Wizualizacja skuteczności pestycydów przeciwko komarom wektorom chorób w terenie

Podsumowanie

Skuteczność pestycydów zdrowia publicznego przeciwko uciążliwym owadom i wektorom chorób nie jest jednakowa w różnych strefach ekologicznych. W tym miejscu przedstawiamy system technik wykorzystujących owady wektory żyjące w niewoli jako strażników skuteczności pestycydów w celu uzyskania elektronicznych map wspierających standardową ocenę pestycydów w wielu środowiskach.

Streszczenie

Skuteczność pestycydów zdrowia publicznego przeciwko uciążliwym owadom i wektorom chorób, takim jak komary, muchy piaskowe i muchy rozmnażające brud, nie jest jednakowa we wszystkich strefach ekologicznych. Aby jak najlepiej chronić zdrowie publiczne i weterynaryjne przed tymi owadami, należy zbadać ograniczenia środowiskowe pestycydów w celu uzyskania informacji na temat skutecznego stosowania najodpowiedniejszych preparatów i technik pestycydów. Opracowaliśmy program badawczy w celu oceny kombinacji pestycydów, sprzętu do stosowania pestycydów i technik aplikacji w gorących, suchych i wilgotnych lokalizacjach tropikalnych, ciepłych i chłodnych umiarkowanych oraz w miastach, aby uzyskać wytyczne dotyczące stosowania pestycydów specyficzne dla docelowych owadów i środowiska. W tym celu zaprojektowaliśmy system protokołów, które wspierają wydajną, opłacalną, przenośną i ustandaryzowaną ocenę różnorodnej gamy pestycydów i sprzętu w wielu środowiskach. U podstaw tych protokołów leży wykorzystanie szeregu małych klatek z hodowanymi w koloniach komarami wskaźnikowymi (dorosłymi i niedojrzałymi) oraz muchami piaskowymi (dorosłe), strategicznie rozmieszczonymi w naturalnych siedliskach i wystawionymi na opryskiwanie pestycydami. Przestrzenne i czasowe wzorce skuteczności pestycydów są wyprowadzane z procentowej śmiertelności w klatkach wskaźnikowych, a następnie mapowane i wizualizowane w systemie informacji geograficznej. Mapy śmiertelności wskaźnikowych mogą być porównywane statystycznie w celu oceny względnej skuteczności pestycydu w wielu środowiskach lub w celu zbadania wielu pestycydów w jednym środowisku. Protokoły mogą być modyfikowane w celu uwzględnienia różnych scenariuszy, w tym na przykład pionowej orientacji strażników w siedliskach koron drzew lub jednoczesnego testowania metod aplikacji naziemnej i powietrznej.

Wprowadzenie

Skuteczność pestycydów zdrowia publicznego przeciwko uciążliwym i chorobotwórczym owadom, takim jak komary, muchy piaskowe i muchy rozmnażające brud, nie jest jednakowa w pustynnych, tropikalnych, umiarkowanych lub miejskich strefach ekologicznych¹. Niektóre kluczowe gatunki w tych trzech grupach owadów są ważnymi wektorami pasożytów, wirusów, robaków filarialnych i bakterii, które powodują poważne choroby u ludzi, zwierząt domowych i zwierząt gospodarskich na całym świecie. W celu jak najlepszej ochrony zdrowia publicznego i weterynaryjnego należy zbadać ograniczenia środowiskowe pestycydów w celu uzyskania informacji na temat skutecznego stosowania najwłaściwszych form i technik stosowania pestycydów. Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska nie wymaga od producentów pestycydów w zakresie zdrowia publicznego określania oczekiwanej skuteczności preparatu w różnych środowiskach lub docelowych owadach, jednak pestycydy te są stosowane do zwalczania komarów i wektorów w wielu strefach ekologicznych w USA i na całym świecie.

Opracowaliśmy program badawczy do oceny licznych kombinacji pestycydów oraz sprzętu i technik do ich stosowania na gorących i suchych pustyniach, gorąco-wilgotnych tropikach, ciepłych i chłodnych strefach umiarkowanych oraz miejskich, w celu opracowania wytycznych dotyczących stosowania pestycydów specyficznych dla docelowego owada i środowiska¹. W tym programie oceniamy pestycydy, które są ukierunkowane na dorosłe stadia komarów i much piaskowych (dorosłe środki zapobiegawcze) oraz niedojrzałe stadia komarów (larwobójcze) przy użyciu sprzętu do aplikacji pestycydów, który jest przenoszony ręcznie, montowany na ciężarówce lub samolocie i instalowany w stałych miejscach. Następnie oceniane są cztery główne techniki stosowania pestycydów na zewnątrz: (1) rozpylanie w aerozolu o bardzo małej objętości (ULV) lub mgły termicznej w przestrzeni z doroscydami przeznaczonymi do szybkiego powalania docelowych owadów, (2) wariant pierwszej techniki, w której płynne larwicydy są stosowane z ULV lub mgłą termiczną w celu krótko- lub długoterminowego stłumienia niedojrzałych stadiów docelowych owadów, (3) rozpylanie zamgławiające w określonym czasie z ustalonych miejsc, przeznaczone do odstraszania lub zabijania, oraz (4) rozpylacze zimną mgłą o małej objętości (LV) pozostałości pestycydów, przeznaczone do nakładania długotrwałych powłok toksycznych lub odstraszających na różne podłoża naturalne lub sztuczne. Przedstawiono tu szczegółowe metody prowadzenia technik (1) i (2) wymienionych powyżej. Metody dla (3) zostaną przedstawione w oddzielnych badaniach, a techniki w (4) są opisane pokrótce we wcześniejszych publikacjach^2,3,4.

Aby zrealizować ten złożony program badawczy, zaprojektowaliśmy system protokołów wspierających efektywną, opłacalną, przenośną i powtarzalną/standaryzowaną ocenę technik dorosłobójczych i larwobójczych aerozoli z różnymi kombinacjami pestycydów/sprzętu w wielu środowiskach. U podstaw tych protokołów leży wykorzystanie komarów wskaźnikowych hodowanych w koloniach (dorosłych i niedojrzałych) oraz much piaskowych (dorosłych) w celu wskazania przestrzennych i czasowych wzorców skuteczności pestycydów. W przypadku stosowania środków przeciw dorosłobójcom dorosłe komary wskaźnikowe lub muchy piaskowe są umieszczane w małych jednorazowych klatkach rozmieszczonych w ustrukturyzowanych układach na obszarze docelowym i w nieleczonym obszarze kontrolnym. W przypadku zastosowań larwicydowych małe jednorazowe kubki są podobnie rozprowadzane do zbierania rozpylonych kropelek larwicydów w celu późniejszego wprowadzenia wody i niedojrzałych komarów hodowanych w koloniach wskaźnikowych. Następnie rejestrujemy procentową śmiertelność w klatkach wskaźnikowych lub procentowy rozwój dorosłych osobników w kubkach wskaźnikowych w określonych odstępach czasu po oprysku i wykorzystujemy te dane do tworzenia elektronicznych map skuteczności przestrzennej i czasowej w systemie informacji geograficznej (GIS), które można ilościowo porównywać między środowiskami.

Używanie klatek wartowniczych owadów hodowanych w koloniach do oceny skuteczności pestycydów w terenie jest od dawna praktykowaną praktyką^5,6, a używanie pustych plastikowych kubków strażniczych do zbierania rozpylonych larwobójców pojawia się w literaturze⁷. Jednak nasze elektroniczne mapowanie skuteczności w celu wizualizacji przestrzennych i czasowych wzorców śmiertelności jest innowacją, która znacznie usprawnia badanie śmiertelności, które w przeciwnym razie byłoby prezentowane w płaskich formatach tabelarycznych. Również system załadunku klatek o wysokiej przepustowości oraz modułowy system rozmieszczania klatek, który można dostosować do różnych opisanych tutaj scenariuszy, są unikalne dla naszego programu. Inne programy badawcze inaczej podchodzą do oceny stosowania pestycydów w terenie. Obecnie popularne metody obejmują przechwytywanie i analizowanie znakowanych barwnikiem kropelek pestycydów z oprysków w terenie na wirujących szkiełkach szkiełkowych⁸ lub acrylic rods⁹, co jest od dawna znanym procesem generującym dane, które można elektronicznie mapować i wizualizować.

Jedną z wad jest to, że pomiary wielkości kropel i gęstości z nośników zbierających są szacowane tylko na podstawie niewielkiej części całkowitej powierzchni zbierania, z programową mikroskopią pól widzenia, które są niestety bardzo subiektywne. Ponadto mapy rozmieszczenia i gęstości kropelek nie ilustrują w pełni skuteczności pestycydów, ponieważ zakłada się, że obecność progowej liczby kropel o określonej wielkości automatycznie wskazuje na śmiertelność owadów docelowych. To założenie nie uwzględnia śmiertelności spowodowanej parowaniem produktów z kropelek przepływających przez obszar docelowy, które mogą również powodować śmiertelność¹⁰, ani tego, że mniejsza liczba kropel lub inne rozmiary kropel mogą zabić pewną część docelowych osobników. Pierwotnym uzasadnieniem^10,11,12 jest to, że pestycyd w aerozolu jest przeznaczony do uderzania małych kropelek w aktywnie latające owady docelowe. Jednak nasze obserwacje w terenie, w tym zmniejszenie naturalnych populacji po oprysku, gdy owady docelowe nie latają aktywnie, sugerują, że kropelki lub produkty parowania z kropel docierają do celów, które nie latają, ale raczej są ukryte w refugiach spoczynkowych (dane niepublikowane z 2011 r.). Ponadto zaobserwowaliśmy w analizie aplikacji oprysków polowych (poprzez jednoczesne wychwytywanie kropel, wychwytywanie substancji czynnej pestycydów i klatki wskaźnikowe), że mapy rozmieszczenia kropel, rozmieszczenia substancji czynnych i śmiertelności nie są zgodne (dane niepublikowane z 2010 r.).

Innym popularnym podejściem do oceny skuteczności pestycydów jest rozmieszczanie klatek wartowniczych w siatce wyznaczonej na płaskim, jednorodnym polu bez przeszkód dla pióropusza pestycydu i w prawie idealnych warunkach meteorologicznych (np. stałe wiatry <10 mph i kierunek wiatru prostopadły do linii oprysku). Jeszcze inni podchodzą do tego, mierząc skuteczność za pomocą strażników umieszczonych w tunelach aerodynamicznych¹⁴. Podejścia te zapewniają jedną perspektywę skuteczności pestycydów, ale są mniej prawdopodobne, że osiągną skuteczność operacyjną w nieidealnych warunkach polowych (niejednorodne siedliska, które zawierają przeszkody w przepływie pestycydów i zmienne, jeśli nie w nieoptymalnych warunkach meteorologicznych). Poszukiwanie dowodów na poparcie absolutnej skuteczności nie jest realistyczne. Warunki pracy rzadko są idealne, a wybór preparatów na podstawie testów w tunelach aerodynamicznych lub bezpośredniego stosowania w parkach inżynieryjnych może być mylący.

