Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58439

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Autoimmunity, Transplantation and Inflammation, Novartis Institutes for BioMedical Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

MALT1 reguluje wrodzoną odporność, ale jak to się dzieje, pozostaje niejasne. Użyliśmy selektywnego inhibitora parakaspazy MALT1 MLT-827, aby rozwikłać wkład MALT1 w sygnalizację wrodzoną za receptorami lektynopodobnymi Toll lub typu C, wykazując, że MALT1 reguluje produkcję cytokin szpikowych i za receptorami lektynopodobnymi typu C, selektywnie.

Streszczenie

Oprócz swojej funkcji w komórkach limfoidalnych, która została opisana w licznych badaniach, parakaspaza MALT1 odgrywa również ważną rolę w komórkach wrodzonych poniżej receptorów rozpoznawania wzorców. Najlepiej zbadane są dektyna-1 i dektyna-2 z rodziny receptorów lektynopodobnych typu C, które indukują kaskadę sygnalizacyjną zależną od SYK i CARD9, prowadzącą do aktywacji NF-κB, w sposób zależny od MALT1. Natomiast receptory Toll-podobne (TLR), takie jak TLR-4, propagują aktywację NF-κB, ale sygnał odbywa się za pośrednictwem kaskady zależnej od MYD88 / IRAK. Niemniej jednak to, czy MALT1 może przyczyniać się do sygnalizacji TLR-4, pozostaje niejasne. Ostatnie dowody dotyczące MLT-827, silnego i selektywnego inhibitora aktywności parakaspazy MALT1, wskazują, że produkcja TNF- za TLR-4 w ludzkich komórkach szpikowych jest niezależna od MALT1, w przeciwieństwie do produkcji TNF za dektyną-1, która jest zależna od MALT1. W tym miejscu zajęliśmy się selektywnym zaangażowaniem MALT1 w dalsze wykrywanie rozpoznawania wzorców, wykorzystując różnorodne preparaty komórkowe dla ludzi i myszy oraz stymulację szlaków Dectin-1, MINCLE lub TLR-4. Dostarczyliśmy również dodatkowych informacji, badając cytokiny poza TNF- i porównując MLT-827 z inhibitorem SYK (Cpd11) i inhibitorem IKK (AFN700). Podsumowując, dane dostarczyły dalszych dowodów na zależność od MALT1 receptora lektynopodobnego typu C — sygnalizacji w przeciwieństwie do sygnalizacji TLR.

Wprowadzenie

Aktywność parakaspazy MALT1 (Mucosa-associated lymphoid tissue translocation protein 1) została ujawniona w 2008 roku1,2. Od tego czasu wiele badań wykazało jego krytyczny wkład w odpowiedzi receptorów antygenowych w limfocytach. Modele genetyczne u myszy, a także dane farmakologiczne potwierdzają kluczową rolę w limfocytach T, w autoimmunizacji zależnej od limfocytów T oraz w ustawieniach chłoniaka z komórek B3,4. W limfocytach aktywacja parakaspazy MALT1 następuje po złożeniu kompleksu CARD11-BCL10-MALT1 5, co jest wyzwalane przez proksymalną sygnalizację receptora antygenu za receptorem komórek T lub B. Istnieje również wiele dowodów na to, że podobny kompleks CARD9-BCL10-MALT1 jest ważny dla propagacji sygnałów poniżej receptorów lektynopodobnych typu C (CLLR), np. Dectin-1, Dectin-2 i MINCLE w komórkach szpikowych6,7. Dectin-1 został szczególnie dobrze przebadany, ponieważ szlak ten ma kluczowe znaczenie dla obrony gospodarza przed infekcjami grzybiczymi8,9. Implikacja MALT1 w szlakach receptorów toll-podobnych (TLR) pozostaje jednak kontrowersyjna10. Ostatnie dowody w ludzkich komórkach szpikowych wykluczyły bezpośrednią rolę aktywności parakaspazy MALT1 w regulacji produkcji TNF- poniżej TLR-411.

