Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Streszczenie

Enzymy związane z receptorami są głównymi mediatorami aktywacji komórkowej. Enzymy te są regulowane, przynajmniej częściowo, przez fizyczne interakcje z cytoplazmatycznymi ogonami receptorów. Interakcje często zachodzą poprzez określone domeny białkowe i powodują aktywację enzymów. Istnieje kilka metod badania interakcji między białkami. Podczas gdy koimmunoprecypitacja jest powszechnie stosowana do badania domen, które są wymagane do interakcji białko-białko, nie ma testów, które dokumentowałyby udział określonych domen w aktywności rekrutowanych enzymów w tym samym czasie. W związku z tym opisana tutaj metoda łączy koimmunoprecypitację i test aktywności enzymatycznej na kulkach w celu jednoczesnej oceny interakcji między białkami i związanej z nimi aktywacji enzymatycznej. Celem tego protokołu jest zidentyfikowanie domen, które są krytyczne dla fizycznych interakcji między białkiem a enzymem oraz domen, które są niezbędne do pełnej aktywacji enzymu. Wykazano znaczenie tego testu, ponieważ niektóre domeny białek receptorowych przyczyniają się do wiązania enzymu z ogonem cytoplazmatycznym receptora, podczas gdy inne domeny są niezbędne do regulacji funkcji tego samego enzymu.

Wprowadzenie

Receptory katalityczne i receptorowe kinazy tyrozynowe to białka transbłonowe, w których wiązanie liganda zewnątrzkomórkowego powoduje aktywność enzymatyczną po stronie wewnątrzkomórkowej¹. Niektóre receptory pełnią zarówno funkcje receptorowe, jak i enzymatyczne, podczas gdy inne rekrutują określone enzymy, takie jak kinazy i fosfatazy, do swoich ogonów cytoplazmatycznych. Rekrutacja enzymu do ogona receptora i późniejsze działanie katalityczne tego enzymu to dwa odrębne procesy, które nie zawsze są regulowane przez te same domeny białkowe². Niestety, nie ma konkretnych narzędzi do jednoczesnej oceny zarówno interakcji, jak i aktywności enzymatycznej. Opisany tutaj funkcjonalny test koimmunoprecypitacji jest użyteczną metodą do analizy rekrutacji enzymu do ogona receptora od jego aktywacji. Test ten wykorzystuje immunoprecypitację oznakowanych receptorów za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami. Następnie przeprowadza się zarówno test aktywności enzymatycznej, jak i analizę western blot na kulkach. Ogólnym celem tej metody jest odkrycie, które domeny białkowe są niezbędne do interakcji między receptorami a enzymami (oceniane za pomocą analizy western blot) i które domeny są niezbędne do pełnej aktywacji enzymów (mierzonej za pomocą testu aktywności enzymatycznej na kulce). Istotne jest opracowanie narzędzi do badania odrębnych funkcji enzymów związanych z receptorami ze względu na ich udział w patogenezie chorób człowieka. Co więcej, dalsze zrozumienie mechanizmów działania tych białek może pomóc w projektowaniu nowych interwencji terapeutycznych.

Programowana śmierć-1 (PD-1) jest receptorem hamującym na powierzchni limfocytów T i jest niezbędna do ograniczenia nadmiernych odpowiedzi limfocytów T. W ostatnich latach przeciwciała anty-PD-1 zostały zaangażowane w leczenie wielu nowotworów złośliwych^1,2. Ligacja PD-1 ogranicza liczne funkcje limfocytów T, w tym proliferację, adhezję i wydzielanie wielu cytokin^3,4,5. PD-1 jest zlokalizowany w synapsie immunologicznej, interfejsie między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen⁶, gdzie kolokalizuje się z receptorem limfocytów T (TCR)⁷. Następnie fosfataza tyrozynowa SHP2 [domena homologii Src 2 (SH2) zawierająca fosfatazę tyrozynową 2] jest rekrutowana do ogona cytoplazmatycznego PD-1, co prowadzi do defosforylacji kluczowych reszt tyrozyny w kompleksie TCR i związanych z nim proksymalnych cząsteczkach sygnałowych3^,4,5,8,9. Ogon cytoplazmatyczny PD-1 zawiera dwa motywy tyrozynowe, motyw hamujący oparty na tyrozynie (ITIM) i motyw przełącznika opartego na tyrozynie (ITSM) ¹⁰. Oba motywy są fosforylowane po podwiązaniu PD-1^9,10. Badania mutagenezy ujawniły pierwszoplanową rolę ITSM w rekrutacji SHP2, w przeciwieństwie do ITIM, którego rola w sygnalizacji i funkcji PD-1 nie jest jasna⁴.