W naszych badaniach korzystamy z naturalnych miejsc polowych i danych warunków meteorologicznych (ale nie w przypadku deszczu lub ekstremalnych wiatrów, które są poza granicami jakiegokolwiek programu operacyjnego). Jest to prawdopodobnie bardziej pouczające dla operacyjnej kontroli wektorów, gdy obserwuje się rozsądną skuteczność preparatu pestycydu pomimo złych warunków środowiskowych, niejednorodnego siedliska i przeszkód w przepływie pestycydów. W każdym przypadku, gdy jest to możliwe, zaleca się uzupełnienie danych dotyczących śmiertelności owadów wskaźnikowych o nadzór przed i po nadzorze nad naturalnymi populacjami owadów docelowych na obszarach poddanych działaniu środka i kontroli, jako pomost między kontrolowanym narażeniem a rzeczywistym narażeniem na pestycyd ogniskowy. Nadzór nad naturalnymi populacjami nie jest jednak wystarczający do ustalenia, czy stosowanie pestycydów powoduje śmiertelność w populacji docelowej, czy też docelowe owady rzeczywiście przemieszczają się z obszaru docelowego po wykryciu nadlatujących aerozoli pestycydów.

Niezależnie od zastrzeżeń do jakiejkolwiek oceny oprysków pestycydami na polu, elektroniczne mapowanie danych o śmiertelności w GIS (w przeciwieństwie do płaskiej prezentacji danych o śmiertelności w tabelach) zachowuje atrybuty ilościowe zdolne do rygorystycznego porównania między próbami, a także zapewnia środki do szybkiej, wizualnej oceny. Dzięki danym zebranym w systemie GIS naukowcy mogą ustawić progi skuteczności pestycydów i zwizualizować względną zdolność pestycydu ogniskowego w wielu środowiskach lub porównać możliwości wielu pestycydów w jednym środowisku w różnych urządzeniach i technikach aplikacji.

Protokół

Uwaga: Niniejszy protokół został opracowany specjalnie dla badań terenowych ukierunkowanych na dorosłe komary. Informacje na temat modyfikacji niezbędnych w przypadku osobników niedojrzałych, innych dorosłych gatunków owadów sentynelowych oraz scenariuszy szczególnych zawarto w dyskusji.

1. Hodowla owadów strażniczych i przygotowanie klatek strażniczych

1. Konstrukcja klatek dla dorosłych osobników strażniczych
   1. Określić całkowitą liczbę klatek strażniczych potrzebnych do badania polowego, uwzględniając obszary badawcze i kontrolne oraz planowaną liczbę powtórzeń, a następnie dodać 5% w celu zrekompensowania strat wynikających z uszkodzeń lub nietypowej śmiertelności (patrz krok 2.1). Przygotować kwadraty z siatki z tiulu o wymiarach 5 x 5 in (2 na każdą klatkę strażniczą), używając obrotowego noża dyskowego, liniały i deski do cięcia oraz beli tiulu. Przechowywać kwadraty z siatki z tiulu w partiach po 50 sztuk w strunowych workach plastikowych o pojemności 1 qt.
   2. Przygotować klatki strażnicze, ostrożnie wypychając płaskie tekturowe dno z nowych papierowych kubków do lodów o pojemności ½ pt, aby utworzyć otwarte cylindry o wymiarach 2 x 3 in. W przypadku każdego kubka usunąć tekturowe wkładki z 2 pokrywek, aby utworzyć otwarte pierścienie mocujące (po jednym na każdy koniec cylindra). Przymocować jeden kwadrat z siatki z tiulu do jednego końca cylindra, zakleszczając go pod pierścieniem mocującym w momencie ciasnego dopasowania pierścienia do cylindra.
   3. Do każdej klatki strażniczej przymocować opaskę rzepową do gumki recepturki, a następnie zabezpieczyć gumkę wokół zamontowanego pierścienia mocującego. Pakować klatki strażnicze w partiach po 50 sztuk, dołączając osobny worek zawierający 50 pierścieni mocujących oraz worek z 50 kwadratami z siatki z tiulu.
      Uwaga: Rozmiar oczek siatki z tiulu powinien być minimalną wielkością otworu pozwalającą na zatrzymanie konkretnego gatunku strażniczego umieszczonego w klatce. Na przykład komary Aedes aegypti będą wymagały mniejszego rozmiaru oczek niż komary Culex quinquefasciatus.

Rycina 1: Przygotowanie klatek strażniczych. (A) Przedstawiono dwóch pracowników ładujących klatki strażnicze znieczulonymi komarami rozłożonymi na dużym białym arkuszu papieru. Należy zwrócić uwagę na stos kwadratów z siatki tiulowej na pierwszym planie, gotowych do umieszczenia na otwartych klatkach strażniczych. (B) Przedstawiono kilka załadowanych klatek strażniczych, oczekujących na umieszczenie wacików z 10% sacharozą i ponowne naciągnięcie gumki recepturki. (C) Przedstawiono klatki strażnicze w lodówce, gotowe do rozmieszczenia w terenie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Planowanie i hodowla owadów koloniowych
   1. W przypadku owadów strażniczych należy wybrać gatunek najlepiej dostosowany do środowiska, pory roku i zagrożenia medycznego w lokalizacji, w której odbędzie się próba. Należy wziąć pod uwagę możliwości kolonii oraz czas rozwoju tego gatunku do stadium imago; na przykład należy rozważyć, czy kolonia będzie w stanie dostarczyć liczbę okazów niezbędną do wymaganej liczby klatek strażniczych w założonym czasie.
   2. W przypadku całej hodowli należy zapewnić, aby klatki hodowlane znajdowały się w kontrolowanym środowisku i były wystarczająco duże dla planowanej liczby osobników dorosłych, a także aby ustalono i ściśle przestrzegano reżimu karmienia i czyszczenia, aby zredukować późniejszą śmiertelność związaną ze stresem, która mogłaby zakłócić próby skuteczności w terenie. W przypadku rozległych prób polowych należy zaplanować hodowlę sekwencyjnych partii w oddzielnych, dobrze oznakowanych klatkach populacyjnych.
   3. W klatkach strażniczych należy używać wyłącznie samic komarów, najlepiej 3-5 dni po wykluciu. Poczwarki komarów można wyznaczyć pod mikroskopem stereoskopowym lub oddzielić fizycznie za pomocą szklanego separatora poczwarek, aby zmniejszyć nakład pracy przy sortowaniu osobników dorosłych podczas etapu załadowywania klatek strażniczych.
      Uwaga: Kolonia musi być w stanie dostarczyć dwukrotność liczby komarów planowanych do użycia w klatkach strażniczych, ponieważ jako strażnicy wykorzystywane są tylko samice. Do każdej klatki strażniczej należy użyć 10 dorosłych samic, ponieważ liczba ta pozwala na szybkie załadowanie, szybkie przeliczenie śmiertelności i łatwe ustalenie, czy któryś z osobników nie uciekł. Niezbędne jest zaplanowanie prac wstecz od proponowanej daty oprysku, aby dostępne były dorosłe komary w wieku od 3 do 5 dni. Przedział 3-5 dni zapewnia jednak pewien margines błędu na wypadek, gdyby warunki pogodowe uniemożliwiły wykonanie oprysku.
3. Załadowywanie klatek strażniczych
   1. Przygotować komorę CO₂, wyścielając dno nowego plastikowego pojemnika do przechowywania żywności o pojemności ½ gal kulkami waty. Jeden koniec 6-stopowego odcinka rurki poliuretanowej (o średnicy ¼ cala) należy skierować do kulek waty przez dopasowany otwór wykonany nisko w jednej ze ścianek pojemnika. Do drugiego końca rurki należy podłączyć butlę z CO₂ o masie 20 lb z regulatorem, a pokrywkę pojemnika położyć luźno, aby gaz mógł uchodzić po dyfuzji przez kulki waty i cyrkulacji w pojemniku. Rurkę należy przykleić taśmą do blatu stołu, aby zapobiec pociągnięciu lub zrzuceniu lekkiej komory na podłogę. Należy ustawić przepływ odpowiedni dla używanego gatunku (zacząć od ~7 L/min i wprowadzać korekty w razie potrzeby).
   2. Przygotować 10% roztwór sacharozy w nowym plastikowym pojemniku do żywności o pojemności ½ gal i zanurzyć w nim 100 kulek waty, aby zostały całkowicie nasycone. Rozłożyć klatki strażnicze z etapu 1.1 w partiach po 25 lub 50 sztuk, zależnie od dostępnego miejsca, mając pod ręką kwadraty z siatki tiulowej i luźne pierścienie.
   3. Usunąć komary z klatki populacyjnej za pomocą aspiratora mechanicznego, który umożliwia kierowanie komarów bezpośrednio do wyjmowanych, wentylowanych probówek zbierających. Do każdej probówki nie powinno być zasysanych więcej niż ~10 komarów, a liczba napełnianych probówek nie powinna przekraczać takiej, którą można przetworzyć w ciągu 10 min, aby zminimalizować stres. Włożyć po 2-4 probówki naraz do komory CO₂ i ustawić minutnik na 4 min ekspozycji, aby znieczulić komary przed późniejszym wyznaczeniem płci i przeniesieniem do klatek strażniczych.
   4. Po sygnale minutnika wyjąć wszystkie probówki z komory CO₂ i ostrożnie wysypać znieczulone komary, aby rozłożyły się równomiernie na czystej, białej kartce papieru o wymiarach 11,5 x 17 cali. Ustawić minutnik na 4 min, co jest przybliżonym czasem, po którym komary ponownie staną się aktywne. Używając aspiratora pistoletowego^15,16 lub miękkich pincet entomologicznych, wybrać partie po 20 dorosłych samic i natychmiast umieścić je w czekających otwartych klatkach strażniczych. Po wybraniu wszystkich samic ze znieczulonej partii, użyć osobnego aspiratora mechanicznego do zebrania wszystkich pozostałych samców komarów, które zostaną zutylizowane poprzez zamrożenie.
   5. W momencie, gdy każda otwarta klatka strażnicza otrzyma partię 20 dorosłych samic komarów, należy zamocować kwadrat z siatki tiulowej z pierścieniem nad otwartym górnym końcem cylindra klatki i docisnąć, aby dokończyć montaż klatki strażniczej. Po zamocowaniu tiulu obrócić gumkę tak, aby leżała w poprzek obu końców siatki klatki strażniczej, a rzep był skierowany w stronę ścianki cylindra. Przed samym momentem skapywania, odcisnąć większość 10% roztworu sacharozy z kulki waty, tak aby pozostała wilgotna, a następnie delikatnie wsunąć kulkę waty pod gumkę, przyciskając ją do siatki tiulowej po jednej stronie klatki strażniczej, w miejscu łatwo dostępnym dla komarów.
   6. Powtarzać kroki 1.3.3-1.3.5, aż wszystkie klatki strażnicze zostaną załadowane.
      Uwaga: Procedura załadowywania klatek powinna obejmować co najmniej dwie osoby: jedną do wszystkich czynności związanych z obsługą komarów i drugą do wszystkich czynności związanych z obsługą klatek.
4. Ładowanie klatek strażniczych do lodówek turystycznych
   1. Przygotować izolowaną lodówkę piknikową o pojemności 48 qt na każde 45-50 klatek strażniczych (zależnie od modelu/rozmiaru lodówki), kładąc na dnie mokry bawełniany ręcznik o wymiarach 18 x 24 cali, przykryty wysokim workiem na śmieci o pojemności 13 gal. Mokry ręcznik powinien być wyżęty do stanu nasycenia, ale nie może ociekać. Złożyć i ułożyć worek 13 gal tak, aby całkowicie zakrywał dno lodówki i wystawał co najmniej 3 cale od dołu po wszystkich stronach.
   2. Załadować lodówkę, ostrożnie układając klatki strażnicze w warstwach, kulkami waty skierowanymi do góry. W zależności od modelu lodówki, w jednej warstwie powinno znajdować się około 10-12 klatek, a insgesamt 4-5 warstw. Jeśli to możliwe, należy lekko przesunąć każdą warstwę, aby klatka nie zasłaniała całkowicie klatki poniżej, co ułatwi przepływ powietrza. Przykryć górną warstwę drugim workiem na śmieci 13 gal (złożonym tak jak dolny worek) i rozłożyć na nim drugi mokry ręcznik.
   3. Za pomocą taśmy naprawczej przymocować złożony kawałek tektury w przednim narożniku górnej krawędzi lodówki w taki sposób, aby pokrywa była uchylona o około 3/8 cala, co usprawni wymianę powietrza i zapobiegnie przegrzaniu. W każdej lodówce należy umieścić zamykany plastikowy worek o pojemności 1 qt z 10 zapasowymi kulkami waty nasączonymi 10% roztworem sacharozy oraz oddzielny worek z 5 zapasowymi gumkami i 5 rzepami (elementy te są sporadycznie gubione z klatek strażniczych podczas rozmieszczania w terenie). Przez cały czas przebywania w lodówkach w laboratorium i w terenie należy uzupełniać roztwór sacharozy we wszystkich kulkach waty w klatkach w razie potrzeby, używając zakraplacza i 10% roztworu sacharozy przechowywanego w wytrzymałym pojemniku.
      Uwaga: Przy zastosowaniu tej metody typowe komary koloniowe mogą być załadowane do klatek strażniczych i przechowywane w lodówkach przez 24-28 h przed użyciem w próbach polowych.
5. Transport lodówek z klatkami strażniczymi do terenu
   1. Podczas transportu do miejsca badań lodówki z klatkami strażniczymi należy przewozić w pojeździe z włączoną klimatyzacją, chroniąc je przed bezpośrednim działaniem promieni słonecznych. W miejscach badań o umiarkowanym lub ciepłym klimacie lodówki można ustawić na zewnątrz w celu aklimatyzacji lub trzymać w pojazdach z włączoną klimatyzacją; w obu przypadkach należy chronić lodówki przed bezpośrednim słońcem. Należy zwracać uwagę na wszelkie warunki otoczenia na zewnątrz, które mogłyby wpłynąć na osobniki w lodówkach (np. spaliny samochodowe, ogniska z odpadami itp.)
   2. W ekstremalnie gorących środowiskach lodówki należy trzymać w pojazdach z włączoną klimatyzacją poza bezpośrednim działaniem słońca, a następnie stopniowo aklimatyzować osobniki do warunków zewnętrznych przed rozmieszczeniem w obszarze zabiegowym, aby uniknąć śmierci z powodu szoku. W każdym środowisku warto przetestować jedną lub dwie lodówki z klatkami strażniczymi, aby określić, jak długo mogą pozostać na zewnątrz lub jak szybko mogą zostać zaklimatyzowane do lokalnych warunków zewnętrznych.

