Artykuł metodologiczny

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) dla wirusa Zika i genów porządkowych w próbkach moczu, surowicy i komarów

DOI:

10.3791/58436

⸱

14 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Beaumont Health System, 2Foundational Sciences, College of Medicine, Central Michigan University, 3Oakland University William Beaumont School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia skuteczną i tanią metodę wykrywania wirusa Zika lub celów kontrolnych w próbkach ludzkiego moczu i surowicy lub u komarów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda nie wymaga izolacji RNA i można ją wykonać w ciągu 30 minut.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie wirusem Zika (ZIKV) może przebiegać bezobjawowo u dorosłych, jednak zakażenie w czasie ciąży może prowadzić do poronienia i poważnych neurologicznych wad wrodzonych. Celem tego protokołu jest szybkie wykrycie ZIKV zarówno w próbkach pobranych od ludzi, jak i komarów. Obecnie złotym standardem w wykrywaniu ZIKV jest ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR); Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) może pozwolić na bardziej wydajne i tanie testowanie bez konieczności stosowania drogiego sprzętu. W tym badaniu RT-LAMP jest używany do wykrywania ZIKV w różnych próbkach biologicznych w ciągu 30 minut, bez uprzedniego izolowania RNA od próbki. Technikę tę zademonstrowano przy użyciu moczu i surowicy pacjenta zakażonego ZIKV oraz próbek zakażonych komarów. Rybosomalny kwas rybonukleinowy 18S i aktyna są stosowane jako kontrole odpowiednio w próbkach od ludzi i komarów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W 2015 roku wirus Zika (ZIKV) zyskał światową uwagę jako choroba zakaźna budząca obawy, ponieważ infekcja w czasie ciąży była powiązana z poronieniem, urodzeniem martwego dziecka, ciężkimi neurologicznymi wadami wrodzonymi, w tym małogłowiem, a także innymi wrodzonymi wadami wrodzonymi1. W rzadkich przypadkach ZIKV jest związany z zespołem Guillaina-Barrégo. ZIKV jest przenoszony głównie przez komary Aedes; Jednak może być również rozprzestrzeniany poprzez kontakt seksualny1. Biorąc pod uwagę, że zakażenie wirusem ZIKV przebiega bezobjawowo u większości osób lub objawia się łagodnymi objawami grypopodobnymi, które pokrywają się z objawami infekcji innymi arborwirusami1, istniała potrzeba ulepszenia metod szybkiego i opłacalnego wykrywania ZIKV w celu badania przesiewowego zarówno ludzi, jak i lokalnych populacji komarów.

Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) jest niezawodnym testem do wykrywania ZIKV; jednak ta technika wymaga drogiego specjalistycznego sprzętu, wyszkolonego personelu i izolacji RNA od interesującej nas próbki. Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) to jednoetapowa metoda amplifikacji kwasów nukleinowych oparta na technologii PCR, która wymaga tylko jednej temperatury inkubacji ze względu na zastosowanie termofilnej polimerazy DNA o właściwościach przemieszczenia nici. Pozwala to obejść potrzebę stosowania termocyklera i skrócić czas potrzebny na wykonanie testu. Dodatkowymi zaletami RT-LAMP są wysoka specyficzność i czułość, wytrzymałość w zakresie poziomów pH i temperatur oraz odporność na wiele inhibitorów PCR2. Ma stosunkowo niski koszt, a odczynniki są stabilne w temperaturze pokojowej. Biorąc pod uwagę te cechy, RT-LAMP może być stosowany w laboratorium lub w terenie. W związku z tym reakcje LAMP zostały opracowane w celu wykrywania szeregu patogenów i innych rodzajów infekcji3,4,5. Celem protokołu RT-LAMP opisanego w tym artykule jest wykrycie ZIKV bez izolacji RNA w próbkach ludzkiej surowicy i moczu, a także u pojedynczego zakażonego komara w ciągu 30 minut za pomocą RT-LAMP. Metoda ta może być stosowana do zastąpienia qRT-PCR, ponieważ jest to czułe, szybkie narzędzie diagnostyczne, które działa szybko i w warunkach poza laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) Beaumont Health. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

