Method Article

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie sercowych komórek macierzystych z serca dorosłej myszy

DOI:

10.3791/58448

⸱

January 7th, 2019

 , 
1Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Anesthesiology, University of Nebraska Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tego artykułu jest ujednolicenie protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych serca (CSC) od serca dorosłej myszy. W tym miejscu opisujemy metodę wirowania w gradimencie gęstości w celu wyizolowania mysich CSC oraz opracowane metody hodowli CSC, proliferacji i różnicowania do kardiomiocytów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Głównym celem medycyny regeneracyjnej jest uzupełnienie martwego mięśnia sercowego po zawale mięśnia sercowego. Chociaż do regeneracji mięśnia sercowego zastosowano kilka strategii, terapia komórkami macierzystymi pozostaje głównym podejściem do uzupełniania martwego mięśnia sercowego serca z zawałem mięśnia sercowego. Coraz więcej dowodów wskazuje na obecność rezydentnych sercowych komórek macierzystych (CSC) w sercu dorosłego człowieka oraz ich wpływ na gospodarkę hormonalną i/lub parakrynną na regenerację serca. Jednak izolacja CSC oraz ich charakterystyka i różnicowanie w kierunku komórek mięśnia sercowego, zwłaszcza kardiomiocytów, pozostaje wyzwaniem technicznym. W niniejszym badaniu przedstawiliśmy prostą metodę izolacji, charakterystyki i różnicowania CSC z serca dorosłej myszy. W tym miejscu opisujemy metodę gradientu gęstości do izolacji CSC, w której serce jest trawione przez 0,2% roztwór kolagenazy II. Aby scharakteryzować izolowane CSC, oceniliśmy ekspresję CSC / markerów sercowych Sca-1, NKX2-5 i GATA4 oraz markerów pluripotencji / łodygi OCT4, SOX2 i Nanog. Określiliśmy również potencjał proliferacyjny izolowanych CSC, hodując je na szalce Petriego i oceniając ekspresję markera proliferacji Ki-67. Aby ocenić potencjał różnicowania CSC, wybraliśmy CSC z siedmiodniową hodowlą od siedmiu do dziesięciu dni. Przenieśliśmy je na nową płytkę z pożywką do różnicowania kardiomiocytów. Inkubuje się je w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 12 dni, a pożywkę różnicującą zmienia się co trzy dni. Zróżnicowane CSC wyrażają markery specyficzne dla kardiomiocytów: aktyninę i troponinę I. W związku z tym CSC wyizolowane za pomocą tego protokołu mają markery macierzyste i sercowe oraz mają potencjał do proliferacji i różnicowania w kierunku linii kardiomiocytów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba niedokrwienna serca, w tym zawał mięśnia sercowego (MI), jest główną przyczyną zgonów na całym świecie1. Terapia komórkami macierzystymi w celu regeneracji martwego mięśnia sercowego pozostaje głównym podejściem do poprawy funkcji serca u pacjenta z zawałem serca sup class<="xref">2,3,4,5. Różne rodzaje komórek macierzystych zostały wykorzystane do uzupełnienia martwego mięśnia sercowego i poprawy funkcji serca z zawałem mięśnia sercowego. Można je ogólnie podzielić na embrionalne komórki macierzyste6 i dorosłe komórki macierzyste. W dorosłych komórkach macierzystych zastosowano różne typy komórek macierzystych, takie jak komórki jednojądrzaste pochodzące ze szpiku kostnego7,8, mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego9,10, tkanka tłuszczowa11,12 i pępowina13, oraz CSCs14,15. Komórki macierzyste mogą wspomagać regenerację serca poprzez działania endokrynologiczne i/lub parakrynne16,17,18,19,20. Jednak głównym ograniczeniem terapii komórkami macierzystymi jest uzyskanie odpowiedniej liczby komórek macierzystych, które mogą się namnażać i/lub różnicować w kierunku określonej linii serca21,22. Autologiczne i allogeniczne przeszczepianie komórek macierzystych jest ważnym wyzwaniem w terapii komórkami macierzystymi9. CSC mogą być lepszym podejściem do regeneracji serca, ponieważ pochodzą z serca i można je łatwiej różnicować w linie sercowe niż komórki macierzyste niezwiązane z sercem. W ten sposób zmniejsza ryzyko wystąpienia potworniaka. Ponadto endokrynologiczne i parakrynne działanie CSC, takich jak egzosomy i miRNA pochodzące z CSC, może być bardziej skuteczne niż inne typy komórek macierzystych. W związku z tym CSC pozostaje lepszą opcją do regeneracji serca23,24.