W obecnej pracy wykorzystaliśmy różne ustawienia eksperymentalne i warunki stymulujące w ludzkich i mysich komórkach szpikowych, aby zbadać wrodzone szlaki sygnałowe, opierając się na specyficznych inhibitorach narzędzi farmakologicznych i pomiarze produkcji cytokin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i standardami Komitetu Etyki Badań Naukowych na Ludziach Novartis.

1. Przygotowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) z ludzkich płaszczy buffy

UWAGA: Otrzymaliśmy kożuchy od zdrowych ochotników dzień po pobraniu, w workach o pojemności 50 ml. Zostały one dostarczone za świadomą zgodą i zebrane za pośrednictwem Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Poradziliśmy sobie z nimi zgodnie z poniższą procedurą, w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej.

  1. Przygotuj sterylne i czyste nożyczki oraz zlewkę o pojemności 1 l z plastikową torbą (pod blaszką).
  2. Przenieś kożuszek do zlewki i ostrożnie otwórz go nożyczkami.
  3. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml dodać 100 ml buforowanego fosforanem buforu soli fizjologicznej/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (PBS/EDTA: PBS 1x pH 7,4 nie zawierającego CaCl2 i MgCl2, uzupełnionego 2 mM EDTA pH 8,0).
    UWAGA: Używając tej samej pipety i po powolnym pipetowaniu roztworu w górę i w dół, dozować 25 ml rozcieńczonej kożuchy do 6 stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, wstępnie napełnionych 15 ml gradientu gęstości na bazie polisacharydu.
  4. Wirować przez 20 minut przy 800 x g z umiarkowanym przyspieszeniem (ustawionym na 4 z 9) i bez hamulca, aby umożliwić oddzielenie komórek na podstawie ich gęstości.
    UWAGA: Po odwirowaniu widoczne będą trzy warstwy; otoczka zawierająca krwinki czerwone i granulocyty, górna warstwa wykonana z osocza, a pomiędzy nią biały pierścień zawierający komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC).
  5. Pobrać pierścień PBMC za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść do nowych probówek o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Zwykle wymagane są dwie do trzech probówek o pojemności 50 ml na płaszcz kożuchowy. Na tym etapie część osocza prawdopodobnie zanieczyszcza pobrane PBMC, co nie powinno mieć wpływu na kolejne etapy wzbogacania.
  6. Uzupełnij do 50 ml każdej probówki za pomocą PBS/EDTA i przejdź do trzech kolejnych płukań ze zmniejszającym się czasem i prędkością wirowania (15 min przy 520 x g, 10 min przy 330 x g, 8 min przy 150 x g).
    UWAGA: Na każdym etapie supernatant wylewa się do pojemnika na odpady płynne, a osad komórkowy zawiesza się ponownie w 50 ml PBS/EDTA (granulki mogą być łączone po pierwszym przemyciu).
  7. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić osad w 25 ml lodowatego buforu do lizy (patrz Tabela Materiałów) w celu lizy czerwonych krwinek za pomocą ciśnienia osmotycznego.
  8. Inkubować, aż roztwór stanie się klarowny (≤5 min w temperaturze pokojowej).
  9. Zatrzymać reakcję, dodając 25 ml buforu separacyjnego (PBS 1x pH 7,4 nie zawierający CaCl2 i MgCl2, uzupełniony 2% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1 mM EDTA pH 8,0).
  10. Prać jeszcze raz w 150 x g przez 8 min.
    UWAGA: Na tym etapie PBMC mogą być wykorzystane jako populacja masowa (patrz krok 3: Leczenie PBMC i monocytami oraz warunki stymulujące) lub przetworzone w celu wzbogacenia monocytów (patrz krok 2: Przygotowanie monocytów z PBMC) lub zamrożone do późniejszego wykorzystania (patrz krok 5: Procedury zamrażania/rozmrażania monocytów i PBMC).