2. Przygotowanie terenu badań

1. Ustanowienie siatki sentinelowej i obszaru kontrolnego
   1. Wybierz obszar badań, który zapewnia wystarczającą przestrzeń dla rozprzestrzeniania planowanego trybu aplikacji pestycydów (lotniczego, samochodowego lub przenośnego), z wolną drogą dla przemieszczania się urządzenia do rozpylania oraz z dala od osiedli ludzkich lub aktywności człowieka. Jeśli to możliwe, uwzględnij zróżnicowaną gęstość roślinności i ogólną heterogeniczność siedliska, aby sprawdzić penetrację oprysku.
   2. Zaprojektuj siatkę lokalizacji dla klatek sentinelowych, która uwzględnia zmienność odległości od rozpylacza, odległości wzdłuż linii oprysku, roślinności/przeszkód dla penetracji oprysku oraz wysokości nad gruntem. Użyj miary taśmowej o długości 300 ft, aby wyznaczyć wygodne odstępy od rozpylacza i wzdłuż linii oprysku; na przykład użyj wielokrotności odstępów 25 ft.
   3. Stwórz mapę siatki, nanosząc na wydruk obrazu satelitarnego wyraźny kod numeracji dla lokalizacji klatek sentinelowych i udostępnij ją zespołowi terenowemu. Jeśli to możliwe, uzyskaj współrzędne GPS dla każdej lokalizacji klatki lub przynajmniej współrzędne charakterystycznych punktów, które mogą później posłużyć jako punkty rejestracyjne do budowy spójnej przestrzennie mapy w GIS.
   4. Zaznacz lokalizacje siatki klatek sentinelowych na ziemi za pomocą taśmy sygnalizacyjnej, świetlików i/lub flag pinowych. Opryski pestycydami są często przeprowadzane o zmierzchu lub w nocy: postaraj się wyznaczyć wyraźne ścieżki dojścia do wszystkich lokalizacji sentinelowych, używając dodatkowej taśmy sygnalizacyjnej i/lub świetlików do oznaczenia miejsc ryzyka potknięcia lub innych istotnych przeszkód.
   5. Zainstaluj słupy montażowe klatek sentinelowych w ziemi zgodnie z projektem siatki i wyraźnie oznakuj każdy słup kodem jego unikalnej pozycji permanentnym markerem. Przynajmniej 48 inches słupa powinno znajdować się nad ziemią. Jeśli siedlisko naturalnie nie stwarza wyzwań w postaci roślinności/przeszkód dla rozprzestrzeniania oprysku pestycydowego, rozważ umieszczenie obok każdego słupa klatki sentinelowej kartonowego pudełka o wymiarach 1 ft³ ułożonego na boku z otwartą górą, aby stworzyć dodatkową lokalizację sentinelową w symulowanych refugia. Przepływ powietrza przez pudełko można regulować, wiercąc otwory ½-in w jednej lub kilku ściankach; pudełka należy oznakować unikalnym kodem pozycji permanentnym markerem.
   6. Jeśli istnieje ryzyko ataku mrówek na komary sentinelowe, zainstaluj słupy montażowe klatek sentinelowych poprzez ciasno dopasowany otwór wywiercony w centrum samoprzylepnej płytki podłogowej o wymiarach 18 x 18-in, z lepką stroną skierowaną do góry, aby wyłapywać mrówki, zanim dotrą one do sentineli. Pudełka 1 ft³ z kroku 2.1.5 mogą być również ustawione na lepkiej stronie takich płytek, aby utrudnić dostęp mrówkom oraz utrzymać pudełka w miejscu w wietrznych warunkach.
   7. Ustanów obszar kontrolny z wiatrem (składający się z podobnego siedliska i warunków meteorologicznych jak obszar zabiegowy) dla rozmieszczenia niepoddanych działaniu pestycydów klatek sentinelowych kontrolnych, wystawionych na działanie środowiska na słupach i/lub w pudełkach 1 ft³ przez taki sam czas, jak sentinele w obszarze zabiegowym. Do obsługi wszystkich sentineli kontrolnych powinien zostać przydzielony konkretny zespół personelu z oddzielnymi chłodniami dla klatek sentinelowych.
   8. Jeśli zasoby na to pozwolą, zaprojektuj rozmieszczenie odpowiednich pułapek na całym obszarze zabiegowym, obszarach przyległych do obszaru zabiegowego oraz obszarach kontrolnych, aby prowadzić nadzór nad lokalnymi naturalnymi populacjami komarów najbliższych gatunkom wybranym w 1.2.1. Rozpocznij nadzór dzienny lub nocny, w zależności od gatunku, w jednym lub więcej okresów 12-24 h przed planowanymi próbami oprysku. Kontynuuj nadzór przez cały czas trwania prób oprysku, a następnie przez jeden lub więcej okresów po zakończeniu prób oprysku.