UWAGA: Wszystkie potencjalnie zakaźne materiały powinny być obsługiwane zgodnie ze standardami bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2, w tym przy użyciu środków ochrony osobistej. Wszelkie procedury, które mogą powodować powstawanie aerozolu, powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodatkowo praca z żywymi komarami powinna być wykonywana w odpowiednim obiekcie o poziomie hermetyzacji stawonogów 1-3. Biorąc pod uwagę związek zakażenia ZIKV z wadami wrodzonymi, kobiety w ciąży, starające się o dziecko lub partnerzy tych kobiet powinni znacznie zminimalizować narażenie laboratoryjne na ZIKV. Transport próbek ZIKV jest klasyfikowany w Stanach Zjednoczonych jako substancje biologiczne kategorii B zgodnie z przepisami Departamentu Transportu dotyczącymi materiałów niebezpiecznych (49 CFR część 171-180), dlatego wysyłka próbek powinna być zgodna z tymi wytycznymi. Import do Stanów Zjednoczonych próbek biologicznych ZIKV wymaga zezwolenia na import Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC). Import jakichkolwiek stawonogów, które mogą służyć jako wektor transmisji ZIKV, nawet jeśli nie są zainfekowane, wymaga zezwolenia Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA). Informacje te są aktualne w momencie publikacji. Aktualne zalecenia można znaleźć na stronie https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

UWAGA: Reakcje RT-LAMP są podatne na wyższe wskaźniki fałszywych pozytywnych reakcji, więc należy podjąć środki ostrożności w planowaniu eksperymentalnym. Wszystkie ustawienia i przeprowadzanie reakcji RT-LAMP powinno odbywać się przy użyciu wyznaczonych pipet i końcówek filtrujących. Idealnie byłoby, gdyby został ustalony boczny przepływ pracy. Jeśli to możliwe, analiza i obrazowanie (sekcja 5) powinny odbywać się w oddzielnym, zamkniętym pomieszczeniu, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Otwieranie probówek zawierających produkty RT-LAMP powinno być ograniczone do minimum.

1. Przygotowanie podkładu RT-LAMP

  1. Rozpuść każdy liofilizowany starter RT-LAMP w wodzie molekularnej do końcowego stężenia 100 μM (Tabela 1). Krótko zmieszaj roztwór startera, aby zapewnić jednorodny roztwór, a następnie krótko odwiruj roztwór z maksymalną prędkością w wirówce stołowej, aby zebrać cały roztwór startera.
  2. Przygotuj 10-krotną mieszankę podkładów FIP, BIP, F3, B3, LF i LB RT-LAMP, korzystając z objętości podanych w Tabeli 2. Krótko zmieszaj roztwór startera, aby uzyskać jednorodny roztwór, i krótko odkręć roztwór z maksymalną prędkością w wirówce stołowej, aby uniknąć strat.
    UWAGA: Zestaw starterów RT-LAMP dla aktyny Ae. aegypti (AEDAE) nie zawiera startera LB (startery pętlowe nie zawsze są konieczne w reakcjach RT-LAMP). W takim przypadku zastąp objętość startera LB wodą o jakości cząsteczkowej.
  3. Przechowuj podkłady w temperaturze -20 °C między użyciami i unikaj cykli swobodnego rozmrażania.

2. Przygotowanie próbki

  1. W przypadku próbek moczu ludzkiego: Użyj świeżego moczu, zamrożonego moczu lub moczu w środku konserwującym. W przypadku próbki świeżej lub mrożonej: natychmiast po pobraniu próbki należy odwirowywać przez 10 minut w temperaturze 700 x g i użyć supernatantu do analizy lub zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Przed użyciem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.
  2. W przypadku próbek surowicy ludzkiej: Należy użyć świeżych lub mrożonych próbek surowicy.
  3. W przypadku linii komórkowych zakażonych wirusem ZIKV: Należy użyć kondycjonowanych pożywek lub lizatów komórkowych.
    UWAGA: Media kondycjonowane bezkomórkowo firmy Ae. Komórki albopictus C6/36 8 dni po zakażeniu mogą być stosowane jako kontrola pozytywna reakcji ZIKV RT-LAMP.
  4. W przypadku komarów Ae. aegypti: Należy użyć całych świeżych lub mrożonych tusz komarów. Rozmrozić zamrożone komary na lodzie. Przygotuj surowy lizat komarów, umieszczając pojedynczego komara w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i homogenizuj, miażdżąc komara 10 razy za pomocą końcówki pipety P10 (Rysunek 1). Krótko odwirować surowy lizat, aby osadzać wszelkie zanieczyszczenia. Użyć supernatantu do dalszej analizy RT-LAMP.
    Uwaga: Kontrole pozytywne można wytworzyć w warunkach laboratoryjnych poprzez zakażenie samic komarów za pomocą mikroiniekcji doklatkowej z około 103 odpowiednikami genomu wirusa w objętości 200 nL i pobraniem komara 5 dni po zakażeniu.

