Artykuł metodologiczny

Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów

DOI:

10.3791/58441

⸱

10 grudnia 2018

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół ekspresji białek do protoplastów za pomocą metody transformacji za pośrednictwem PEG. Metoda ta zapewnia łatwą ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania oraz efektywne badanie lokalizacji białek i procesu importu dla różnych warunków eksperymentalnych in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chloroplast jest niezbędnym organellem, który jest odpowiedzialny za różne procesy komórkowe w roślinach, takie jak fotosynteza i produkcja wielu wtórnych metabolitów i lipidów. Chloroplasty wymagają dużej liczby białek do tych różnych procesów fizjologicznych. Ponad 95% białek chloroplastowych jest kodowanych przez jądro i importowanych do chloroplastów z cytozolu po translacji na rybosomy cytozolowe. Tak więc właściwy import lub ukierunkowanie tych kodowanych przez jądro białek chloroplastowych na chloroplasty jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania chloroplastów, a także komórki roślinnej. Białka chloroplastowe kodowane w jądrze zawierają sekwencje sygnałowe do specyficznego kierowania na chloroplasty. Maszyneria molekularna zlokalizowana w chloroplastie lub cytozolu rozpoznaje te sygnały i przeprowadza proces importu. Aby zbadać mechanizmy importu białek lub kierowania ich do chloroplastów in vivo, opracowaliśmy szybką, wydajną metodę analizy importu białek do chloroplastów rzodkiewnika (Arabidopsis) opartą na protoplastach. W tej metodzie wykorzystujemy protoplasty wyizolowane z tkanek liści rzodkiewnika. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół użycia protoplastów do zbadania mechanizmu, za pomocą którego białka są importowane do chloroplastów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chloroplast jest jednym z najważniejszych organelli w roślinach. Jedną z głównych funkcji chloroplastów jest przeprowadzanie fotosyntezy1. Chloroplasty przeprowadzają również wiele innych reakcji biochemicznych w celu produkcji kwasów tłuszczowych, aminokwasów, nukleotydów i licznych metabolitów wtórnych1,2. Do wszystkich tych reakcji chloroplasty wymagają dużej liczby różnych typów białek. Jednak genom chloroplastów zawiera tylko około 100 genów3,4. Dlatego chloroplasty muszą importować większość swoich białek z cytozolu. W rzeczywistości wykazano, że większość białek chloroplastowych została zaimportowana z cytozolu po translacji4,5,6. Komórki roślinne wymagają specyficznych mechanizmów importowania białek z cytozolu do chloroplastów. Jednak, mimo że te mechanizmy importu białek są badane od kilkudziesięciu lat, nadal nie rozumiemy ich w pełni na poziomie molekularnym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę otrzymywania protoplastów i egzogennej ekspresji genów w protoplastach. Metoda ta może być cenna dla szczegółowego wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw importu białek do chloroplastów.

Import białek może być badany przy użyciu wielu różnych podejść. Jedna z tych metod polega na wykorzystaniu systemu importu białek in vitro7,8. Stosując to podejście, prekursory białek ulegające translacji in vitro są inkubowane z oczyszczonymi chloroplastami in vitro, a import białek jest analizowany za pomocą SDS-PAGE, a następnie analizy western blot. Zaletą tego podejścia jest to, że każdy etap importu białka do chloroplastów może być szczegółowo zbadany. W związku z tym metoda ta jest szeroko stosowana do definiowania składników maszynerii molekularnej importu białek oraz do analizy informacji o sekwencji peptydów tranzytowych. Niedawno opracowano inne podejście polegające na wykorzystaniu protoplastów z tkanek liści, które stało się szeroko stosowane do badania importu białek do chloroplastów9,10. Zaletą tego podejścia jest to, że protoplasty zapewniają środowisko komórkowe, które jest bliższe środowisku nienaruszonych komórek niż system in vitro. W ten sposób system protoplastów pozwala nam zająć się wieloma dodatkowymi aspektami tego procesu, takimi jak związane z nim zdarzenia cytozolowe i sposób określania specyficzności sygnałów docelowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania protoplastów do badania importu białek do chloroplastów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost roślin Arabidopsis