Chociaż CSC są lepszym kandydatem do regeneracji serca w MI ze względu na ich sercowe pochodzenie, głównym ograniczeniem CSC jest mniejsza wydajność z powodu braku skutecznej metody izolacji. Innym ograniczeniem może być upośledzone różnicowanie CSC w kierunku kardiomiocytów lineage2,25,26,27. Aby obejść te ograniczenia, ważne jest opracowanie skutecznego protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania CSC w kierunku linii serca. Nie ma jednego akceptowalnego markera dla CSC, a specyficzna izolacja CSC oparta na markerach na powierzchni komórki daje mniej CSC. W tym przypadku standaryzujemy proste podejście do wirowania gradientowego w celu wyizolowania CSC z serca myszy, które jest opłacalne i skutkuje zwiększoną wydajnością CSC. Te izolowane CSC mogą być wybrane dla określonych markerów powierzchniowych komórek poprzez zwarcie komórek aktywowane fluorescencją. Oprócz izolacji CSC opracowaliśmy protokół hodowli CSC, charakterystyki i różnicowania w kierunku linii kardiomiocytów. W związku z tym przedstawiamy elegancką metodę izolacji, charakteryzowania, hodowli i odróżniania CSC od serc dorosłych myszy (Rysunek 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla, znieczulenie i ofiarowanie myszy zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC Centrum Medycznego Uniwersytetu Nebraska.

1. Materiały

  1. Do izolacji CSC należy użyć 10- do 12-tygodniowych czarnych samców myszy C57BL/6J, trzymanych w instytucjonalistycznym ośrodku dla zwierząt. CSC można również wyizolować od samic myszy niebędących w ciąży.
  2. Wysterylizuj wszystkie niezbędne narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki chirurgiczne, cienkie nożyczki chirurgiczne, kleszczyki z zakrzywionym trzonkiem i ostrze chirurgiczne, autoklawując je przed eutanazją myszy.
  3. Przygotować izolacyjne CSC w stanie wysterylizowanym i przechowywać je w temperaturze 4 °C na lodzie. te obejmują polisarozę i roztwór ditrizoinu sodu dostosowany do gęstości 1,077 g / ml, niekompletne zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium firmy Dulbecco, 1x zrównoważony roztwór soli Ham's (HBSS) i 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) do hodowli komórkowych. Przygotować 1% roztwór podstawowy kolagenazy II (przefiltrowany i wysterylizowany) oraz 0,2% roztwór roboczy w HBSS.
  4. Przechowywać materiały do hodowli tkankowych w stanie wysterylizowanym w komorze bezpieczeństwa biologicznego, w tym na 10-milimetrowej szalce Petriego, płytce 6-dołkowej, 24-dołkowej, kolbach hodowlanych T-25 i T-75, probówkach stożkowych o pojemności 15 ml i 50 ml oraz jednorazowych pipetach serologicznych z sitkami do komórek 40 μm i 100 μm z filtrami 0,22 μm.
  5. Wysterylizuj końcówki do pipet o pojemności 10 μl, 200 μl i 1 000 μl w autoklawie.
  6. Używaj bezpudrowych rękawiczek nitrylowych i 70% etanolu, aby utrzymać sterylny stan przez cały czas trwania eksperymentu.
  7. Użyj 10% wybielacza jako środka dezynfekującego.
  8. Należy użyć dostępnej na rynku pożywki podtrzymującej CSC i pożywki różnicującej kardiomiocyty odpowiednio do hodowli i różnicowania CSC.