2. Przygotowanie monocytów z PBMC

  1. Ponownie zawiesić PBMC otrzymane na kroku 1.10 w buforze separacyjnym i policzyć je, aby osiągnąć 5 x 107komórek/ml.
  2. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 14 ml z nakrętką.
  3. Dodać 50 μl koktajlu przeciwciał wzbogacających monocyty na ml zawiesiny komórkowej, wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Dodać 50 μl kulek wzbogacających monocyty na ml komórek.
    UWAGA: Kulki muszą być dokładnie zawirowane, aby zapewnić jednorodność zawiesiny.
  5. Po dodaniu kulek krótko zmieszać zawiesinę komórek i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przepłukać górną część probówki buforem separacyjnym, aż probówka zostanie napełniona do 10 ml.
  7. Powoli mieszać roztwór, pipetując w górę i w dół.
  8. Umieść rurkę bez nasadki w magnesie separacyjnym
    9. .
  9. Inkubować przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.
  10. Wlewać powoli do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  11. Na tym etapie należy użyć monocytów bezpośrednio (patrz krok 3: Leczenie PBMC i monocytów oraz warunki stymulujące) lub różnicować je w dojrzałe Cendrytyczne Cells pochodzące z Monocytów (iMoDCs) (patrz krok 4) lub zamrozić je do późniejszego użycia (patrz krok 5).

3. Leczenie PBMC i monocytów oraz warunki stymulujące

  1. Policz komórki i rozcieńcz je w pożywce hodowlanej (pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 10% FBS + 1 mM pirogronian sodu + 100 U/ml penicyliny Streptomycyna (Pen/Strep) + 5 μM β-merkaptoetanolu), do 1,25 x 104 komórki/studzienkę.
  2. Rozprowadzić 30 μl zawiesiny komórek na dołek płytki 384-dołkowej.
  3. Dodać 15 μl 4x stężonych roztworów związków i wstępnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Dodać lipopolisacharyd (LPS) do końcowego stężenia 10 ng/ml lub zubożony zymosan (DZ) do końcowego stężenia 100 μg/ml lub przechowywać w zwykłym podłożu.
  5. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  6. Pobrać 10 μl supernatantu, aby zmierzyć poziom wydzielanego TNF-a (patrz krok 7: Pomiary cytokin i żywotności).

4. Różnicowanie monocytów w iMoDC i warunki stymulujące

  1. Policz monocyty (wzbogacone w kroku 2) i odwiruj zawiesinę komórkową o stężeniu 520 x g przez 5 minut.
  2. Odpipetować supernatant i dodać pożywkę hodowlaną (RPMI+ 10% FBS, aby uzyskać końcową zawiesinę komórek 0,4 x 106 komórek/ml.
  3. Dodać 80 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF.
  4. Dozować 5 ml zawiesiny komórek na dołek do płytki 6-dołkowej.
  5. Inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  6. W 7 dniu należy pobrać komórki, delikatnie pipetując, aby uniknąć ich aktywacji.
  7. Wirować przy 520 x g przez 5 min.
  8. Odsysać próżniowo i ponownie zawiesić w 50 ml pożywki hodowlanej bez czynników wzrostu.
  9. Wirować przy 520 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w pożywce hodowlanej.
  10. Dozować 100 μl zawiesiny komórek (10-5 komórek) na dołek 96-dołkowej płytki o płaskim dnie.
  11. Wstępną inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C po dodaniu 50 μl 4x stężonych roztworów złożonych, przygotowanych zgodnie z opisem w kroku 8: Przygotowanie związków.
  12. Dodaj 50 μl bodźców (4x skoncentrowanych), przygotowanych zgodnie z opisem w kroku 9.
  13. Inkubować 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  14. Wymieszaj każdą studzienkę i przenieś komórki i supernatant (SN) do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
  15. Wirować z prędkością 475 x g przez 5 minut.
  16. Przenieść supernatant do nowej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem, uszczelnić i zamrozić w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

5. Procedury zamrażania/rozmrażania monocytów i PBMC

  1. mrożenie
    1. Odkręcać preparaty PBMC lub komórek monocytów w dawce 520 x g przez 5 minut.
    2. Odessać próżniowo supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej o stężeniu 1 x 107 komórek/ml.
    3. Dozować 1 ml zawiesiny komórek do krioprobówek, przenieść probówki do specjalnego urządzenia chłodzącego (patrz tabela materiałów) i umieścić je w temperaturze -80 °C.
  2. rozmrażanie
    1. Rozmrozić krioprobówkę i szybko przenieść jej zawartość do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml pożywki hodowlanej.
    2. Wirować przy 520 x g przez 5 min.
    3. Odessać próżniowo supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki hodowlanej. Komórki są teraz gotowe do dalszego przetwarzania eksperymentalnego.