Rycina 2: Przygotowanie terenu badań z tyczkami do klatek strażniczych. Dwa scenariusze rozmieszczenia tyczek do klatek strażniczych w (A) nawadnianym tropikalnym mikrosiedlisku w regionie gorącym i suchym oraz (B) gorącym i suchym obszarze pustynnym. W części (A) pokazano trzy rodzaje aparatury strażniczej: „drabina” po lewej stronie to seria bawełnianych wstążek zawieszonych między rurami PVC w celu wychwytywania pestycydów na różnych wysokościach nad ziemią; tyczka w środku służy do klatek strażniczych dla komarów; tyczka po prawej stronie podtrzymuje wirujący szkiełko do wychwytywania kropli pestycydów. W części (B) znajduje się podobna bawełniana wstążka do wychwytywania pestycydów, jednak należy zauważyć, że prawe wsparcie aparatury znajdującej się na pierwszym planie w otwartej przestrzeni pełni jednocześnie funkcję tyczki do klatki strażniczej (klatka strażnicza jest przymocowana w około jednej trzeciej wysokości); w przeciwieństwie do tego, aparatura w tle jest umieszczona tak, aby wstążka i klatka strażnicza (wskazana żółtą strzałką) były osłonięte roślinnością. Samolot w tle wykonuje oprysk pestycydem metodą ULV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przestrzeganie zasad bezpieczeństwa
   1. Ustanowić system komunikacji między zespołem opryskowym, zespołem obsługującym sentinele w obszarze zabiegowym, zespołem obsługującym sentinele w obszarze kontrolnym itp., za pomocą telefonów komórkowych (głos/tekst) lub radiostacji.
   2. Zapewnić wszystkim pracownikom środki ochrony indywidualnej (ŚOI) odpowiednie do ich ról oraz do formulacji pestycydów i sprzętu aplikacyjnego.
   3. Wyznaczyć obszar magazynowania, mieszania i ładowania pestycydów, zabezpieczony wtórnym systemem ograniczania wycieków i wyposażony w sprzęt ratunkowy, taki jak łopaty i/lub gaśnice w przypadku aplikacji mgły termicznej, ręczniki do usuwania rozlewów lub kropel, pojemniki na odpady, czystą wodę, zestaw pierwszej pomocy oraz przenośne stacje do płukania oczu. Co ważne, należy opracować protokoły na wypadek wycieków lub narażenia personelu na działanie chemikaliów.
3. Wyznaczanie linii oprysku i rejestracja danych meteorologicznych
   1. W przypadku aplikacji z pojazdu lub ręcznych, należy upewnić się, że linia oprysku jest wolna od przeszkód, a wszelkie bariery zostały zidentyfikowane i wyraźnie oznakowane taśmą sygnalizacyjną, flagami szpilkowymi i/lub pałeczkami świetlnymi. W przypadku aplikacji lotniczych należy dokonać wszelkich odpowiednich ustaleń z kontrolą ruchu lotniczego.
   2. Podstawowa długość linii oprysku powinna odpowiadać wymiarom siatki; jednak punkty startu i stopu należy wyznaczyć odpowiednio przed i za siatką. Do początku i końca należy dodać około 10% podstawowej długości linii oprysku, aby zwiększyć szansę na ekspozycję całej siatki, biorąc pod uwagę nieuniknione przesunięcia i niedoskonałości wzorców wiatru (patrz: reprezentatywne wyniki).
   3. W miarę możliwości należy przewidywać znaczne zmiany kierunku wiatru, przygotować alternatywną linię lub linie oprysku oraz zaprojektować siatkę sentyneli w taki sposób, aby dostarczała informacji przy oprysku z obu kierunków. Operator oprysku powinien być przygotowany do krótkiego przerwania prac, jeśli wystąpią silne porywy wiatru lub jego nagła zmiana, co może stanowić zagrożenie dla bezpieczeństwa. Operator może wznowić oprysk w odpowiednim momencie, a badanie nadal może dostarczyć użytecznych danych o skuteczności, o ile grupa kontrolna pozostanie w środowisku przez podobny, wydłużony czas.
   4. Umieścić co najmniej jedną stację pogodową z rejestratorem danych zdolnym do pomiaru temperatury, wilgotności względnej, prędkości i kierunku wiatru w obszarze oprysku oraz drugą w obszarze kontrolnym. Należy również zamontować prosty wskaźnik wiatru w postaci wstążki (około 2-3 ft jaskrawo kolorowej taśmy sygnalizacyjnej) na zapasowym słupku klatki sentyneli, w zasięgu wzroku operatora oprysku i zespołu terenowego, aby zwiększyć ogólną świadomość panujących warunków. W przypadku aplikacji lotniczych samolot powinien w idealnym scenariuszu być w stanie raportować dane meteorologiczne na wysokości uwalniania preparatu.
      Uwaga: Należy współpracować z uniwersytetem, organizacją zdrowia publicznego, okręgiem kontroli komarów i wektorów lub inną instytucją znającą obszar proponowany do badań terenowych, tak aby można było budować na istniejących partnerstwach i porozumieniach z właścicielami lub zarządcami gruntów, co pomoże w rozwoju programu badawczego. Istniejące partnerstwa przekładają się na bezpieczeństwo terenu, możliwość długoterminowego użytkowania, a w niektórych przypadkach na kluczowe poparcie i akceptację społeczną. W przypadku ustrukturyzowanych siatek lokalni współpracownicy mogą w prosty sposób opracować własne schematy numeracji/etykietowania w celu szybkiego i powtarzalnego rozmieszczania, zbierania i sprawdzania śmiertelności w klatkach sentynelach. Po ustawieniu siatki, linii oprysku i aparatury meteorologicznej materiały mogą pozostać na miejscu (na przykład przez noc aż do dogodnego czasu oprysku lub w przypadku wstrzymania prac z powodu pogody).
      OSTRZEŻENIE: Pudełka tekturowe mogą odkształcić się pod wpływem wilgoci w razie deszczu, a silny wiatr może przemieścić ciężkie samoprzylepne płytki podłogowe.

3. Rozmieszczenie klatek strażniczych

1. Ustal wcześniej rozmieszczenie klatek pułapkowej (sentynelowych) w każdym punkcie monitoringu w siatce, np. wysokość klatki na słupie montażowym (w tym w przypadku różnych wysokości, gdzie jedną można umieścić u dołu słupa, a drugą na górze) lub informację, czy klatki zostaną umieszczone w skrzynkach o objętości 1 ft³.
2. Wyznacz 2-osobowe zespoły do rozmieszczania klatek: jedną osobę do trzymania chłodziarki i drugą do wyjmowania klatek w miarę potrzeb. Alternatywnie, wyznacz osoby do przenoszenia i rozmieszczania wielu klatek, w zależności od środowiska i wielkości siatki. Zawsze zabierz dodatkowe klatki na wypadek upuszczenia lub nadepnięcia na klatkę, rozdarcia tiulu lub zagubienia klatki podczas przemieszczania się po siatce.
3. Zgodnie z planem rozmieszczenia opisanym w kroku 3.1, użyj opasek rzepowych, aby przymocować klatki do słupów i upewnij się, że kulki waty z 10% roztworem sacharozy wciąż znajdują się na swoim miejscu pod gumką recepturką. Umieść klatki na bokach w skrzynkach 1 ft³ tak, aby oba końce z siatką z tiulu były prostopadłe do podłoża. Orientacja klatek na słupach może być określona wcześniej; na przykład w taki sposób, aby boki z tiulu były zgodne z planowanym kierunkiem oprysku i przewidywanym kierunkiem wiatru. W gorącym środowisku pustynnym ustaw klatki na słupach pod kątem, tak aby owady nie znajdowały się w bezpośrednim świetle słonecznym i mogły przemieścić się w cień bocznej ścianki cylindra klatki.
4. Zarówno w obszarach badawczych, jak i kontrolnych, wyraźnie oznacz każdą klatkę markerem permanentnym w momencie jej rozmieszczania, podając dwie informacje: (1) unikalny kod pozycji słupa i/lub skrzynki do późniejszego naniesienia na mapę w systemie GIS oraz (2) śmiertelność przed opryskiem w celu późniejszej korekty o śmiertelność wywołaną opryskiem lub śmiertelność wynikającą z ekspozycji na środowisko niezależnie od oprysku. Na przykład, jeśli śmiertelność przed opryskiem wynosi zero, zapisz „pre-0”; jeśli martwe są 2 osobniki, zapisz „pre-2”, itp.

Rysunek 3: Rozmieszczenie klatek strażniczych wewnątrz i na zewnątrz pomieszczeń. Przykłady rozmieszczenia słupków i pudełek o objętości 1 ft³ (A) wewnątrz symulowanego wiejskiego domu, (B) na zewnątrz w symulowanym sąsiedztwie oraz (C) w gaju palmy daktylowej w strefie gorącej i suchej. Przedstawiono również lepiące płytki pod pudełkiem oraz pod klatką strażniczą umieszczoną na otwartej przestrzeni w (A), a także pin słupka klatki strażniczej wciśnięty w lepiącą płytkę obok pudełka w (B), aby ograniczyć wnikanie mrówek do klatek strażniczych. Sklejkowy kwadrat z pionowym mocowaniem z PVC po lewej stronie pudełka w (A) stanowi podstawę dla obrotowego uchwytu na szkiełka. Podobne urządzenie można wykorzystać do podparcia słupka klatki strażniczej, aby umożliwić rozmieszczenie klatek na różnych wysokościach. Przedstawiono również obrotowy uchwyt z szkiełkami na mocowaniu po lewej stronie słupka klatki strażniczej i pudełka (B). W (C) pokazano rozmieszczenie dwóch klatek strażniczych na różnych wysokościach (wysoko-nisko) w celu zbadania przemieszczania się pestycydów na różnych poziomach. W przednim planie widoczna jest góra otwartej lodówki klatki strażniczej. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Uwaga: W zależności od wielkości siatki należy zapewnić wystarczającą liczbę personelu, aby rozstawić wszystkie klatki w odpowiednim czasie, co zminimalizuje wpływ czynników środowiskowych na śmiertelność osobników w grupach kontrolnych (sentinel). Może być konieczne przeprowadzenie próbnych przejść z pustymi klatkami, aby ocenić, czy liczba personelu jest wystarczająca. Należy przyjąć, że ze względu na czas konfiguracji przy danej liczbie klatek na osobę, nieuniknione będą pewne różnice w czasie ekspozycji klatek kontrolnych na środowisko. W przypadku bardzo dużych siatek kontrolnych (np. w niektórych aplikacjach lotniczych) należy zaplanować koordynację wielu zespołów w kilku pojazdach, aby rozmieścić klatki kontrolne w rozsądnym czasie. Nieuniknione jest wystąpienie pewnej śmiertelności w populacji komarów w klatkach kontrolnych, dlatego musi zostać ona uwzględniona poprzez staranne etykietowanie klatek przed ekspozycją środowiskową poza chłodniami oraz przed aplikacją pestycydów.