2. Metoda izolacji komórek macierzystych serca

  1. Poddaj eutanazji od czterech do pięciu dorosłych samców (lub samic niebędących w ciąży) myszy za pomocą komory CO2. Przymocuj ramiona każdej myszy do osobnego kartonu do wycinania za pomocą szpilek lub taśm klejących.
  2. Spryskaj mysz 70% etanolem, aby pozbyć się zarazków zewnętrznych i utrzymać wysterylizowany stan podczas zbioru serca. Wykonaj nacięcie nożyczkami na środku brzucha i odetnij skórę od brzucha do klatki piersiowej w linii prostej. Usuń skórę z obu stron środkowego cięcia, aby oczyścić obszar brzucha ze skóry i włosów. Za pomocą nożyczek i pęsety przetnij membranę poniżej klatki piersiowej.
  3. Otwórz klatkę piersiową myszy, przecinając klatkę piersiową wewnątrz kaptura. Odsłoń serce i usuń krew w pobliżu serca. Umyj okolice serca lodowatym PBS, aby pozbyć się krwi z okolic serca.
  4. Wypreparuj serce za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety. Umieść serce na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 10 ml lodowatego PBS.
  5. Wykonaj kołatanie serca za pomocą kleszczy z zakrzywionym trzpieniem i usuń resztki krwi z serca.
  6. Użyj całego serca do izolacji CSC.
  7. Przenieś wszystkie cztery lub pięć całych serc do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego HBSS. Trzymaj probówkę na lodzie do czasu dalszej obróbki.
  8. Wytrzyj wewnątrz i na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem, aby stworzyć wysterylizowane środowisko. Wysterylizuj probówkę zawierającą serce i inne wymagane materiały 70% etanolem. Umieść probówkę zawierającą serce w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu dalszego przetwarzania.
  9. Przenieś serca na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 10 ml lodowatego HBSS. Ponownie umyj serca, dotykając palpacyjnie, aby usunąć resztki krwi z serca. Zmieniaj roztwór HBSS po każdym myciu, aby zapewnić całkowite usunięcie krwi.
  10. Pokrój serca na małe kawałki za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych lub ostrza chirurgicznego na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 5 - 7 ml roztworu HBSS. Przytrzymaj każde serce za pomocą kleszczy i użyj cienkich nożyczek chirurgicznych lub ostrza chirurgicznego, aby pociąć serce na kawałki o średnicy od 2 do 4 mm. Często zmieniaj roztwór HBSS, aby zapewnić bezkrwistki HBSS. Zmiel serca w roztworze HBSS.
  11. Odwirować zmieloną tkankę w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i zachować osad.
  12. Zawiesić osad w 5 - 6 ml 0,2% roztworu kolagenazy II w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Objętość roztworu kolagenazy powinna być prawie 1,5 do 2 razy większa od objętości osadu.
    Uwaga: Do trawienia tkanek 0,2% kolagenazy I i 2,5 U/ml roztworu dypazy mogą zastąpić 0,2% kolagenazy II. Użyć prawie równej objętości roztworu dypazy do roztworu kolagenazy I.
  13. Dokładnie wymieszać osad z 0,2% roztworem kolagenazy II, mieszając probówkę lub kołysząc probówką na wytrząsarce o stężeniu 75 x g przez 45 - 60 minut w temperaturze 37 °C. Energicznie wstrząsać probówką ręcznie po każdych 20 - 30 minutach, aby wzmocnić lizę.
  14. Zderzyć mieszaninę zizowanych tkanek za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i końcówki pipety o pojemności 1 ml w celu dysocjacji grudki tkanki do zawiesiny jednokomórkowej.
    Uwaga: Aby uzyskać maksymalny odzysk CSC, należy rozcierać mieszaninę do lizy przez co najmniej 5 minut. Jeśli grudki tkanki są stosunkowo duże, odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml nożyczkami lub ostrzem chirurgicznym i użyj jej do rozcierania.
  15. Zatrzymaj enzymatyczną lizę tkanki, dodając dostępną w handlu pożywkę podtrzymującą CSC. Dodaj prawie 2 - 3 razy więcej pożywki podtrzymującej niż objętość tkanki poddanej lizie w kroku 2.14.
  16. Przepuść strawioną zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 100 μm, aby usunąć wszelkie niestrawione kawałki tkanki.
  17. Powtórz krok 2.16 za pomocą sitka do komórek o średnicy 40 μm.
  18. Oddziel komórki poprzez wirowanie w gradiacji gęstości. W celu rozdzielenia komórek delikatnie nałożyć równą objętość filtratu na roztwór polisacharozy i ditrizoinianu sodu. Na przykład, najpierw dodaj 20 ml roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu do 50-mililitrowej stożkowej probówki, a następnie dodaj 20 ml filtratu z kroku 2.17 na roztwór polisacharozy i diatrizoinianu sodu.
    UWAGA: Przed użyciem z komórkami podgrzej roztwór polisacharozy i ditrizoinianu sodu w temperaturze 37 °C. Dodać filtrat z kroku 2.17 do roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu bardzo ostrożnie i powoli, aby uniknąć mieszania się tych dwóch roztworów. Uważa się, że jest to kluczowy krok.
  19. Odwirować probówkę zawierającą oba roztwory o stężeniu 500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki z odchylanym wiadrem. Ustawić wirówkę na niższą prędkość przyspieszania i zwalniania, aby uniknąć mieszania się dwóch roztworów i zapewnić prawidłowe rozdzielenie CSC. Jest to ważny krok w izolacji CSC. Umieścić probówkę zawierającą mieszaninę gradientową bardzo powoli, bez zakłóceń, wewnątrz wirówki i ustawić ją do wirowania.
  20. Wyjmij kożuchową sierść wraz z dodatkowym roztworem z górnej warstwy za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub plastikowej pipety Pasteura w wysterylizowanej probówce o pojemności 15 ml. Ta warstwa buffy będzie zawierać CSCs.
    Uwaga: Podczas pipetowania kożucha należy zachować szczególną ostrożność, aby nie usunąć warstwy roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu, ponieważ jest on toksyczny dla CSC.
  21. Dodać równą objętość pożywki podtrzymującej CSC do zawiesiny komórek z kroku 2.20 i odpowiednio wymieszać, aby zneutralizować pozostały roztwór polisacharozy i ditrizoinianu sodu, jeśli jest obecny.
  22. Odwirować powyższą zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  23. Zawiesić osad w 7 - 10 ml niekompletnego podłoża DMEM i odwirować go przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby pozbyć się pozostałości roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu.
  24. Zebrać osad, który zawiera oczyszczone CSC.
  25. Ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki konserwacyjnej CSC, policzyć liczbę CSC i użyć osadu do hodowli. Aby policzyć liczbę CSC, użyj barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru. Z czterema samcami serc myszy, wydajność CSC wynosi ~ 1,8 miliona.
  26. Wysiewaj CSC na 6-dołkowej płytce hodowlanej pokrytej 0,02% roztworem żelatyny zawierającym 0,5% fibronektyny. Do siewu należy użyć 2 ml kompletnego podłoża do konserwacji. Inkubować płytkę hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  27. Pożywkę z CSC do hodowli należy wymieniać na kompletną pożywkę do konserwacji CSC codziennie do trzeciego dnia. Następnie zmieniaj podłoże co drugi dzień.
  28. Określ wzrost CSC, obserwując je pod mikroskopem.