  1. Przygotować 1 l pożywki Gamborg B5 (B5), dodając 3,2 g pożywki B5 zawierającej witaminy, 20 g sacharozy, 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) do około 800 ml wody dejonizowanej i dostosować pH do 5,7 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Dodać więcej wody dejonizowanej, zwiększyć całkowitą objętość do 1 l. Dodać 8 g fitoagaru i sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C.
  2. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury 55 °C i wlać 20-25 ml pożywki B5 na szalkę Petriego (o średnicy 9 cm, wysokości 1,5 cm) na czystej ławce. Suszyć talerze przez 2 – 3 dni, zawinąć je w czystą folię i przechowywać w lodówce do czasu użycia.
  3. Wysterylizuj nasiona Arabidopsis thaliana z 1 ml 70% (v/v) etanolu w probówce wirówkowej (e-tube), wytrząsając w sposób ciągły przez 2 – 3 minuty. Usuń supernatant, dodaj 1 ml 1% (v/v) roztworu podchlorynu sodu i wstrząsaj w sposób ciągły przez 2 – 3 minuty. Przygotuj 100 – 150 nasion na szalkę Petriego.
    1. Usunąć supernatanty i umyć nasiona 1 ml wody destylowanej. Powtórz ten krok 4 razy. Umieść wysterylizowane nasiona w temperaturze 4 °C na 3 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie nasion.
  4. Wysiewaj 100 – 150 nasion na płytki B5 za pomocą mikropipety i uszczelnij płytkę taśmą chirurgiczną.
  5. Uprawiaj rośliny w pomieszczeniu do uprawy z cyklem 16 godzin/8 godzin światła/ciemności przy natężeniu światła 100 μmol·m-2·s-1, wilgotności względnej 70% i temperaturze 20 °C przez 2 tygodnie.

2. Przygotowanie plazmidu

UWAGA: Plazmidy o wysokiej czystości powinny być używane do transformacji; zaleca się użycie komercyjnego zestawu do oczyszczania plazmidów.

  1. Oczyść plazmid (RbcS-nt:GFP) za pomocą zestawu do izolacji DNA. Aby zagęścić DNA, należy przeprowadzić wytrącanie etanolu w probówce o pojemności 1,5 ml i rozpuścić osad DNA w 100 μl wody destylowanej. Oznaczyć stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm. Rozcieńczyć plazmid do końcowego stężenia ~ 2 μg/μL. Plazmid należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

3. Izolacja protoplastów

  1. Przygotuj następujące rozwiązania.
    1. Przygotować roztwór enzymu tak, aby zawierał 0,25% (m/v) macerozymu, 1,0% (m/v) celulazy, 400 mM D-mannitolu, 8 mM chlorku wapnia (CaCl2), 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5 mM MES. Dostosuj pH do 5,6 za pomocą KOH.
      1. Przefiltrować roztwór enzymatyczny za pomocą jednostki filtrującej z octanu celulozy o wielkości porów 0,45 μm. Podzielić 25 ml roztworu enzymu na stożkowe probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić roztwór enzymu w temperaturze pokojowej (RT) i dobrze wymieszać tuż przed użyciem.
    2. Przygotować 21% (w/v) roztwór sacharozy, rozpuszczając 21 g sacharozy w 100 ml wody dejonizowanej i autoklawować roztwór.
    3. Przygotować roztwór W5 zawierający 154 mM chlorku sodu (NaCl), 125 mM CaCl2, 5 mM chlorku potasu (KCl), 5 mM glukozy i 1,5 mM MES. Dostosuj pH do 5,6 za pomocą KOH i autoklaw roztworu.
    4. Przygotować roztwór MaMg zawierający 400 mM D-mannitolu, 15 mM chlorku magnezu (MgCl2) i 5 mM MES. Dostosuj pH do 5,6 za pomocą KOH i autoklaw roztworu.
    5. Przygotować 1 M roztwory podstawowe D-mannitolu i 1 M azotanu wapnia w celu przygotowania roztworu PEG. Autoklaw tych roztworów.
  2. Zbierz nienaruszone tkanki liści z 2-tygodniowych roślin z ~ 1 – 2 płytek B5 za pomocą noża chirurgicznego i umieść zebrane liście w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu enzymu. Umieść stożkową rurkę zawierającą roztwór enzymu i tkanki liści poziomo na wytrząsarce obrotowej, delikatnie mieszając w ciemności. Pełne trawienie tkanek liści trwa od 8 do 12 godzin.
  3. Po 8 – 12 godzinach od inkubacji wlać roztwór enzymu (zawierający protoplasty uwolnione z tkanek liści) na świeżą szalkę Petriego przez siatkę o wielkości porów 140 μm. Ostrożnie nałożyć roztwór enzymu zawierający protoplasty na 15 ml 21% (m/v) roztworu sacharozy i odwirować go przy 98 x g przez 10 minut przy najniższych ustawieniach przyspieszenia i opóźnienia w wirniku z wahliwym kubełkiem.
  4. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie przenieść protoplasty z najwyższej warstwy (roztworu enzymu) i na granicy faz między roztworem enzymu a roztworem sacharozy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml roztworu W5. Odwirować tę probówkę o masie 51 x g przez 6 minut. Na tym etapie protoplasty będą znajdować się w osadzie na dnie stożkowej rurki.
  5. Supernatant należy ostrożnie wyrzucić za pomocą pipety, nie naruszając osadu protoplastów. Dodać 25 ml roztworu W5 i delikatnie zawiesić protoplasty. Inkubować roztwór protoplastu w lodówce o temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę w celu ustabilizowania.

