MALT1 reguluje wrodzoną odporność, ale jak to się dzieje, pozostaje niejasne. Użyliśmy selektywnego inhibitora parakaspazy MALT1 MLT-827, aby rozwikłać wkład MALT1 w sygnalizację wrodzoną za receptorami lektynopodobnymi Toll lub typu C, wykazując, że MALT1 reguluje produkcję cytokin szpikowych i za receptorami lektynopodobnymi typu C, selektywnie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oprócz swojej funkcji w komórkach limfoidalnych, która została opisana w licznych badaniach, parakaspaza MALT1 odgrywa również ważną rolę w komórkach wrodzonych poniżej receptorów rozpoznawania wzorców. Najlepiej zbadane są dektyna-1 i dektyna-2 z rodziny receptorów lektynopodobnych typu C, które indukują kaskadę sygnalizacyjną zależną od SYK i CARD9, prowadzącą do aktywacji NF-κB, w sposób zależny od MALT1. Natomiast receptory Toll-podobne (TLR), takie jak TLR-4, propagują aktywację NF-κB, ale sygnał odbywa się za pośrednictwem kaskady zależnej od MYD88 / IRAK. Niemniej jednak to, czy MALT1 może przyczyniać się do sygnalizacji TLR-4, pozostaje niejasne. Ostatnie dowody dotyczące MLT-827, silnego i selektywnego inhibitora aktywności parakaspazy MALT1, wskazują, że produkcja TNF- za TLR-4 w ludzkich komórkach szpikowych jest niezależna od MALT1, w przeciwieństwie do produkcji TNF za dektyną-1, która jest zależna od MALT1. W tym miejscu zajęliśmy się selektywnym zaangażowaniem MALT1 w dalsze wykrywanie rozpoznawania wzorców, wykorzystując różnorodne preparaty komórkowe dla ludzi i myszy oraz stymulację szlaków Dectin-1, MINCLE lub TLR-4. Dostarczyliśmy również dodatkowych informacji, badając cytokiny poza TNF- i porównując MLT-827 z inhibitorem SYK (Cpd11) i inhibitorem IKK (AFN700). Podsumowując, dane dostarczyły dalszych dowodów na zależność od MALT1 receptora lektynopodobnego typu C — sygnalizacji w przeciwieństwie do sygnalizacji TLR.
Wprowadzenie
Aktywność parakaspazy MALT1 (Mucosa-associated lymphoid tissue translocation protein 1) została ujawniona w 2008 roku1,2. Od tego czasu wiele badań wykazało jego krytyczny wkład w odpowiedzi receptorów antygenowych w limfocytach. Modele genetyczne u myszy, a także dane farmakologiczne potwierdzają kluczową rolę w limfocytach T, w autoimmunizacji zależnej od limfocytów T oraz w ustawieniach chłoniaka z komórek B3,4. W limfocytach aktywacja parakaspazy MALT1 następuje po złożeniu kompleksu CARD11-BCL10-MALT1 5, co jest wyzwalane p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i standardami Komitetu Etyki Badań Naukowych na Ludziach Novartis.
1. Przygotowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) z ludzkich płaszczy buffy
UWAGA: Otrzymaliśmy kożuchy od zdrowych ochotników dzień po pobraniu, w workach o pojemności 50 ml. Zostały one dostarczone za świadomą zgodą i zebrane za pośrednictwem Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Poradziliśmy sobie z nimi zgodnie z poniższą procedurą, w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej.