6. Przygotowanie i leczenie mysich komórek śledziony

UWAGA: Przeprowadziliśmy składanie ofiar ze zwierząt zgodnie z wytycznymi i standardami Organizacji Dobrostanu Zwierząt Novartis. Badania zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Regionalnego Organu Samorządowego (Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). Składaliśmy zwierzęta w ofierze z powodu nadmiernej ekspozycji na izofluran, przy czym dołożyliśmy wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie.

  1. Zbierz śledzionę i zdysocjuj tkankę za pomocą rurki wyposażonej w mechaniczne urządzenie do rozdrabniania tkanek i wypełnionej 5 ml zimnego podłoża RPMI.
  2. Użyj programu śledziony maszyny dysocjującej, aby zmielić narządy.
  3. Przefiltruj komórki przez nylonowe sitko o średnicy 100 mm.
  4. Przenieść zawiesinę do probówek o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 320 x g.
  5. Odessać próżniowo supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 3 ml lodowatego buforu do lizy i inkubować przez ≤2 minuty na lodzie.
  6. Zatrzymaj lizę, dodając 7 ml pożywki RPMI.
  7. Przefiltruj ponownie przez sitko z nylonu o średnicy 100 μm.
  8. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 330 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Odsysanie próżniowe supernatantu i ponowne zawieszanie komórek przy 11 x 106 komórek/ml w kompletnym pożywce (RPMI uzupełnione 10% FBS, 100 U/ml Pen/Step i 5 μM β-merkaptoetanolu).
  10. Płytka 1 x 106 komórek/basenik (90 μl) w płytce 96-dołkowej (płaskie dno).
  11. Dodać 5 μl 20x stężonego roztworu złożonego uprzednio rozcieńczonego w pożywce RPMI, jak opisano w kroku 8.3: Seryjne rozcieńczanie dla mysich komórek śledziony.
  12. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  13. Dodać 5 μL 20x stężonego DZ (stężenie końcowe 30 μg/ml) lub 20x stężonego LPS + IFN-g (TLR-4) (stężenie końcowe 1 μM LPS i 10 ng/ml IFN-g).
  14. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  15. Wirować przy 330 x g przez 10 min.
  16. Przenieść supernatanty do nowych płytek, uszczelnić i zamrozić w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