4. Transformacja protoplastu przy użyciu glikolu polietylenowego

  1. Przygotuj 40% roztwór PEG, dodając 4 g PEG 8000, 4 ml 1 M roztworu mannitolu, 1 ml 1 M Ca(NO3)2 i 1,8 ml wody destylowanej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dobrze wymieszaj. Rozpuść PEG przez ogrzewanie w kuchence mikrofalowej przez 20 – 30 s. Umieść 40% roztwór PEG w temperaturze pokojowej w celu ostygnięcia.
    UWAGA: 40% roztwór PEG należy za każdym razem przygotowywać na świeżo. Jeżeli protoplasty nie zostaną całkowicie granulowane podczas inkubacji w temperaturze 4 °C w lodówce, należy odwirować materiał w temperaturze 46 x g przez 2 minuty.
  2. Usunąć sklarowany osad ostrożnie, ale całkowicie i dodać roztwór MaMg do osadu protoplastu, aby uzyskać stężenie 5 x 106/mL.
    UWAGA: Liczbę protoplastów można określić za pomocą hemocytometru oglądanego pod mikroskopem.
  3. Umieścić 10 μg plazmidowego DNA w każdej pustej probówce okrągłodennej o pojemności 13 ml i dodać 300 μl roztworu protoplastu za pomocą pipety.
    UWAGA: Koniec końcówki pipety powinien być odcięty. Za każdym razem, gdy pobiera się próbkę z protoplastów, roztwór zawierający protoplasty powinien być ponownie zawieszony tuż przed pipetowaniem, tak aby do każdej probówki dodać tę samą liczbę protoplastów.
  4. Wymieszaj plazmidowe DNA z protoplastami, delikatnie obracając probówki i natychmiast dodaj 300 μl 40% roztworu PEG za pomocą pipety. Wymieszać delikatnie, ale całkowicie, obracając probówki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej; Przechyl rurkę prawie poziomo i obróć ją kilka razy.
  5. Dodać 1 ml roztworu W5 i delikatnie, ale całkowicie wymieszać, obracając probówkę ręcznie w podobny sposób. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, używając odpowiednio 1,5 ml i 2 ml roztworu W5. Inkubować przez 30 minut po ostatnim dodaniu roztworu W5.
  7. Wirować przy 46 x g przez 4 min. Odrzucić supernatant i dodać 2 ml roztworu W5. Wymieszaj delikatnie, ale całkowicie. Inkubować w temperaturze 22 °C w ciemnej komorze.

5. Analiza importu białek do chloroplastów

UWAGA: Po transformacji protoplastów za pośrednictwem PEG, czas inkubacji wynosi od 8 do 24 godzin.