- Przygotuj sterylne i czyste nożycz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W komórkach mieloidalnych MALT1 przekazuje sygnały aktywacji w dół kaskady kilku receptorów podobnych do lektyn typu C, takich jak Dectin-1, Dectin-2 oraz MINCLE6. Ścieżki te opierają się na receptorach zawierających motyw (hem)ITAM (np., Dectin-1) lub koreceptorach zawierających motyw ITAM (np., FcRγ dla Dectin-2 i MINCLE), które rekrutują i aktywują kinazę SYK (Rysunek 1). Prowadzi to do aktywacji izoformy kinazy bi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tej pracy wykorzystaliśmy proste warunki eksperymentalne do zbadania szlaków sygnałowych w wrodzonych komórkach ludzkich i mysich oraz zbadania ich zależności od funkcji proteolitycznej MALT1. Rozszerzając poprzednią pracę11, nasze badanie wykazało, że aktywność parakaspazy MALT1 kontroluje produkcję cytokin indukowanych przez receptor lektynopodobny typu C, w tym TNF-α. Natomiast indukowany przez TLR-4 TNF-α był niezależny od MALT1 u obu gatunków. Podsumowując, dane te potwierdziły kluczowy i s.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Elsevier za upoważnienie (numer licencji 4334770630127) do reprodukcji tutaj Rysunku 2A od Unterreiner et al. (2017).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100 &mikro; m nylonowe sitko do komórek | Sigma | CLS431752 | |
| 14 ml Probówka Falcon | BD Falcon | 352057 | |
| 15 ml Falcon probówka Falcon | 352090 | ||
| 50 ml Falcon probówka | Falcon | 352070 | |
| Płytki 6-dołkowe | Costar | 3516 | |
| 96-dołkowa płaska płytka z pokrywką o niskim parowaniu | Costar | 3595 | |
| 96-dołkowa płytka dolna w kształcie litery V | Costar | 734-1798 | |
| Chlorek amonu - NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Rozcieńczalnik do oznaczania RD1-W ELISA | R& D | 895038 | Rozcieńczalnik do oznaczania |
| Mikropłytka do hodowli komórkowych, 384 dołki, | Greiner | 781986 | |
| Zubożony Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | teraz: tlrl-zyd |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Dihydrat soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego |
| Test ELISA muTNF-α | R& D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| probówki gentleMACS C | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| dysocjator gentleMACS | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis-inaktywowana | ||
| termicznie płodowa surowica bydlęca | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| Hhrf Bufor do rekonstytucji | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Bufor fosforanowy, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2% BSA |
| IFN-γ | R& D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis-Isoflurane | ||
| Abbott | Forene | ||
| Lipopolisacharydy (LPS) | Sigma | L4391 | LPS stosowany w próbkach ludzkich |
| Lipopolisacharydy | Sigma | L4516 | LPS stosowany w próbkach mysich |
| Bufor do lizy | Własnej produkcji | - 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4 | |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well biały | Zestaw wzbogacający Greiner | ||
| Monocytes | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1° C Pojemnik do zamrażania | Nalgene | 5100-0001 | urządzenie chłodzące (zawierające Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Sól fizjologiczna buforowana fosforanami |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Wodorowęglan potasu - KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Roztwór resazuryny do oceny żywotności |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Bufor odczytu | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Bufor na bazie trisu zawierający tripropyloaminę |
| Regeneracja pożywki do zamrażania kultur komórkowych | Gibco | 12648-010 | pożywka do zamrażania |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) z Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS dla iMoDCs + 10% FBS + 1 mM pirogronianu sodu + 100 U/ml Pen / Strep + 5 & mikro; M β-merkaptoetanol dla ludzkich PBMC i monocytów + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &mikro; M β-merkaptoetanol do mysich splenocytów |
| Bufor separacyjny | Własnoręcznie wykonany | PBS pH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0 | |
| Pirogronian sodu | Gibco | 11360 | |
| Trehalozo-6,6-dibehenian | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polisorbat 20 |
| UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | 15675 | Kwas etylenodiaminotetraoctowy |
| Uszczelniacz Viewseal | Greiner BioOne | 676070 | |
| Panel prozapalny V-PLEX 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | elektrochemioluminescencyjny test multipleksowy (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Merkaptoetanol | Gibco | 31350 |
Bibliografia
- Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
- Rebeaud, F., et al. The pr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