7. Pomiary cytokin i żywotności

  1. Pomiar ludzkiego TNF-a za pomocą HTRF (jednorodna fluorescencja w czasie rozdzielczym)
    UWAGA: Protokół był zgodny z zaleceniami dostawcy, które pokrótce podsumowano poniżej.
    1. Zmieszać 1 objętość odczynnika (anty TNF-a-kryptat i anty-TNF-a-XL665) z 19 objętościami buforu do rozpuszczenia (50 mM buforu fosforanowego o pH 7,0, 0,8 M fluorku potasu (KF), 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)).
    2. Wymieszaj dwa gotowe do użycia roztwory przeciwciał w stosunku 1:1 tuż przed dozowaniem odczynników.
    3. Dozować 10 μl supernatantów z kroku 3.6 do białych płytek 384-dołkowych.
    4. Dozować 10 μl mieszaniny przeciwciał.
    5. Przykryć płytkę zgrzewarką i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Odczyt płytki na czytniku mikropłytek (50–200 flash).
  2. Pomiar ludzkiej IL-23 za pomocą HTRF (jednorodna fluorescencja w czasie rozdzielczym)
    UWAGA: Protokół był zgodny z zaleceniami dostawcy, które pokrótce podsumowano poniżej.
    1. Wymieszać jedną objętość odczynnika (przeciwciało anty kryptan IL-23 i przeciwciało anty-IL-23 D2) z 19 objętościami buforu detekcyjnego #3.
    2. Wymieszaj dwa gotowe do użycia roztwory przeciwciał w stosunku 1:1 tuż przed dozowaniem odczynników.
    3. Dozować 10 μl supernatantów z kroku 3.6 do białych płytek 384-dołkowych.
    4. Dozować 10 μl mieszaniny przeciwciał.
    5. Przykryć płytkę zgrzewarką i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Odczyt płytki na czytniku mikropłytek (błysk 50–200 nm).
  3. Pomiary IL-6, IL-8, IL-1β i TNF-α u ludzi metodą elektrochemiluminescencji
    UWAGA: Wszystkie próbki rozcieńczono w stosunku 1/150 w rozcieńczalniku 2 (pierwsze rozcieńczenie: 10 μl w 150 μl, następnie 20 μl w 180 μl). Protokół był zgodny z zaleceniami dostawcy:
    1. Rozcieńczyć próbki i wzorzec w rozcieńczalniku 2.
    2. Przystąpić do rozcieńczania wzorca w rozcieńczalniku 2, stosując rozcieńczenie 1/4 krotności seryjnej.
    3. Umyj talerze trzykrotnie buforem do mycia.
    4. Dozować 50 μl próbek lub wzorca do studzienki.
    5. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
    6. Umyj płytkę czterokrotnie PBS + 0,05% Polysorbate 20.
    7. Dodać 25 μl przeciwciała wykrywającego (60 μl każdego przeciwciała na 3 ml końcowe) w rozcieńczalniku 3.
    8. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
    9. Umyj płytkę czterokrotnie PBS + 0,05% Polysorbate 20.
    10. Unikając pęcherzyków, dodać 150 μl na studzienkę buforu do odczytu (bufor na bazie Tris zawierający tripropyloaminę, rozcieńczony 2x w ddH20) jako koreagent do wytwarzania światła w testach immunologicznych elektrochemiluminescencji.
    11. Odczytaj tabliczkę (bez opóźnień) na czytniku płytek multipleksowych.
  4. Mysi pomiar TNF-a metodą ELISA zgodnie z protokołem dostawcy
    1. Rozcieńczyć supernatant w stosunku 1:1 w rozcieńczalniku do oznaczania (gotowy do użycia bufor zawierający białko).
      1. Przygotować odczynniki, próbki i roztwory wzorcowe zgodnie z opisem w zestawie. Dodać 50 μl rozcieńczalnika do oznaczania do każdej studzienki.
      2. Dodać 50 μl wzorca, próbki kontrolnej lub próbki do dołka.
    2. Mieszaj, delikatnie stukając w ramkę talerza przez 1 min.
    3. Przykryj dostarczonym paskiem samoprzylepnym i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    4. Odessać każdą studzienkę i przemyć 400 μl/studzienkę (powtórzyć ten krok w sumie pięć razy).
    5. Po ostatnim umyciu usuń pozostały bufor do płukania przez zasysanie.
    6. Odwróć talerz i osusz go czystymi ręcznikami papierowymi.
    7. Dodać 100 μl mysiego koniugatu TNF-α do każdej studzienki. Przykryj nowym paskiem samoprzylepnym.
    8. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    9. Powtórzyć aspirację/mycie jak w kroku 7.4.4.
    10. Dodać 100 μl roztworu substratu do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    11. Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu kwasu solnego (roztwór zatrzymujący) do każdej studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
    12. Zmierzyć gęstość optyczną przy 450 nm (przy długości fali korekcyjnej ustawionej na 560 nm) za pomocą czytnika mikropłytek (należy wykonać w ciągu 30 minut).
  5. Żywotność komórek
    1. Po usunięciu supernatantów z preparatów PBMC lub monocytów należy ocenić żywotność komórek za pomocą gotowego do użycia roztworu resazuryny (wskaźnik utleniania-redukcji) dodawanego bezpośrednio do zawiesiny komórkowej do 10% stężenia końcowego.
    2. Inkubować przez 1–2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Odczyt fluorescencji przy długości fali 590 nm (wzbudzenie 540 nm) za pomocą czytnika mikropłytek.