SHP2 przyjmuje albo konformację zamkniętą (złożoną), zahamowaną, albo konformację otwartą (rozszerzoną), aktywną¹¹. Udział każdej domeny ogonowej PD-1 w wiązaniu lub aktywacji SHP2 nie został jeszcze wyjaśniony. Aby odpowiedzieć na to pytanie, opracowaliśmy test, który umożliwia równoległe testowanie rekrutacji SHP2 do ogona PD-1 i jego aktywności¹². Zastosowaliśmy koimmunoprecypitację i test aktywności fosfatazy na kulkach, aby równolegle przetestować zarówno interakcję, jak i aktywność enzymatyczną. Za pomocą tego testu pokazujemy, że ITSM PD-1 jest wystarczający do rekrutacji SHP2 do ogona PD-1, podczas gdy ITIM PD-1 jest potrzebny do pełnego rozciągnięcia i aktywacji enzymu.

Istnieje wiele receptorów, które mają kilka sąsiadujących domen w swoich cytoplazmatycznych ogonach. Funkcjonalny test koimmunoprecypitacji może odkryć rolę określonych domen, które są niezbędne do rekrutacji białek lub aktywacji enzymatycznej.

Protokół

1. Transfekcja komórek

1. Wysiewaj komórki HEK 293T na dwanaście 10-centymetrowych płytek (5 x 10,⁶ komórek na płytkę) dzień przed transfekcją (Rysunek 1). Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Na każdą płytkę użyj 10 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Gdy komórki są w 80-90% zlewne, transfekuj 5 płytek HEK 293T za pomocą odczynnika transfekcyjnego na bazie lipidów z jednym z następujących plazmidów: wektor eksprymujący SHP2, wektor eksprymujący PD-1-GFP [wersja PD-1 typu dzikiego (WT)], zmutowana ITIM wersja (Y223F) wektora eksprymującego PD-1-GFP i zmutowana ITSM wersja (Y248F) wektora eksprymującego PD-1-GFP (Rysunek 1).
   UWAGA: Dwie płytki zostaną transfekowane wektorem ekspresji WT PD-1-GFP. Jedna dodatkowa płytka posłuży jako kontrola komórek nietransfekowanych (Rysunek 1).
3. Wykonaj transfekcję zgodnie z protokołem producenta dla komórek przylegających w płytkach 10 cm.
   UWAGA: W zmutowanych wersjach PD-1 tyrozyna (Y) w każdym motywie została zastąpiona fenyloalaniną (F), która nie może być fosforylowana.
4. Transfekować drugi identyczny zestaw pięciu płytek i jedną dodatkową płytkę służącą jako nietransfekowana kontrola do pomiaru wyrażonej ilości białka [wejście; znane również jako lizat całych komórek (WCL)] przed immunoprecypitacją (Rysunek 1).
5. Inkubować transfekowane komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli tkankowych.
   UWAGA: Aby upewnić się, że transfekcja przebiegła pomyślnie, zbadaj komórki pod kątem ekspresji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

2. Promowanie fosforylacji w transfekowanych komórkach

1. Po inkubacji przygotować świeży perwanadate, mieszając 50 μl ortowanadanu sodu (ze 100 mM bulionu) z 50 μl 30% H₂O₂,
   UWAGA: Mieszanina powinna zmienić kolor na żółtawy. Perwanadat jest przepuszczalnym dla komórek inhibitorem fosfatazy, który wspomaga fosforylację reszt tyrozyny¹³. W tym teście służy do silnego indukowania fosforylacji ogonów PD-1.
2. Aby fosforylować oznaczone wersje PD-1, usuń pożywkę z komórek transfekowanych PD-1-GFP i dodaj 10 ml zwykłego DMEM (bez surowicy lub antybiotyków) razem z 10 μl perwanadanu (krok 2.1) do każdej 10 cm płytki (co daje osiem płytek wyrażających różne wersje PD-1) (Rysunek 1). Umieść talerze w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 min.
   UWAGA: Komórki transfekowane SHP2 (dwie płytki; Rysunek 1) a dwie nietransfekowane płytki kontrolne nie są traktowane perwanadatem, ponieważ płytki te będą służyć jako źródło aktywnego enzymu SHP2.
3. Umyj komórki 5 ml lodowatego 1x PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie.