  1. Mikroskopia fluorescencyjna
    1. Umieścić 10 μl roztworu protoplastu na szkiełku szkiełkowym za pomocą pipety z przyciętą końcówką i ostrożnie przykryć szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć uszkodzenia protoplastów.
    2. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestawy filtrów wzbudzenia/emisji do obserwacji białka zielonej fluorescencji (GFP) i autofluorescencji chlorofilu.
    3. Rejestruj obrazy za pomocą chłodzonej kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) i przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do edycji obrazów w celu uzyskania pseudokolorowych obrazów.
  2. Ekstrakcja białka całkowitego i immunoblotting
    1. Przygotować bufor denaturacyjny zawierający 2,5% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 2% (v/v) 2-merkaptoetanolu.
      UWAGA: Import białka do chloroplastów można określić ilościowo, mierząc stopień przetwarzania peptydów tranzytowych za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciała anty-GFP.
    2. Przenieść protoplasty do probówki wirówkowej i wirować przy 46 x g przez 4 min.
    3. Usunąć supernatant i dodać 80 μl buforu denaturacyjnego. Energicznie wirować przez 5 s i dodać 5x bufor próbki SDS (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0,5 M DTT, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) błękit bromofenolowy i 50% (v/v) glicerol). Dobrze wymieszaj i gotuj przez 10 minut.
    4. Poddaj tę próbkę białka standardowemu SDS-PAGE i immunoblottingowi z przeciwciałem anty-GFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Import białek do chloroplastów można zbadać za pomocą dwóch metod: mikroskopii fluorescencyjnej i analizy immunoblot po separacji za pośrednictwem SDS-PAGE. Tutaj użyliśmy RbcS-nt:GFP, konstruktu fuzyjnego kodującego 79 N-końcowych reszt aminokwasowych RbcS zawierających peptyd tranzytowy połączony z GFP. Gdy białka są importowane do chloroplastów, zielone sygnały fluorescencyjne z docelowego białka RbcS-nt: GFP powinny łączyć się z czerwonymi sygnałami fluorescencyjnymi z autofluorescenc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczyliśmy szczegółowy protokół wykorzystania protoplastów Arabidopsis do badania importu białek do chloroplastów. Ta metoda jest skuteczna w badaniu procesu importu białek. Ta prosta, wszechstronna technika jest przydatna do badania kierowania zamierzonych białek ładunku do chloroplastów. Za pomocą tej metody z tkanek liści rzodkiewnika11,12 przygotowuje się protoplasty, które można uzyskać z roślin na wielu różnych etapach wzrostu, od bard...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana przy wsparciu Wspólnego Programu Badawczego na rzecz Rozwoju Nauki i Technologii Rolniczych (Projekt nr. PJ010953012018), Administracja Rozwoju Obszarów Wiejskich oraz grant Narodowej Fundacji Badawczej (Korea) finansowany przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych (nr 2016R1E1A1A02922014), Republika Korei.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GAMBORG B5 POŻYWKA ZAWIERAJĄCA WITAMINYDuchefa BiochemieG0210.0050
SACHAROZADuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar, proszekJUNSEI24440S1201
Taśma chirurgiczna Micropore3M1530-0
Ostrze chirurgiczne nierdzewna nr 10PIÓRONiedostępna
probówka stożkowa, 50mlSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Niedostępna
celulaza ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Niedostępne
ALBUMINA, BYDLĘCA (BSA)VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
CHLOREK WAPNIA, DIHYDRATMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
Sitka do CD-1SIGMAS1145
Sitka do CD-1SIGMAS3895
Szalka PetriegoSPL LIFE SCIENCES10090
Pipeta PasteuraHILGENBERG3150102
WIRÓWKA LABORATORYJNA /WIZJAVS-5500N
Chlorek soduJUNSEI19015S0350
Chlorek potasuSIGMAP3911-1KG
D-GLUKOZA, BEZWODNABIO BASICGB0219
Wodorotlenek potasuDUKSAN40
Czterowodny azotan wapniaSIGMAC2786-500G
Poli(glikol etylenowy)SIGMAP2139-2KG
Chlorek magnezu sześciowodnySIGMAM2393-500G
Tubka 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
Preparaty mikroskopoweMARIENFELD1000412
Okulary nakrywkowe do mikroskopówMARIENFELD101030
Komora liczącaMARIENFELD650030
Mikroskop obrazowy Axioplan 2Carl ZeissNiedostępny
Mikroprobówka 1,5 mlSARSTEDT72.690.001
2- MerkaptoetanolSIGMAM3148-250ML
Dodecylosiarczan sodu (SDS), klasa proteomicznaVWRM107-500G
TRIS, ultra czysty VWR0497-5KG
DTT (DL-Ditiothreitol), klasa biotechnologicznaVWR0281-25G
Sól sodowa niebieskiego bromofenolu ACSVWR0312-50G
GlicerolJUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. Przeciwciało monoklonalne (JL-8)TAKARA632381
LABORATORYJNA SCIENTIFIC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
  4. Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
  5. Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
  6. Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
  7. Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
  8. Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
  9. Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
  10. Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
  11. Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
  12. Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
  13. Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
  14. Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
  15. Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
  16. Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

Powiązane artykuły