8. Przygotowanie mieszanki

  1. Seryjne rozcieńczanie dla iMoDC
    1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy MLT-827 (10 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO) do pożywki, aby osiągnąć 8 μM za jednym razem (4x skoncentrowany).
    2. Wykonaj sześcioetapowe seryjne rozcieńczanie 1:5, używając pożywki + 0,08% DMSO. Użyj tego samego roztworu + 0,08% DMSO dla stanu pojazdu (bez związku).
  2. Badanie pojedynczej dawki w kierunku iMoDC
    1. Rozcieńczyć roztwory podstawowe MLT-827, AFN700 i Cpd11 do podłoża, aby osiągnąć 4 μM za jednym razem (4x stężone).
  3. Seryjne rozcieńczanie dla mysich komórek śledziony
    1. Rozcieńczyć 10 μM roztwór MLT-827 (otrzymany z 10 mM roztworu podstawowego po jednokrotnym rozcieńczeniu w pożywce) do 0,01 μM, o końcowym stężeniu DMSO 0,1%.
    2. Do etapów rozcieńczania należy pobrać 2 μl każdego rozcieńczenia, dodać 38 μl RPMI i odpipetować 5 μl do studzienki.
      UWAGA: Wszystkie zabiegi wykonywane są w trzech egzemplarzach.