4. Przeprowadzanie aplikacji pestycydów

1. Wyznaczyć osobę odpowiedzialną za pomiar czasu, aby za pomocą stoperu, zegara lub cyfrowego nagrania wideo ze znacznikami czasu/daty śledzić czas trwania oprysku (godziny rozpoczęcia/zakończenia) oraz czas oczekiwania. Osobie tej można przydzielić asystenta do zapisywania wielu kluczowych zmiennych, w tym czasu zakończenia rozmieszczenia klatek strażniczych, prędkości lotu, jazdy lub marszu, natężenia przepływu urządzenia do oprysku, stężenia i rozcieńczalnika pestycydów, czasu oprysku, czasu oczekiwania, czasu zakończenia zbierania klatek oraz ogólnych obserwacji siedliska.
2. Przygotować sprzęt do aplikacji pestycydów zgodnie z wytycznymi producenta i napełnić go pestycydem (oraz rozcieńczalnikiem, jeśli jest to konieczne), używając minimalnej ilości potrzebnej do pokrycia obszaru docelowego, powiększonej o wcześniej określoną ilość uwzględniającą objętość przewodów rozpylających oraz sumpa zbiornika z pestycydem, aby zapobiec kawitacji podczas oprysku. Nie przekraczać dawek aplikacji określonych na etykiecie pestycydów i nie stosować środków niezatwierdzonych przez U.S. Environmental Protection Agency, chyba że uzyskano zezwolenie na użytek eksperymentalny specyficzne dla lokalizacji próby polowej.
3. Ustalić wystarczający czas oczekiwania po oprysku, który pozwoli pióropuszowi rozpylonego pestycydów rozprzestrzenić się w całej sieci klatek strażniczych przed ich zebraniem. Czas oczekiwania opiera się na zrównoważonym uwzględnieniu gęstości siedliska/roślinności, warunków meteorologicznych (w szczególności ekstremalnego upału lub wiatru), urządzenia do aplikacji, trybu aplikacji (lotniczego, pojazdem naziemnym, przenośnego), docelowego owada oraz formulacji pestycydów; jego opracowanie może wymagać wstępnych prób.
4. Po oznakowaniu i rozmieszczeniu klatek strażniczych w obszarach badawczych i kontrolnych oraz po potwierdzeniu gotowości przez cały kluczowy personel, operator oprysku powinien przeprowadzić końtrową kontrolę prędkości i kierunku wiatru, a następnie rozpocząć aplikację pestycydów za pomocą opryskiwacza lotniczego, naziemnego lub przenośnego z wyznaczonej linii oprysku lub alternatywnej linii, w zależności od potrzeb. Ustawić prędkość lotu, jazdy lub marszu w zależności od natężenia przepływu urządzenia do aplikacji i dawki określonej na etykiecie pestycydów.
5. Po zakończeniu aplikacji oprysku osoba odpowiedzialna za pomiar czasu powinna odnotować początek czasu oczekiwania i powiadomić cały personel na 1-2 min przed upływem tego czasu, aby wszyscy mogli zająć pozycje i przygotować się do zbierania klatek strażniczych.
   UWAGA: Należy przestrzegać wszystkich środków ostrożności określonych na etykiecie pestycydów, a także standardowych dobrych praktyk aplikatorów pestycydów. Aplikacje pestycydów powinny być przeprowadzane przez certyfikowanego aplikatora pestycydów, który w miarę możliwości posiada dodatkowy certyfikat w kategorii pestycydów zdrowia publicznego. Przed aplikacją oprysku należy upewnić się, że cały personel znajduje się z nawietrznej strony obszaru aplikacji lub w pojazdach z włączoną klimatyzacją w trybie recyrkulacji, jeśli muszą przebywać w obszarze docelowym, i/lub nosi odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE). Należy upewnić się, że wszystkie lodówki z klatkami strażniczymi są zamknięte, a w zamkniętych pojazdach zaparkowanych z nawietrznej strony oprysku klimatyzacja pracuje w trybie recyrkulacji.

Rysunek 4: Pojazd montowany do rozpylania mgły termicznej w siatce w ciepłym, suchym regionie równikowym. Opryskiwacz ULV zamontowany na ciężarówce poruszający się wzdłuż linii oprysku, kierujący strumień pestycydów przez siatkę klatek strażniczych w otwartym polu (A). Podobnie jak na Rysunku 2, w każdym punkcie strażniczym zamontowano drugi słup podtrzymujący bawełnianą wstążkę do zbierania kropel pestycydów w celu późniejszej analizy za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas. Zbliżenia klatek strażniczych (B) w ciepłym środowisku umiarkowanym przed opryskiem oraz (C) w gorącym, suchym środowisku po oprysku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

5. Zbieranie klatek strażniczych i rejestrowanie danych o śmiertelności

1. Użyj tych samych zespołów zbierających klatki strażnicze, aby zebrać klatki z całej siatki po upływie czasu oczekiwania. Cały personel obsługujący klatki po oprysku powinien nosić jednorazowe rękawiczki nitrylowe, aby zminimalizować kontakt ludzi z pestycydami. Klatki po oprysku należy jak najszybciej przenieść do chronionego środowiska chłodni do klatek strażniczych, transportując je w chłodnym pojeździe, z dala od bezpośredniego światła słonecznego, i jak najszybciej dostarczyć do laboratorium w celu przetworzenia.
2. Zarówno w obszarach badanych, jak i kontrolnych, kluczowe jest zapisywanie śmiertelności po oprysku na każdej klatce strażniczej za pomocą permanentnego markera w momencie jej zbierania. Liczba martwych osobników po oprysku powinna obejmować wszystkie martwe komary w klatce, a liczba ta powinna zostać wpisana bezpośrednio obok liczby „pre-”, lecz w sposób wyraźnie zakreślony kółkiem, aby odróżnić ją od liczby martwych osobników przed ekspozycją. Później liczba sprzed oprysku zostanie odjęta od liczby po oprysku, aby uzyskać rzeczywistą śmiertelność wynikającą z ekspozycji na pestycyd (obszar oprysku) lub środowisko (obszar kontrolny). Nie należy próbować wykonywać tych obliczeń w terenie podczas pośpiesznego zbierania klatek strażniczych.
3. Należy dążyć do dostarczenia klatek strażniczych do laboratorium w ciągu 6 h po oprysku, aby można było zarejestrować liczbę martwych osobników po 6 h. W laboratorium należy przenieść wszystkie klatki do plastikowych tacek, usuwając wszystkie gumki recepturki, rzepy i kulki waty. Każda tacka powinna pomieścić około 20 klatek strażniczych, ułożonych tak, aby tiulowa siatka była równoległa do podłoża. Na wszystkie klatki należy położyć nową kulkę waty z 10% roztworem sacharozy i przykryć każdą tackę nowym wilgotnym ręcznikiem bawełnianym, podobnym do tych używanych w chłodniach do klatek strażniczych. Tacki należy ustawić w stosy na blacie laboratoryjnym lub w inkubatorze, używając dystansów z rur PVC o średnicy ½-in. Tacki z klatkami z obszarów badanych należy przechowywać w wyraźnym oddzieleniu lub w innych inkubatorach niż tacki z klatkami kontrolnymi.
4. W tym momencie, podczas przeprowadzania pomiaru śmiertelności po 6 h, należy przenieść dane o śmiertelności przed i po oprysku z każdej klatki do formularzy danych: jedna osoba w jednorazowych rękawiczkach nitrylowych powinna wyjmować z tacek klatki strażnicze jedna po drugiej, podając kolejno 1) unikalny kod lokalizacji, następnie 2) liczbę przed opryskiem i liczbę bezpośrednio po oprysku odczytaną z klatki, a następnie 3) aktualną liczbę martwych osobników po 6 h zaobserwowaną bezpośrednio. Druga osoba powinna zapisywać te dane w przygotowanych wcześniej formularzach zawierających wiersz dla każdego unikalnego kodu pozycji z badania (Tabela 1). Proces ten należy powtórzyć po 12 h i 24 h od oprysku, przechowując tacki w stabilnych warunkach pomiędzy pomiarami śmiertelności.
5. Po zakończeniu pomiaru śmiertelności po 24 h, należy zamrozić wszystkie tacki z klatkami strażniczymi, aby zabić wszystkie osobniki, a następnie przeprowadzić końcowe przeliczenia dla każdej klatki, aby uzyskać dokładną liczbę całkowitą do obliczenia procentowej śmiertelności. Jeśli w klatce brakuje osobnika, należy sprawdzić bezpośrednio pod nią w tacce, gdzie mógł on wyschnąć i wypaść. Wszystkie klatki strażnicze, ręczniki bawełniane i plastikowe worki należy wyrzucić do szczelnie zamkniętych worków na śmieci jako odpady komunalne, a wszystkie chłodnie i tacki dokładnie umyć wodą z mydłem i wysuszyć na powietrzu w bezpośrednim świetle słonecznym.
   Uwaga: Dystanse do tacek z larwami można łatwo wykonać z rur PVC, wycinając w każdym końcu wcięcie, aby nie staczały się z tacek. Dystanse umożliwiają sztaplowanie tacek z larwami w celu oszczędności miejsca w pojazdach, inkubatorach lub na blatach laboratoryjnych. W przypadku niektórych lokalizacji terenowych może nie być możliwe powrócenie do laboratorium w ciągu 6 h; w takim przypadku należy przenieść klatki z chłodni do tacek w terenie, korzystając z powyższego protokołu i materiałów, a następnie starannie ułożyć je w klimatyzowanym pojeździe. Rejestrowanie śmiertelności w każdej klatce bezpośrednio po czasie oczekiwania po oprysku oraz w przybliżeniu po 6 h, 12 h i 24 h od oprysku dostarczy informacji o efekcie nokdaunu (krótkotrwałym) w porównaniu z długotrwałym działaniem pestycydu.

Rycina 5: Przetwarzanie klatek strażniczych po oprysku. Dwa scenariusze przenoszenia klatek po oprysku do ułożonych w stosy tacek podczas 6-godzinnej kontroli śmiertelności: (A) w pokoju hotelowym w pobliżu odległego stanowiska terenowego oraz (B) na dogodnym parkingu podczas powrotu do laboratorium z odległego stanowiska terenowego. Należy zwrócić uwagę na odstępniki z PVC na zdjęciu wstawkowym w (A), wilgotne ręczniki przykrywające klatki rozmieszczone w tackach na głównym zdjęciu w (A) oraz przykład unikalnego kodu lokalizacji wraz z zaznaczoną bezpośrednio na klatce strażniczej śmiertelnością przed opryskiem i zakreśloną śmiertelnością po oprysku na zdjęciu wstawkowym w (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Przetwarzanie, analiza i mapowanie danych o śmiertelności

1. Przenieś wszystkie ręcznie zapisane dane dotyczące śmiertelności z formularzy do arkusza kalkulacyjnego i oblicz 4 nowe kolumny dla śmiertelności po oprysku, po 6 h, 12 h i 24 h (wszystkie skorygowane o śmiertelność przed opryskiem).
2. Skoryguj wszystkie dane dotyczące śmiertelności w obszarze zabiegowym o śmiertelność w grupie kontrolnej w 4 dodatkowych nowych kolumnach, stosując korektę Abbotta¹⁷: oblicz średnią śmiertelność kontrolną dla wszystkich sentyneli kontrolnych dla każdego okresu czasu, w którym rejestrowano śmiertelność (tj. po oprysku, po 6 h, 12 h i 24 h; wszystkie skorygowane o śmiertelność przed opryskiem), a następnie wykorzystaj tę średnią do wprowadzenia korekty Abbotta dla śmiertelności w każdej klatce sentynelowej w obszarze zabiegowym dla każdego odpowiadającego okresu czasu. Próg akceptowalnej śmiertelności kontrolnej może zostać określony dowolnie w zależności od gatunku użytych komarów sentynelowych, lecz nie powinien przekraczać 25%¹⁸.
3. W systemie informacji geograficznej (GIS) nanieś na mapę wszystkie unikalne lokalizacje klatek sentynelowych, korzystając z danych GPS zebranych w kroku 2.1.3, i utwórz w tabeli atrybutów dla tych lokalizacji 4 kolumny dla śmiertelności skorygowanej metodą Abbotta dla 4 okresów czasu. Stwórz interpolację zasięgu śmiertelności dla każdego z 4 okresów czasu dla wszystkich unikalnych lokalizacji sentynelowych w obszarze zabiegowym. Dodaj te interpolacje do mapy i zastosuj rozciągniętą skalę kolorystyczną w spektrum od niebieskiego do czerwonego, zorientowaną od wartości niskich (niebieski) do wysokich (czerwony).
4. Udoskonal mapę obszaru zabiegowego, dodając w tle obraz satelitarny oraz pozycje klatek sentynelowych (rozróżniając sentynele zabiegowe i kontrolne), linię oprysku, kierunek jazdy, pasek skali, strzałkę północy, legendę skali kolorystycznej interpolowanej śmiertelności, legendę symboli oraz szczegółowy tytuł z datą, typem siedliska, zastosowanym pestycydem i rozcieńczalnikiem, użytym sprzętem aplikacyjnym oraz gatunkiem docelowym. Eksportuj obraz mapy dla każdej powierzchni śmiertelności w poszczególnych okresach czasu.
5. Dodaj informacje meteorologiczne w formie wykresu wstawkowego i dołącz oddzielną różę wiatrów (wykres polarny), aby wskazać przeważający wiatr, prędkość wiatru i jego zmienność w całym okresie oprysku. W przypadku aplikacji lotniczych podaj również oddzielne dane meteorologiczne dla wysokości wypuszczenia.
6. Przedstaw dane z monitoringu lokalnych populacji naturalnych na wykresie jako indeks liczby samic każdego gatunku zebranych na jedną pułapkę na noc. Wygeneruj serię wykresów z podziałem na lokalizację (sąsiadującą z obszarem zabiegowym, wewnątrz obszaru zabiegowego i wewnątrz obszaru kontrolnego) oraz okres (próbkowanie przed, w trakcie lub po próbach oprysku) i umieść je oddzielnie jako wstawki na głównej mapie GIS, aby pokazać wpływ na populacje naturalne w czasie w obrębie, w sąsiedztwie i z dala od miejsca aplikacji pestycydów.

