzia do nauk ścisłych19007-05
Artemia ssp.Sanders425GR
Pipeta Pasteura (plastikowa, pastetowa)Alpha LabsLW4111
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Alizaryn czerwony S w proszkuSigma-AldrichA5533
Alcian niebieski 8 GXSigma-AldrichA5268
CalceinSigma-AldrichC0875
TrypsynaSigma-AldrichT7409
Mikroskop stereoskopowyLeicaMZ16 FAz kamerą QIMAGING Aparat RETIGA-SRV
Mikroskop stereoskopowyOlympusMVX10z aparatem Olympus DP71 lub DP80

Bibliografia

  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
  2. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  3. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  4. Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853(2016).
  5. Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
  6. den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
  7. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  8. de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
  9. Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
  10. Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
  11. Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
  12. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  13. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  14. Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2(2015).
  15. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  16. Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
  17. van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
  18. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  19. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  20. Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
  21. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  22. Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  23. Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
  24. Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
  25. Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
  26. Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787(2013).
  27. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
  28. Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
  29. de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja kości u rybek danio-ostrobramkowychleczenie prednizolonemamputacja płetwytrepanacja kalwarialnazłamanie płetwybarwienie alizaryną czerwonąimmunohistochemiamikroskopia fluorescencyjnasystemiczna ekspozycja na lektworzenie kości
Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.