3. Przygotuj RT-LAMP Master Mix

  1. Przygotować reakcję mieszania wzorcowego RT-LAMP na lodzie dla każdego zestawu podkładów, który ma być użyty, korzystając z przewodnika objętości w tabeli 3.
    UWAGA: Stosowanie termolabilnej glikozylazy DNA uracylu (UDG) pomaga w zapobieganiu fałszywie dodatnim wynikom.
    2. Krótko przemieszać
  2. , aby upewnić się, że wszystkie próbki są dobrze wymieszane, a następnie krótko odwirować, aby zapobiec utracie objętości.

4. Test RT-LAMP

  1. Odpipetować 23,0 μl mieszanki wzorcowej RT-LAMP na reakcję do probówki PCR o pojemności 200 μl. Dodać 2,0 μl próbki (mocz, surowica lub surowy supernatant lizatu komarów, jak opisano w kroku 2). Dzięki temu całkowita objętość wyniesie 25,0 μl na reakcję RT-LAMP. Do kontroli ujemnej należy użyć wody molekularnej. Uwzględnij kontrolę pozytywną.
    UWAGA: Jako kontrolę pozytywną można użyć wzorca PCR lub zapasów wirusa z supernatantu zakażonych linii komórkowych.
    1. Opcjonalnie: należy uwzględnić reakcję kontroli swoistości pokrewnego arbowirusa, takiego jak wirus dengi (DENV). Przygotuj próbkę zgodnie z opisem w kroku 2 w zależności od typu próbki. Dodać 2,0 μl kontroli swoistości do 23,0 μl mieszanki wzorcowej RT-LAMP do probówki PCR o pojemności 200 μl.
  2. Podgrzewać próbki w temperaturze 61 °C przez 30 minut za pomocą bloku grzewczego, łaźni wodnej lub termocyklera.
  3. Dezaktywować polimerazę na gorąco przez ogrzewanie do 80 °C przez 10 min.

5. Analiza RT-LAMP

UWAGA: Przeprowadź analizę RT-LAMP w oddzielnej, zamkniętej przestrzeni.

  1. Po inkubacji uzyskaj wizualny dostęp do reakcji RT-LAMP, szukając obecności zmiany koloru.
    1. Rozcieńczyć barwnik fluorescencyjnego kwasu nukleinowego w stosunku 1:10 w buforze TAE (40 mM Tris, 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA).
      UWAGA: Każda plama z kwasu nukleinowego wiąże się z kwasami nukleinowymi i dlatego jest czynnikiem rakotwórczym. Podczas obsługi należy nosić rękawice.
    2. Do 12 μl reakcji RT-LAMP dodać 2 μl fluorescencyjnego rozcieńczenia barwnika kwasem nukleinowym.
      UWAGA: Negatywne reakcje będą koloru pomarańczowego, a pozytywne będą koloru żółto-zielonego.
    3. Opcjonalnie: Zrób zdjęcia reakcji RT-LAMP na białym tle za pomocą aparatu.
  2. Umieść próbki w świetle UV o długości fali 302 nm, aby potwierdzić obecność produktów RT-LAMP metodą fluorescencji. Zrób zdjęcie wyniku za pomocą aparatu.
    UWAGA: Dodatnie reakcje RT-LAMP będą miały moc fluorescencyjną.
    UWAGA: Podczas pracy ze światłem UV należy nosić okulary chroniące przed promieniowaniem UV lub osłonę twarzy.
  3. Opcjonalnie: Potwierdź obecność produktów RT-LAMP, wykonując elektroforezę żelową na próbkach.
    1. Wlej 2% żel agarozowy do 1x bufor TAE z barwnikiem kwasu nukleinowego w celu wizualizacji.
      UWAGA: Każda plama z kwasu nukleinowego wiąże się z kwasami nukleinowymi i dlatego jest czynnikiem rakotwórczym. Podczas obsługi należy nosić rękawice.
    2. Dodaj 5 μl drabinki DNA w pierwszym pasie, aby porównać masy cząsteczkowe.
    3. Dla każdej reakcji RT-LAMP zmieszać 13 μl mieszaniny reakcyjnej RT-LAMP z 2 μl barwnika ładującego DNA. Załadować 15 μl mieszaniny zawierającej barwnik ładujący DNA.
    4. Uruchom żel pod napięciem 90 V przez 90 minut lub do momentu, gdy pasma zostaną rozdzielone i zobrazuj światłem UV 302 nm.
      UWAGA: Pozytywne reakcje RT-LAMP będą miały wzorzec drabinkowy. Ujemne reakcje RT-LAMP nie powinny zawierać żadnych prążków.