Wyniki

Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki z dwóch nieopublikowanych badań terenowych, które obejmowały istotę opisanych powyżej metod. W badaniach tych analizowano dwa aspekty skuteczności adultycydów przeciwko owadnim wektorom chorób w grupach kontrolnych.

Pierwsze badanie (dane niepublikowane 2010-2012) miało na celu sprawdzenie, czy rozcieńczalnik może wpływać na skuteczność pestycydów przeciwko komarom w gorącym i suchym środowisku pustynnym przy zastosowaniu urządzenia do zamgławiania termicznego. Przeprowadzono trzy oddzielne aplikacje z synergistycznym adulticydem na bazie permetryny, który mógł być rozcieńczany w oleju lub wodzie. Każda z aplikacji została wykonana przy użyciu zamontowanego na ciężarówce generatora mgły termicznej z innym rozcieńczalnikiem: wodą, olejem mineralnym BVA13 lub olejem napędowym. Następnie wykorzystano siatkę co najmniej 20 klatek z komarami strażniczymi umieszczonych na słupach na otwartym obszarze suchym (Rycina 6), a dane meteorologiczne rejestrowano za pomocą przenośnego rejestratora pogodowego.

W drugim badaniu (dane niepublikowane, 2011) zbadano względną skuteczność pojedynczej formulacji pestycydowej zastosowanej jednocześnie za pomocą dwóch rodzajów opryskiwaczy (ULV i zamgławiania termicznego) przeciwko muchówkom z rodzaju *Phlebotomus* w gorącym środowisku równikowym. Wykorzystano dwie sąsiadujące siatki po 25 sentynelowych klatek z muchówkami, umieszczonych na palach w siedlisku z niskich traw i roślin zielnych o różnej gęstości, na dużym polu w gorącej równikowej dolinie (Rysunek 7). Dane meteorologiczne rejestrowano za pomocą przenośnego rejestratora pogodowego umieszczonego pomiędzy dwiema siatkami. Jedna ciężarówka transportowała urządzenie ULV, a druga generator zamgławiania termicznego; obie rozpoczęły opryski wzdłuż wyznaczonych linii w tym samym czasie, poruszając się z wschodu na zachód z prędkością odpowiednią dla dawki aplikacyjnej określonej na etykiecie oraz zadanego natężenia przepływu opryskiwacza.

W obu badaniach terenowych, po 10-minutowym czasie oczekiwania po oprysku, zebraliśmy wszystkie klatki kontrolne z obszarów badanych i kontrolnych, jednocześnie rozpoczynając proces rejestrowania śmiertelności po oprysku. Dane dotyczące procentowej śmiertelności zostały następnie zakodowane, skorygowane o zaobserwowaną śmiertelność w klatkach kontrolnych tła i wprowadzone do warstwy GIS składającej się z georeferencyjnych punktów odpowiadających lokalizacjom klatek kontrolnych w siatce obszaru badanego (Rycina 6 i Rycina 7). Pomimo idealnej sytuacji, w której oprysk pestycydem powoduje 100% śmiertelności w całym obszarze docelowym, rzeczywisty próg akceptowalnej skuteczności pestycydy jest arbitralny. Oczekiwania co do skuteczności mogą różnić się w zależności od odległości od opryskiwacza (np. ustalenie progu śmiertelności na poziomie 95% w odległości 50 ft od linii oprysku i 80% w odległości 250 ft).

Wyniki z obu reprezentatywnych badań naturalnie wykazują spektrum od wyników pozytywnych do negatywnych, ponieważ skala kolorystyczna reprezentuje obszary od 0 do 100% śmiertelności (patrz skale kolorystyczne na Rysunku 6 i Rysunku 7). Wszystkie dane dotyczące śmiertelności w obszarze traktowanym są normalizowane względem śmiertelności tła w nie traktowanym obszarze kontrolnym do progu 25% śmiertelności kontrolnej¹⁸, powyżej którego dane zostałyby odrzucone ze względu na nadmierny wpływ środowiska lub efektów kolonii na śmiertelność. Użyteczność podejścia opartego na mapowaniu elektronicznym w wizualizacji danych o śmiertelności jest tutaj ewidentna: badacz i (później) czytelnik mogą natychmiast zrozumieć względną skuteczność badanych pestycydów i rozcieńczalników (Rysunek 6) lub badanych opryskiwaczy do pestycydów (Rysunek 7) odpowiednio przeciwko komarom lub muchówkom piaskowym. Warto porównać Rysunek 6 z podstawowymi danymi o śmiertelności, które tradycyjnie byłyby przedstawione w formie tabelarycznej (Tabela 2) i wymagałyby znacznie większej konceptualizacji wewnętrznej, z proporcjonalnie zwiększonym potencjałem wystąpienia błędów zarówno po stronie badacza, jak i czytelnika. Mapa elektroniczna, jeśli zostanie uzupełniona o dane meteorologiczne i satelitarne zdjęcie pokrywy terenu, ułatwia również szybką ocenę potencjalnego wpływu siedliska na aplikacje pestycydów. Należy zauważyć, że wstawiona róża wiatrów na Rysunku 7 ma kąt wiatru, który idealnie odpowiada kątowi przestrzennej śmiertelności w zachodniej siatce, co wskazuje, że ciężarówka do oprysków powinna była wystartować dalej na wschód, aby pestycyd miał możliwość dotarcia do wszystkich klatek kontrolnych. Gdyby dane o śmiertelności rozpatrywano wyłącznie w formie tabelarycznej, łatwo byłoby przeoczyć tę słabość w projekcie eksperymentalnym i przypisać niższą ogólną skuteczność temu sprzętowi do aplikacji pestycydów, będąc pod wpływem wartości zerowej śmiertelności z obszarów, które nie miały kontaktu z pestycydem.

W naszym doświadczeniu większość aplikacji pestycydów w polu generuje gradient śmiertelności w klatkach kontrolnych rozmieszczonych w obszarze docelowym, co automatycznie potwierdza prawidłowe przeprowadzenie aplikacji. Jednakże, jeśli w całym obszarze zabiegowym nie zaobserwowano żadnej śmiertelności, a zdarzenie oprysku było prawidłowe (tj. zaobserwowano chmurę oprysku przemieszczającą się przez docelowy obszar kontrolny), można wywnioskować, że pestycyd nie jest skuteczny wobec tego gatunku przy zastosowanym stężeniu, w tym środowisku i przy użyciu tego sprzętu aplikacyjnego. Oczywiście zakłada się tutaj, że partia pestycydów nie jest przeterminowana ani nie była przechowywana w niewłaściwy sposób. Z drugiej strony, niektóre aplikacje pestycydów drogą lotniczą w szczególności mogą nie generować widocznej ani wykrywalnej chmury oprysku uderzającej w obszar docelowy, a całkowity brak śmiertelności w klatkach kontrolnych może oznaczać, że oprysk ominął obszar docelowy. Zaleca się przewidzieć taki scenariusz poprzez ustawienie serii dodatkowych klatek kontrolnych otaczających obszar docelowy w pewnej odległości z wiatrem i pod wiatr (np. w odstępach 50 ft na co najmniej jedną szerokość przejazdu w każdym kierunku), tak aby można było uzyskać jakąkolwiek wskazówkę dotyczącą osiadania pestycydów w przypadku pominięcia obszaru docelowego.

Rycina 6: Reprezentatywne interpolowane dane dotyczące śmiertelności w klatkach kontrolnych z badania polowego w gorących i suchych warunkach pustynnych ukierunkowanego na komary. W tej serii oprysków opryskiwacz termiczny, pestycyd oraz środowisko pozostały stałe, natomiast w trzech badaniach zmieniono rozcieńczalnik pestycydów na (A) wodę, (B) olej napędowy oraz (C) olej mineralny BVA 13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 7: Reprezentatywne interpolowane dane dotyczące śmiertelności w klatkach sentinelowych z próby polowej w warunkach równikowych w gorącym klimacie, skierowanej przeciwko muchówkom. W tym zestawie dwóch jednoczesnych aplikacji opryskowych pestycyd i środowisko pozostawały stałe, natomiast różnił się opryskiwacz stosowany w obu siatkach: zamgławianie termiczne (siatka zachodnia) oraz ultra niska objętość (ULV, siatka wschodnia). Należy zauważyć, że kierunek wiatru wskazany na róży wiatrów idealnie odpowiada kątowi przestrzennej śmiertelności w siatce zachodniej, co wskazuje, że ciężarówka do oprysków powinna była rozpocząć pracę dalej na wschód, aby pestycyd mógł dotrzeć do wszystkich klatek sentinelowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

	PROJEKT:
	STREFA EKOLOGICZNA:
	LOKALIZACJA:
	TEREN BADAWCZY:
	DATA ZŁOŻENIA WNIOSKU:
	WYPOSAŻENIE DO NATRYSKIWANIA:
	FORMULACJA ŚRODKA OCHRONY ROŚLIN:
	ROZCIEŃCZNIK:
	GATUNKI OWADÓW WSKAZUJĄCYCH:
	Etap życia strażników:
		KONTROLA ŚMIERTELNOŚCI
		[skopiowano bezpośrednio z klatek sentinelowych; dane zaobserwowane w terenie]		[zaobserwowano w klatkach kontrolnych przechowywanych w tackach]
	Kod klatki sentinelowej	Nr PRE-DEAD	Nr. CZAS PO NATRYSKIWANIU/CZAS UTRZYMANIA (DEAD TIME)	Nr. MARTWE 6 h PO OPRYSKU	Nr. MARTWE 12 godz. PO OPRYSKU	Nr. MARTWE 24 GODZ. PO OPRYSKU
Obszar zabiegowy	A1
	A2
	A3
	A4
	A5
	B1
	B2
	B3
	B4
	B5
	C1
	C2
	C3
	C4
	C5
	D1
	D2
	D3
	D4
	D5
	E1
	E2
	E3
	E4
	E5
Obszar kontrolny	Kontrola 1
	Kontrola 2
	Kontrola 3
	Kontrola 4
	Kontrola 5
	Kontrola 6
	Kontrola 7
	Kontrola 8
	Kontrola 9
	Kontrola 10

Tabela 1: Formularz danych dotyczących śmiertelności próbek. Formularz zawiera pola na informacje ogólne o próbie polowej w lewym górnym rogu, co jest kluczowe dla zarządzania danymi z wielu projektów terenowych. Główna sekcja formularza zawiera pola na śmiertelność przed i po oprysku (oba zestawienia kopiowane bezpośrednio z klatek strażniczych), a także późniejsze kontrole po 6 h, 12 h i 24 h. Dane zapisane odręcznie w tym formularzu są wprowadzane do analogicznego arkusza kalkulacyjnego, z dodatkowymi kolumnami służącymi do korekty danych o śmiertelności względem osobników martwych przed opryskiem oraz do korekty śmiertelności w obszarze oprysku o śmiertelność wywołaną czynnikami środowiskowymi w obszarze kontrolnym.

