Method Article

Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów

DOI:

10.3791/58441

⸱

December 10th, 2018

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół ekspresji białek do protoplastów za pomocą metody transformacji za pośrednictwem PEG. Metoda ta zapewnia łatwą ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania oraz efektywne badanie lokalizacji białek i procesu importu dla różnych warunków eksperymentalnych in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chloroplast jest niezbędnym organellem, który jest odpowiedzialny za różne procesy komórkowe w roślinach, takie jak fotosynteza i produkcja wielu wtórnych metabolitów i lipidów. Chloroplasty wymagają dużej liczby białek do tych różnych procesów fizjologicznych. Ponad 95% białek chloroplastowych jest kodowanych przez jądro i importowanych do chloroplastów z cytozolu po translacji na rybosomy cytozolowe. Tak więc właściwy import lub ukierunkowanie tych kodowanych przez jądro białek chloroplastowych na chloroplasty jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania chloroplastów, a także komórki roślinnej. Białka chloroplastowe kodowane w jądrze zawierają sekwencje sygnałowe do specyficznego kierowania na chloroplasty. Maszyneria molekularna zlokalizowana w chloroplastie lub cytozolu rozpoznaje te sygnały i przeprowadza proces importu. Aby zbadać mechanizmy importu białek lub kierowania ich do chloroplastów in vivo, opracowaliśmy szybką, wydajną metodę analizy importu białek do chloroplastów rzodkiewnika (Arabidopsis) opartą na protoplastach. W tej metodzie wykorzystujemy protoplasty wyizolowane z tkanek liści rzodkiewnika. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół użycia protoplastów do zbadania mechanizmu, za pomocą którego białka są importowane do chloroplastów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chloroplast jest jednym z najważniejszych organelli w roślinach. Jedną z głównych funkcji chloroplastów jest przeprowadzanie fotosyntezy1. Chloroplasty przeprowadzają również wiele innych reakcji biochemicznych w celu produkcji kwasów tłuszczowych, aminokwasów, nukleotydów i licznych metabolitów wtórnych1,2. Do wszystkich tych reakcji chloroplasty wymagają dużej liczby różnych typów białek. Jednak genom chloroplastów zawiera tylko około 100 genów3,4. Dlatego chloroplasty muszą importować większość swoich białek z cytozolu. W rze....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost roślin Arabidopsis

  1. Przygotować 1 l pożywki Gamborg B5 (B5), dodając 3,2 g pożywki B5 zawierającej witaminy, 20 g sacharozy, 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) do około 800 ml wody dejonizowanej i dostosować pH do 5,7 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Dodać więcej wody dejonizowanej, zwiększyć całkowitą objętość do 1 l. Dodać 8 g fitoagaru i sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C.
  2. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury 55 °C i wlać 20-25 ml pożywki B5 na szalkę Petriego (o średnicy 9 cm, wysokości 1,5 cm) na czystej ławce. Suszyć talerze przez 2 – 3 dni, zawinąć je w czystą folię i prze....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Import białek do chloroplastów można zbadać za pomocą dwóch metod: mikroskopii fluorescencyjnej i analizy immunoblot po separacji za pośrednictwem SDS-PAGE. Tutaj użyliśmy RbcS-nt:GFP, konstruktu fuzyjnego kodującego 79 N-końcowych reszt aminokwasowych RbcS zawierających peptyd tranzytowy połączony z GFP. Gdy białka są importowane do chloroplastów, zielone sygnały fluorescencyjne z docelowego białka RbcS-nt: GFP powinny łączyć się z czerwonymi sygnałami fluorescencyjnymi z autofluorescenc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczyliśmy szczegółowy protokół wykorzystania protoplastów Arabidopsis do badania importu białek do chloroplastów. Ta metoda jest skuteczna w badaniu procesu importu białek. Ta prosta, wszechstronna technika jest przydatna do badania kierowania zamierzonych białek ładunku do chloroplastów. Za pomocą tej metody z tkanek liści rzodkiewnika11,12 przygotowuje się protoplasty, które można uzyskać z roślin na wielu różnych etapach wzrostu, od bard.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana przy wsparciu Wspólnego Programu Badawczego na rzecz Rozwoju Nauki i Technologii Rolniczych (Projekt nr. PJ010953012018), Administracja Rozwoju Obszarów Wiejskich oraz grant Narodowej Fundacji Badawczej (Korea) finansowany przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych (nr 2016R1E1A1A02922014), Republika Korei.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GAMBORG B5 POŻYWKA ZAWIERAJĄCA WITAMINYDuchefa BiochemieG0210.0050
SACHAROZADuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar, proszekJUNSEI24440S1201
Taśma chirurgiczna Micropore3M1530-0
Ostrze chirurgiczne nierdzewna nr 10PIÓRONiedostępna
probówka stożkowa, 50mlSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Niedostępna
celulaza ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Niedostępne
ALBUMINA, BYDLĘCA (BSA)VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
CHLOREK WAPNIA, DIHYDRATMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
Sitka do CD-1SIGMAS1145
Sitka do CD-1SIGMAS3895
Szalka PetriegoSPL LIFE SCIENCES10090
Pipeta PasteuraHILGENBERG3150102
WIRÓWKA LABORATORYJNA /WIZJAVS-5500N
Chlorek soduJUNSEI19015S0350
Chlorek potasuSIGMAP3911-1KG
D-GLUKOZA, BEZWODNABIO BASICGB0219
Wodorotlenek potasuDUKSAN40
Czterowodny azotan wapniaSIGMAC2786-500G
Poli(glikol etylenowy)SIGMAP2139-2KG
Chlorek magnezu sześciowodnySIGMAM2393-500G
Tubka 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
Preparaty mikroskopoweMARIENFELD1000412
Okulary nakrywkowe do mikroskopówMARIENFELD101030
Komora liczącaMARIENFELD650030
Mikroskop obrazowy Axioplan 2Carl ZeissNiedostępny
Mikroprobówka 1,5 mlSARSTEDT72.690.001
2- MerkaptoetanolSIGMAM3148-250ML
Dodecylosiarczan sodu (SDS), klasa proteomicznaVWRM107-500G
TRIS, ultra czysty VWR0497-5KG
DTT (DL-Ditiothreitol), klasa biotechnologicznaVWR0281-25G
Sól sodowa niebieskiego bromofenolu ACSVWR0312-50G
GlicerolJUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. Przeciwciało monoklonalne (JL-8)TAKARA632381
LABORATORYJNA SCIENTIFIC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

Related Articles