3. Immunoprecypitacja

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C.

1. Uzupełnij bufor do lizy (50 mM Tris-HCl o pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glicerolu) inhibitorami proteazy (rozpuścić 1 tabletkę w 10 ml buforu do lizy) i 1 mM orthovanadatem sodu. Dodać 500 μl lodowatego buforu do lizy do komórek i natychmiast usunąć i zebrać komórki z płytek za pomocą skrobaka do komórek.
   UWAGA: Ważne jest, aby dodawać ortowananian sodu tylko do buforu do lizy, który będzie używany do płytek transfekowanych PD-1-GFP, ponieważ płytki transfekowane SHP2 i nietransfekowane płytki kontrolne muszą zachować aktywność fosfatazy.
2. Przenieść lizaty do zimnych probówek o pojemności 1,5 ml i obracać je w temperaturze 0,005 x g, 4 °C przez 30 minut.
3. Aby zebrać supernatant postjądrowy (PNS) z lizatów, należy wirować lizaty przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatanty do nowych probówek. Wyrzuć granulkę. Przechowuj supernatanty z drugiego zestawu sześciu płytek (Rysunek 1) na lodzie do późniejszej analizy WCL.
4. Przygotowanie kulek anty-GFP do immunoprecypitacji PD-1-GFP z lizatów transfekowanych PD-1-GFP z pierwszego zestawu (cztery płytki) (Rysunek 1).
   1. Aby zapobiec osadzaniu się koralików, przed otwarciem delikatnie potrząśnij butelką z koralikami. Usunąć 40 μl kulek anty-GFP z gnojowicy na każdy warunek.
   2. Wirować w temperaturze 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant w celu umycia kulek.
      UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować kontakt plastikowych końcówek pipety z kulkami agarozy, aby zapobiec utracie. Zaleca się przecięcie krawędzi końcówki o pojemności 200 μl przed przeniesieniem kulek do innej tuby.
   3. Ponownie zawiesić kulki w 80 μl buforu do lizy (na próbkę).
5. Dodać umyte kulki bezpośrednio do lizatu komórkowego (PNS) z komórek wykazujących ekspresję PD-1-GFP z pierwszego zestawu (cztery płytki) (krok 3.3). Obracać w temperaturze 0,005 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu immunoprecypitacji białek znakowanych GFP.
6. Umyj kulki 1 ml zimnego buforu do lizy (bez ortowanadatu) 3 razy. Odwirować probówkę o masie 2 500 x g przez 10 s.
   UWAGA: Dodając bufor do lizy do kulek, dodaj go bezpośrednio na kulki, nie dotykając ich końcówkami. Nie ma potrzeby pipetowania w górę i w dół podczas mycia.
7. Równo podzielić lizat aktywnego SHP2 z pierwszego zestawu (jedna płytka; krok 3.3) i dodać go do trzech probówek z przemytymi kulkami zawierającymi PD-1-GFP (WT PD-1-GFP i dwie różne mutacje z niedoborem fosforu, Y223F i Y248F). Dodać jedną trzecią objętości z lizatu komórek nietransfekowanych do drugiej probówki kulek WT PD-1-GFP. Odrzuć pozostałe dwie trzecie.
8. Inkubować kulki przez 4 godziny w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami (0,005 x g).
9. Przemyć kulki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu do lizy (bez perwanadatu lub ortowanadatu), jak opisano w kroku 3.6.
10. Dodać 80 μl buforu do lizy (bez perwanadatu lub ortowanadatu) na próbkę, upewniając się, że całkowita objętość w każdej probówce wynosi 100 μl (20 μl kulek i 80 μl buforu do lizy). Delikatnie wymieszaj i przenieś 50 μl z każdej probówki do dwóch świeżych probówek o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Po tym kroku zostaną dwie probówki wypełnione mieszaniną zawierającą kulki i bufor do lizy: jedna probówka zostanie użyta do przetestowania koimmunoprecypitowanego SHP2 metodą western blot, a druga zostanie użyta do testu aktywności fosfatazy.