	PROCENT ŚMIERTELNOŚCI (PO KOREKCJI ABBOTTTA)
Kod klatki strażniczej	(A) Aqualuer + woda	(B) Aqualuer + olej napędowy	(C) Aqualuer + BVA13
A1	1	0.78	0.54
A2	1	1	0.05
A3	1	0.29	0
A4	1	0.04	0.03
A5	1	0.04	0
B1	1	0.79	0
B2	1	0.82	0
B3	1	0.15	0
B4	1	0.21	0.15
B5	1	0	0
C1	1	0.93	0
C2	1	0.71	0.01
C3	1	0.32	0
C4	1	0.26	0
C5	1	0.46	0
D1	1	0.67	0
D2	0.78	0.24	0.01
D3	0.97	0.5	0
D4	1	0.27	0.03
D5	1	0.33	0
E1	1	0.82	-
E2	1	0.88	-
E3	1	1	-
E4	1	0.79	-
E5	1	0.78	-

Tabela 2: Podstawowe dane dotyczące śmiertelności wykorzystane do stworzenia interpolowanej mapy skuteczności na Rysunku 6. Należy zauważyć, że w tej tabeli można zawrzeć niektóre informacje przestrzenne; można to zrobić na przykład poprzez rozdzielenie wierszy i kolumn odpowiednio według odległości od opryskiwacza oraz odległości wzdłuż linii oprysku. Jednakże zmiany czasowe w śmiertelności odpowiadające np. okresowi bezpośrednio po oprysku, 4 h po oprysku i 12 h po oprysku wymagałyby bardziej złożonej tabeli lub dodatkowych tabel. Podobnie, dla zachowania przejrzystości, konieczne jest zastosowanie oddzielnych tabel dla każdego rozcieńczalnika użytego w badaniach, jeśli tabele są podzielone według przestrzeni i czasu.

Dyskusja

Połączenie klasycznego podejścia z wykorzystaniem klatek kontrolnych (sentinel cages) z elektronicznym mapowaniem interpolowanych danych o śmiertelności stanowi unikalną i potężną metodę oceny pestycydów w warunkach polowych, wspierając porównawcze badania skuteczności środków ochrony roślin w wielu środowiskach oraz przy różnych konfiguracjach pestycydów i technik ich aplikacji. Chociaż podstawowa metoda klatek kontrolnych nie jest nowa, wizualizacja wzorców śmiertelności w klatkach kontrolnych w systemie GIS stanowi postęp sprzyjający głębszej analizie wzorców przepływu aerozoli z oprysków pestycydowych. Interpolacja punktowych pomiarów skuteczności pestycydów w formie mapy z kodowaniem kolorystycznym jest analogiczna do dodawania smug dymu w tunelu aerodynamicznym w celu wizualizacji przepływu powietrza wokół samochodu i stanowi znaczną poprawę w raportowaniu przestrzennych i czasowych danych o śmiertelności w porównaniu do serii tabel.

Niektóre części oprysków pestycydami są widoczne gołym okiem, natomiast krople pestycydów z niewidocznych części oprysku można wychwycić na szkiełkach przedmiotowych lub innych nośnikach, co – podobnie jak stosowanie klatek kontrolnych – stanowi ugruntowane protokoły. Produkty parowania kropel oraz same krople można wychwytywać za pomocą bawełnianych taśm i analizować przy użyciu chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas, co dostarcza jeszcze więcej informacji o losach oprysku pestycydowego. Jednakże rzeczywistą skuteczność oprysku oraz przestrzenne wzorce faktycznej śmiertelności wywołanej pestycydami w obszarze docelowym (które mogą obejmować zarówno komponenty kropelkowe, jak i produkty parowania) można jednoznacznie zmierzyć jedynie za pomocą owadów kontrolnych.

Ponadto komponent czasowy skuteczności można jednoznacznie zmierzyć jedynie poprzez serię obserwacji śmiertelności owadów wskaźnikowych, które rejestrują ilościowe wskaźniki szybkiego powalenia versus długoterminowej zachorowalności i śmiertelności gatunków docelowych. Ponownie, seria interpolowanych map z kodowaniem kolorystycznym może zostać wykorzystana do przejrzystej wizualizacji ewolucji śmiertelności po oprysku w czasie, z wyraźnym komponentem przestrzennym, w sposób, którego seria tabel nie jest w stanie przekazać czytelnikowi. Seria map może zostać zanimowana w pętli, aby odtworzyć postęp oprysku i jego efekty na owadach wskaźnikowych, co dodatkowo usprawnia zrozumienie skuteczności nie tylko dla pojedynczego badania, ale także w porównaniach pomiędzy pestycydami, technikami, sprzętem aplikacyjnym, owadami docelowymi i strefami ekologicznymi.

Aby uzyskać najwyższą jakość danych o śmiertelności w tej metodzie, należy zachować szczególną staranność podczas całego procesu obchodzenia się z owadami wskaźnikowymi oraz ich obserwacji. Czas i warunki ekspozycji owadów wskaźnikowych na środowisko, zarówno w obszarach badanych, jak i kontrolnych, przed opryskiem pestycydem powinny być w miarę możliwości identyczne. Ekspozycja ta powinna obejmować okres aklimatyzacji do warunków otoczenia oraz jednolity czas oczekiwania po oprysku dla owadów z grupy badanej i kontrolnej. Obserwacje śmiertelności przed opryskiem, po czasie oczekiwania (t.j. podczas odbierania klatek) oraz w wyznaczonych okresach po oprysku powinny być starannie odnotowywane w arkuszach danych. Należy również zadbać o odebranie wszystkich osobników wskaźnikowych z terenu przed powrotem do laboratorium. Klatki z owadami kontrolnymi i badanymi powinny być fizycznie od siebie oddzielone przez cały czas trwania protokołu. Niezawodne obserwacje tła śmiertelności bazowej w klatkach kontrolnych we wszystkich wyznaczonych punktach czasowych są kluczowe dla właściwej korekty zaobserwowanej śmiertelności w strefie badanej. Dokładne, precyzyjne, porównywalne i znaczące mapy skuteczności można uzyskać wyłącznie na podstawie wysokiej jakości danych o śmiertelności wprowadzonych do systemu informacji geograficznej.

Metoda owadów strażniczych jest z natury elastyczna i znajduje zastosowanie w wielu scenariuszach – dane dotyczące śmiertelności można gromadzić wszędzie tam, gdzie możliwe jest umieszczenie małej klatki. Przykładowo, przeprowadziliśmy próby z pestycydami, w których klatki strażnicze rozmieszczono wewnątrz i wokół symulowanych budynków miejskich oraz wiejskich¹⁰, a także w namiotach wojskowych USA (dane niepublikowane 2017-2018), oprócz wielu scenariuszy obejmujących roślinność pustynną, umiarkowaną i tropikalną^19,20,21,22 [w tym wciąganie klatek na wysokość do 60 ft w korony sosen w celu pomiaru pionowej śmiertelności po szerokozakresowym oprysku lotniczym (dane niepublikowane 2011-2017)]. Jeśli grunt jest zbyt twardy, aby wbić słupki klatek strażniczych, lub jeśli preferowane jest ich rozmieszczenie na powierzchniach betonowych lub asfaltowych, można skonstruować proste podstawki lub bloki betonowe do podtrzymania słupków. W scenariuszach badających rozpylone ciekłe larwybójki protokół można zmodyfikować, rozmieszczając w punktach strażniczych puste, plastikowe jednorazowe kubki o pojemności 1 qt w celu wychwycenia larwybójki. Kubki te można później napełnić wodą i larwami komarów, aby zmierzyć skuteczność aplikacji^7,23,24,25. Należy użyć płytek podłogowych z warstwą klejącą skierowaną do góry, aby utrzymać kubki na miejscu przy wietrze, oraz trzymać pokrywki w pobliżu, aby szybko zakryć i zebrać próbki po upływie czasu karencji po oprysku. Alternatywnie, kubki można pozostawić w miejscu, aby poddać je naturalnym warunkom atmosferycznym, lub pozostawić otwarte w kontrolowanym środowisku w celu zbadania trwałości pozostałości preparatu larwybójczego.

Aby zbadać gęstość kropel oraz spektrum kropel w całym obszarze aplikacji, w pobliżu pozycji owadów strażników można umieścić wirówki do szkiełek (slide spinners) – należy jednak zachować ostrożność, aby wir utworzony przez obracające się szkiełka nie wpływał na przepływ oprysku pestycydowego docierającego do owadów strażników. Podobnie jak w przypadku mapowania śmiertelności, do tabeli atrybutów dla lokalizacji strażników można dodać dodatkowe kolumny dla parametrów kropel i barwnika w celu wyprowadzenia interpolowanych zasięgów pokrycia. Należy zauważyć, że wprowadzenie aspektów zbierania kropel będzie wymagało zwiększenia liczby personelu w terenie, na przykład poprzez wyznaczenie zespołów dedykowanych do ostrożnego zbierania szkiełek oraz wspierania operatora oprysku w kwestii dodatków barwnikowych. Dzięki dodatkowym materiałom i zespołom personelu metody te można połączyć, aby przeprowadzić jednoczesne próby z wykorzystaniem larw i dorosłych owadów strażników, wielu trybów aplikacji (lotniczej, naziemnej, przenośnej) lub różnych pestycydów w układzie równoległym (patrz: reprezentatywne wyniki).