9. Przygotowanie bodźców

  1. Zubożony zymosan (DZ)
    1. Dodaj 2 ml sterylnej wody wolnej od endotoksyn do 10 mg DZ.
    2. Wirować w celu homogenizacji roztworu podstawowego, wirować również przed każdym użyciem.
    3. Podwielokrotność roztworu i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
  2. Trehalozo-6,6-dibehenian (TDB)
    1. Dodać 100 μl DMSO do 1 mg TDB, podgrzewać w temperaturze 60 °C w łaźni wodnej przez 15–30 s.
    2. Zwirować i natychmiast dodać 900 μl sterylnego PBS, ponownie wirować.
    3. Podgrzewać przez 10–15 minut w temperaturze 60 °C i homogenizować przez wirowanie przed każdym użyciem.
    4. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Wykonać seryjne rozcieńczenia i przygotowanie pojedynczej dawki jak w przypadku związku MLT-827.
      UWAGA: Ponieważ TDB musi być przygotowany w DMSO, końcowe stężenie 1% DMSO jest obecne podczas stymulacji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W komórkach mieloidalnych MALT1 przekazuje sygnały aktywacji w dół kaskady kilku receptorów podobnych do lektyn typu C, takich jak Dectin-1, Dectin-2 oraz MINCLE6. Ścieżki te opierają się na receptorach zawierających motyw (hem)ITAM (np., Dectin-1) lub koreceptorach zawierających motyw ITAM (np., FcRγ dla Dectin-2 i MINCLE), które rekrutują i aktywują kinazę SYK (Rysunek 1). Prowadzi to do aktywacji izoformy kinazy bi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tej pracy wykorzystaliśmy proste warunki eksperymentalne do zbadania szlaków sygnałowych w wrodzonych komórkach ludzkich i mysich oraz zbadania ich zależności od funkcji proteolitycznej MALT1. Rozszerzając poprzednią pracę11, nasze badanie wykazało, że aktywność parakaspazy MALT1 kontroluje produkcję cytokin indukowanych przez receptor lektynopodobny typu C, w tym TNF-α. Natomiast indukowany przez TLR-4 TNF-α był niezależny od MALT1 u obu gatunków. Podsumowując, dane te potwierdziły kluczowy i s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Elsevier za upoważnienie (numer licencji 4334770630127) do reprodukcji tutaj Rysunku 2A od Unterreiner et al. (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 &mikro; m nylonowe sitko do komórekSigmaCLS431752
14 ml Probówka FalconBD Falcon352057
15 ml Falcon probówka Falcon352090
50 ml Falcon probówkaFalcon352070
Płytki 6-dołkoweCostar3516
96-dołkowa płaska płytka z pokrywką o niskim parowaniuCostar3595
96-dołkowa płytka dolna w kształcie litery VCostar734-1798
Chlorek amonu - NH4ClSigmaA9434
Rozcieńczalnik do oznaczania RD1-W ELISAR& D895038Rozcieńczalnik do oznaczania
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 384 dołki,Greiner781986
Zubożony ZymosanInvivogentlrl-dznteraz: tlrl-zyd
DimetylosulfotlenekSigmaD2650DMSO
EDTA-Na2SigmaE5134Dihydrat soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego
Test ELISA muTNF-αR& DSMTA00
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
probówki gentleMACS CMACS Miltenyi Biotec130-096-334
dysocjator gentleMACSMACS Miltenyi Biotec130-093-235
GM-CSFNovartis-inaktywowana
termicznie płodowa surowica bydlęcaGibco10082FBS
HTRF hu IL-23CisBio62HIL23PEG
HTRF hu TNF-αCisBio62TNFPEC
Hhrf Bufor do rekonstytucjiCisBio62RB3RDE50mM Bufor fosforanowy, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2% BSA
IFN-γR& DL4516
IL-4Novartis-Isoflurane
AbbottForene
Lipopolisacharydy (LPS)SigmaL4391LPS stosowany w próbkach ludzkich
LipopolisacharydySigmaL4516LPS stosowany w próbkach mysich
Bufor do lizyWłasnej produkcji- 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4
MagnetStemcell18001
Microplate, 384 well białyZestaw wzbogacający Greiner
MonocytesStemcell19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1° C Pojemnik do zamrażaniaNalgene5100-0001urządzenie chłodzące (zawierające Propanol-2)
PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2 [-] MgCl2Gibco10010Sól fizjologiczna buforowana fosforanami
Penicylina/StreptomycynaGibco15140Pen/Strep
Wodorowęglan potasu - KHCO3SigmaP9144
PrestoBlueInvitrogenA13262Roztwór resazuryny do oceny żywotności
Propanol-2Merck1.09634
Bufor odczytuMesoScale DiscoveryR92TC-3Bufor na bazie trisu zawierający tripropyloaminę
Regeneracja pożywki do zamrażania kultur komórkowychGibco12648-010pożywka do zamrażania
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) z GlutamaxGibco61870+ 10% FBS dla iMoDCs
+ 10% FBS + 1 mM pirogronianu sodu + 100 U/ml Pen / Strep + 5 & mikro; M β-merkaptoetanol dla ludzkich PBMC i monocytów
+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &mikro; M β-merkaptoetanol do mysich splenocytów
Bufor separacyjnyWłasnoręcznie wykonanyPBS pH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0
Pirogronian soduGibco11360
Trehalozo-6,6-dibehenianInvivogentlrl-tdbTDB
Tween 20SigmaP7949Polisorbat 20
UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0Invitrogen15675Kwas etylenodiaminotetraoctowy
Uszczelniacz ViewsealGreiner BioOne676070
Panel prozapalny V-PLEX 1 Human KitMesoScale DiscoveryK15049Delektrochemioluminescencyjny test multipleksowy (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8)
β-MerkaptoetanolGibco31350
784075

Bibliografia

  1. Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
  2. Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).
  3. Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).
  4. Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).
  5. Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).
  6. Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).
  7. Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
  8. Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).
  9. Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).
  10. Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).
  11. Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. , 48-51 (2017).
  12. Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).
  13. Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).
  14. Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).
  15. Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).
  16. Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).
  17. Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).
  18. Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).
  19. Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6(2011).
  20. Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. , In press (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Szlak Dectin-1sygnalizacja TLR-4inhibitor SYK Cpd11inhibitor IKK AFN700związek MLT-827monocyty krwi obwodowejpomiar TNF alfaprotokół rozcieńczeń seryjnych
Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.