4. Test aktywności fosfatazy

1. Przemyć kulki raz buforem do przemywania fosfatazy (30 mM Hepes o pH 7,4 i 120 mM NaCl). Całkowicie usunąć supernatant.
2. Dodać 100 μl buforu do oznaczania (30 mM Hepes przy pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrofenylofosforanu) do kulek i inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut pod delikatnym mieszaniem. UWAGA: Czas inkubacji może się różnić, ale poczekaj, aż bufor zmieni kolor na żółty po defosforylacji.
3. Aby zakończyć reakcję, dodać 50 μl 1 M NaOH, gdy bufor zmieni kolor na żółty.
4. Wirować w dół przy 2,500 x g przez 10 s i przenieść 50 μl supernatantu do dwóch studzienek (duplikatów po 50 μl na studzienkę) o połowie powierzchni w 96-dołkowej płytce. Odczytać absorbancję przy 405 nm.
5. Wyrazić wyniki jako względną gęstość optyczną (OD) w kontrolnej wersji PD-1-GFP typu dzikiego.

5. Analiza SHP2 Western Blot

1. Zakręć koraliki i usuń supernatant.
2. Dodać 20 μl 2x buforu Laemmli (patrz tabela materiałów) do kulek i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
3. Zmierz stężenie białka w kontrolkach wejściowych (drugi zestaw) za pomocą zestawu BCA (patrz tabela materiałów). Przenieść 30 μl najbardziej rozcieńczonej próbki do nowej probówki. Rozcieńczyć pozostałe kontrole wejściowe buforem do lizy do tego samego stężenia, co najbardziej rozcieńczona próbka i przenieść 30 μl z każdej z nich do nowej probówki.
   UWAGA: Po tym kroku będą 4 probówki po 30 μl każda, o podobnych stężeniach białka, reprezentujące wejściowe lizaty kontrolne.
4. Dodać równe objętości 2x buforu Laemmli do lizatów i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Odwirować kulki i załadować supernatant na 4–20% żelu na bazie SDS-PAGE Tris (patrz tabela materiałów) do analizy western blot. Ponadto załadować 50 μl z każdej próbki z drugiego zestawu.
5. Kontynuuj analizę western blot zgodnie z wcześniej opisanym protokołem¹².

Wyniki

Podczas gdy wkład ITSM PD-1 w wiązanie SHP2 jest już ustalony, rola ITIM PD-1 jest mniej jasna. Ponieważ SHP2 ma dwie domeny SH2, które mogą wiązać się z dwiema sekwencyjnymi fosfotyrozynami na PD-1 (jedna tyrozyna w ITSM, a druga w ITIM), postawiliśmy hipotezę, że ITSM PD-1 zakotwicza SHP2 do PD-1, podczas gdy ITIM PD-1 ułatwia aktywność SHP2 poprzez stabilizację jego otwartego stanu konformacyjnego^11,14. Aby to sprawdzić, opraco...

Dyskusja

Interakcje receptor-enzym mają kluczowe znaczenie dla sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Wiele enzymów jest rekrutowanych do receptorów poprzez domeny SH2 wiążące się z fosforylowanymi tyrozynami, które ozdabiają ogony tych samych receptorów. Jednak enzymy są często składane w zamknięte nieaktywne konformacje, a aktywacja wymaga zmiany konformacyjnej¹¹ , w której mogą pośredniczyć inne domeny tego samego receptora. Opisany tutaj test mierzy interakcje między receptorami i enzymami, a także aktywność...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS	Lonza	17-516F	solą fizjologiczną buforowaną fosforanem
	Eppendorf	5424-R	1,5 ml
trypsyny-EDTA (0,25%) Czerwień fenolowa	Gibco	25200114
Inaktywowana termicznie FBS	Denville	FB5001-H	Płodowa surowica bydlęca
Penicylina / Streptomycyna	Fisher	BP295950
DMEM wysoka glukoza bez L-glutaminy	Lonza	BE12-614F
SuperFect Odczynnik do transfekcji	Qiagen	301305
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti– GFP-agaroza	MBL	D153-8
Anty-GFP	Roche	118144600
Antyaktyna	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293 komórki	ATCC	CRL-1573
Orthovanadate	Sigma	S6508
H2O2	Sigma	216763	30%
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836170001	wolny od EDTA
Bufor do próbek Tris-Glycine SDS (2x)	Invitrogen	LC2676	Zmodyfikowany bufor Laemmli
4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Invitrogen	XP04205BOX	15-dołkowe
membrany nitrocelulozowe	General Electric	10600004
NaCl	Sigma	S7653	Sód chlorek
HEPES	Gibco	15630080	Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy
DTT	Invitrogen	D1532	Ditiotreitol
pNPP	Sigma	20-106	fosforan p-nitrofenylu
NaOH	Sigma	S8045	Wodorotlenek sodu
BCA	Fisher	23225	Test kwasu bichinowego