6. Utylizacja

  1. Reakcje RT-LAMP należy utylizować w podwójnie zamkniętych workach. Nie należy sterylizować w autoklawie, ponieważ może to spowodować rozpylenie produktów RT-LAMP, prowadząc do fałszywie dodatnich reakcji w przyszłości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reakcje RT-LAMP mogą być analizowane przy użyciu trzech różnych metod. Po pierwsze, po dodaniu fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego, pozytywne reakcje będą miały kolor żółto-zielony, podczas gdy negatywne reakcje będą miały kolor pomarańczowy gołym okiem. Po drugie, dodanie fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego do reakcji RT-LAMP powoduje powstanie sygnału fluorescencyjnego, gdy próbki są wzbudzane światłem UV. Reakcje negatywne nie będą miały wykrywalnego sygnału fluores...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test ZIKV RT-LAMP opisany w tym artykule działa przy użyciu zarówno próbek od ludzi, jak i komarów6. Granica wykrywalności wynosiła około 1 ekwiwalent genomu6, co powinno wystarczyć, ponieważ typowe miano wirusa u objawowego pacjenta zakażonego ZIKV wynosi 103 do 106 PFU/ml7. Ponadto metoda ta może wykrywać ZIKV w próbkach bez uprzedniego wyizolowania RNA i bez amplifikacji wirusa w hodowli komórkowej. To znacznie skr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LEL i MBC posiadają własność intelektualną dotyczącą metod diagnozowania wirusa Zika. Pozostali autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez filantropijny wkład rodziny Maureen i Ronalda Hirschów oraz Field Neurosciences Institute, St. Mary's of Michigan. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy również dr Bernadette Zwaans i Elijahowi Wardowi za ich krytyczną recenzję manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bst 2.0 Polimeraza DNA WarmStartNew England BiolabsM0537S
 New England BiolabsB0537S
WarmStart RTx Odwrotna transkryptazaNew England BiolabsM0380S
Antarktyczna termolabilna UDGNew England BiolabsM0372S
MgSO4New England BiolabsB1003S
100 mM dATP SolutionNew England BiolabsN0440SZestaw deoksynukleotydów N0446S
100 mM dCTP RoztwórNew England BiolabsN0441SZestaw deoksynukleotydów N0446S
100 mM dTTP RoztwórNew England BiolabsN0443SZestaw deoksynukleotydów N0446S
100 mM dGTP RoztwórNew England BiolabsN0442SZestaw deoksynukleotydów N0446S
100 mM roztwór dUTPThermo Fisher ScientificR0133
Kwas nukleinowy SYBR Green I Gel StainInvitrogenS7563
Nancy-520Sigma Aldrich01494
Drabinka o niskiej masie DNAInvitrogen10-068-013
Zika Postive ControlInstytut Roberta Kocha, NiemcyNie dotyczy
AgarozaThermo Fisher ScientificBP1600
BlueJuice Żel Bufor ładującyInvitrogen
10816015 StarteryZintegrowane technologie DNANiestandardowe Oligo
Nucleazo-Free WaterAmbionAM9938
Środek konserwujący moczNorgen Biotek18126
ZIKV PCR StandardRobert Koch InstituteN/ASupernatanty komórkowe Vero E6
DENV2 Nowa Gwinea CControl Connecticut Eksperyment rolniczy StacjaN/A
Bufor do amplifikacji izotermicznej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
  2. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  3. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
  4. Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).
  5. Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  6. Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803(2018).
  7. Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
  8. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  9. Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948(2012).
  10. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
  11. Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223(2016).
  12. Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
  13. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  14. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  15. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).
  16. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  17. Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie wirusa Zikapr bki surowicy z moczuanaliza pr bek komar wizolacja RNAfluorescencyjny barwnik kwas w nukleinowychelektroforeza w elu agarozowyminkubacja w bloku grzejnymrekonstytucja starter wprzygotowanie mieszaniny Master Mix

Powiązane artykuły