Chociaż główny protokół został opracowany dla komarów, z sukcesem przeprowadziliśmy próby polowe z wykorzystaniem muchówek piaskowych oraz muchy z grupy muchy synantropijne (brudne) w roli organizmów wskaźnikowych, wprowadzając jedynie niewielkie modyfikacje w klatkach dla organizmów wskaźnikowych oraz w ogólnym protokole. Na przykład, określanie płci dorosłych muchówek piaskowych lub much synantropijnych nie jest praktyczne, dlatego w klatkach wskaźnikowych stosuje się grupy o mieszanej płci, co zmniejsza obciążenie kolonii, ponieważ wymagana jest mniejsza liczba osobników niż w przypadku pracy z komarami. W przypadku muchówek piaskowych do klatek wskaźnikowych należy użyć bardzo gęstej siatki; ponadto muchówek piaskowych nie poddaje się anestezji, lecz wprowadza aspiratorami bezpośrednio do w pełni zmontowanych klatek poprzez gumową szczelinę przyklejoną do otworu wyciętego w boku cylindra.

Rysunek 8: Dodatkowe scenariusze demonstrujące elastyczność systemu strażniczego. Protokół strażniczy służący do badania skuteczności pestycydów w terenie jest bardzo elastyczny, co obrazują klatki strażnicze zawieszone w odstępach do 60 stóp w koronach sosen (A) oraz w pobliskim otwartym terenie (B) w celu zbadania zdolności powietrznego oprysku pestycydowego ULV do penetracji koron drzew. System strażniczy można łatwo dostosować do badania oprysków larwicydowych skierowanych przeciwko niedojrzałym stadiom komarów, wykorzystując jednorazowe plastikowe kubki do wychwytywania kropel w warunkach wewnątrzpomieszczeniowych (C) oraz na zewnątrz w symulowanym obszarze miejskim (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Metoda mapowania skuteczności jest z natury elastyczna, ponieważ opiera się na interpolacji, która jest standardowym procesem w większości programów GIS.²⁶Ogólnie interpolacja wykorzystuje znane dane w określonych punktach do szacowania danych w pobliskich punktach niepróbkowanych. Istnieje kilka rodzajów technik interpolacji.²⁷ które można dobrać w zależności od przestrzennego rozkładu i gęstości danych dotyczących śmiertelności punktowej. Zastosowano metodę odważonego dystansu (IDW), która przypisuje większą wagę statystyczną znanym danym z punktów położonych bliżej szacowanych punktów nieznanych. Rozwiązywanie problemów w części terenowej metody koncentruje się na śmiertelności kontrolnych osobników wskaźnikowych (t. j. jeśli śmiertelność jest > 25% w grupach kontrolnych i istnieje pewność, że aplikacja nie wpłynęła na obszar kontrolny, oznacza to, że czynnik w środowisku inny niż pestycyd powoduje śmiertelność, co zafałszuje analizę; w takim przypadku badanie będzie wymagało powtórzenia lub przeniesienia w inne miejsce). Najczęstsze słabe punkty w części metody dotyczącej mapowania związane są z generowaniem wysokiej jakości tabel danych w GIS, dlatego kluczowe jest uważne wklejanie danych, aby odpowiednie wartości były przypisane do właściwych punktów (ramka odczytu) oraz prawidłowe etykietowanie kolumn dla każdego okresu śmiertelności, pestycydu, sprzętu aplikacyjnego, itp.

Metoda owadów strażniczych nie została zaprojektowana jako bezwzględna miara skuteczności. Zamiast tego metoda ta umożliwia porównanie względnej skuteczności pestycydów (w określonym środowisku, przy użyciu danego sprzętu aplikacyjnego, rozcieńczalnika, owada docelowego i techniki) w odniesieniu do tego samego pestycydydu w innych warunkach lub porównanie różnych pestycydów w tych samych warunkach. Metoda ta nie obejmuje wychwytywania kropli pestycydów ani składnika aktywnego, choć aparaturę do badania tych aspektów można łatwo umieścić w siatce sąsiadującej z klatkami strażniczymi. Metoda klatek strażniczych nie mierzy skuteczności oprysków pestycydowych przeciwko owadom wektorowym w locie, co jest możliwe, lecz niepraktyczne²⁸. Istnieje ożywiona dyskusja na temat tego, czy rodzaj siatki w klatkach strażniczych wpływa na pomiary skuteczności oprysków pestycydowych^14,29,30,31. Nie ma to jednak większego znaczenia dla naszego celu, jakim jest zbadanie względnej skuteczności danej formulacji w różnych środowiskach lub kilku formulacji w jednym środowisku (co można przeprowadzić przy użyciu standardowej klatki ze standardowym typem siatki).

Na przykład w niedawnym badaniu porównano wyniki śmiertelności w klatkach strażniczych w trzech podobnych eksperymentach dotyczących napowietrznej aplikacji pestycydów, przeprowadzonych w odstępach dziesięcioleci, z których każdy wykorzystywał inne metody klatek strażniczych, a wszystkie przyniosły porównywalne wyniki¹⁰. Podobnie istnieje kontrowersja dotycząca tego, czy przenosić owady strażnicze do klatek „czystych” (t.j. klatek, które nie zostały opryskane). Ponownie, dane dotyczące śmiertelności owadów strażniczych należy rozpatrywać jako względne, a nie bezwzględne, i nie dotyczą one dodatkowej śmiertelności wynikającej z kontaktu owadów strażniczych z pestycydem przylegającym do klatki lub siatki. W rzeczywistości w środowisku naturalnym opryski pestycydami będą również przylegać do naturalnych powierzchni, z którymi mogą kontaktować się docelowe owady. Wcześniej stwierdziliśmy, że śmiertelność wywołana manipulacjami z komarami, w tym znieczuleniem za pomocą CO₂ lub zimna, może przewyższać śmiertelność wynikającą z kontaktu z pestycydem, który mógł znajdować się na klatkach (dane niepublikowane 2008). Kolejnym ograniczeniem jest fakt, że istotność i stosowalność wyników śmiertelności w klatkach strażniczych w odniesieniu do lokalnych naturalnych populacji docelowych owadów nie są jeszcze w pełni znane; jednak im bliższe genealogicznie są hodowane w koloniach owady strażnicze w stosunku do lokalnych gatunków, tym większa jest stosowalność map skuteczności w odniesieniu do populacji lokalnych.

W przyszłych modyfikacjach tej metody korzystne byłoby wprowadzenie zmian umożliwiających zastosowanie systemów bezzałogowych statków powietrznych (UAS) do aplikacji pestycydów. Obecne kierunki rozwoju w wykorzystaniu UAS w operacyjnej kontroli wektorów obejmują aplikację pestycydów (w szczególności preparatów larwicydowych skierowanych do siedlisk niedojrzałych komarów) nad terenami i przez obszary trudno dostępne. Aby uzyskać istotne informacje z prób z wykorzystaniem owadów strażniczych, stacje strażnicze musiałyby zostać rozmieszczone w trudno dostępnych lokalizacjach w możliwie największym zakresie. Przykładem istotnych informacji jest testowanie zdolności UAS do efektywnego dotarcia larvicydem do określonego obszaru przy sterowaniu wyłącznie w linii wzroku przez operatora, który nie może bezpośrednio obserwować obszaru docelowego. Taki scenariusz może wymagać opracowania innych UAS do rozmieszczania i odbierania klatek strażniczych lub kubków do zbierania larvicydów, a także innych systemów do rejestracji danych meteorologicznych w tych trudno dostępnych obszarach docelowych. Dane dotyczące śmiertelności z takiego scenariusza mogą być analizowane w GIS analogicznie do uznanych scenariuszy, z dodatkowymi funkcjami mapy, takimi jak wpływ przeszkód naturalnych, mikrohabitatu i mikrometeorologii, które mogą różnić się od efektów występujących podczas standardowych aplikacji z wykorzystaniem ciężarówek, samolotów lub opryskiwaczy przenośnych. Zaawansowane możliwości GIS, takie jak wizualizacja trójwymiarowych interpolacji śmiertelności wynikająca z rozszerzonego rozmieszczenia stacji strażniczych w siatkach pionowych i poziomych, stanowią również potencjalne rozwiązanie zarówno dla standardowych, jak i nowo powstających technologii aplikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
< mocne> stojaki do testów biologicznych:
plastikowa pokrywa rurki	Visipak	192224
1,25-calowy łącznik PVC SCH-40	Lowes	PVC 00100 0800
1/4-calowy pręt mosiężny	OD K& S Engineering	1165
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Testy biologiczne:
o-ringi silikonowe FDA S-500-70	Uszczelka i opakowanie Alltek	PA-2127-12
dokładne przesiewanie	Walmart	40310-0000-063 białe	T-310
	Marka Fisher Duże		waciki (niesterylne)
plastikowe rurki Regulator	775674		Visipak
	Norgren	R83-200-RNEA
	Wika Instrument Corp	4315031
Kanister			o pojemności 20 funtów
Komora CO2	Podstawy		: Zmodyfikowany pojemnik tupperware (16 filiżanek)
1/4-calowa rurka tygonowa,
aspirator maglite i rurki	Bioquip	2809D	D-cell maglite aspirator
rura PVC do o-ringów	Lowes	PVC 07112 0600	Rura SCH-40 zmodyfikowana za pomocą narzędzia tnącego na wewnętrznej powierzchni, aby pomieścić probówkę do testów biologicznych
Separator poczwarek	John W. Hock Co.	5412
Nazwa<	strong>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klatki wartownicze polowe:
1/2 pt kartonowy korpus puszki	Neptun	295
1/2 pt kartonowa pokrywka na kubek	Neptun	295A
przesiewanie zgrubne	Walmart	41721-0540-063 biały	T-1721
Opaski kablowe na rzepy 8 cali x 1/2 cala	Rzep marki	VEL91140
gumka	Narodowe Instytuty dla Niewidomych	7510-01-058-9974
waciki	Marka Fisher Duże		waciki (niesterylne)
Przekładki PVC	Lowes	PVC 04010 0600	Zmodyfikowane przez pocięcie na kawałki o długości 18 cali i odcięcie połowy końca (wzdłuż)
Pojemniki na tace	Blue Ridge Thermalforming	400-3N-WHT-ABS
strong>Nazwa	>Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Sprzęt do przeprowadzania testów biologicznych w terenie:
60-calowy słupek bieżnika	Jeffers.com	T8T4
1 ft3 pudełka kartonowe	USP	S-18344
Kubki delikatesowe	WNA Inc.
18-calowe x 18-calowe płytki linolium	Lowes	LSS4307BPS
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Sentinel transport w klatce:
48 qt Chłodnica Island Breeze	Igloo
Ręczniki frotte 16 cali x 19 cali	Ability One	7920-01-454-1150
worki			13 galonów (rozmiar kuchni)

waciki miernik regilatora CO2 zmodyfikowana <APCOMBO16 na śmieci