3. Utrzymanie hodowli i pasaż komórek macierzystych serca

  1. Hodowla wyizolowanych CSC w dostępnym na rynku pożywce konserwacyjnej. Zastąp pożywkę hodowlaną świeżą pożywką pielęgnacyjną co drugi dzień. Gdy kultura CSC osiągnie zbieżność, przenieś CSC na nową płytkę pokrytą żelatyną i fibronektyną, jak wspomniano w kroku 2.26. Odłączyć wyhodowane CSC za pomocą enzymatycznego buforu dysocjacji komórek. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem dysocjacji komórek z płytki hodowlanej. Na tym etapie CSC są rozpatrywane na etapie przejścia 0 (P0).
  2. Wyhodować CSC P0 na nowej płytce pokrytej żelatyną i fibronektyną w kompletnym podłożu konserwacyjnym CSC w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 , pozwolić im na ich zlewanie się, a następnie postępować zgodnie z krokiem 3.1, aby uzyskać CSC pasażowe 1 (P1). Przechowywać CSC P1 w ciekłym azocie lub używać ich do eksperymentów.
  3. Zasiaj 0,5 miliona komórek na płytce 6-dołkowej lub 1 milion komórek w T-25, aby utrzymać hodowlę CSC na początkowym etapie.
  4. Przejdź przez CSC, gdy staną się zlewne w 85% - 90%. CSC mogą być hodowane w pożywce podtrzymującej do czterech do sześciu tygodni.
    Uwaga: Utrzymuj początkową gęstość wysiewu CSC na stosunkowo wysokim poziomie (40% - 50%), ponieważ przy niższej gęstości wysiewu CSC mogą zmienić swoją morfologię na płaską i wydłużoną.

4. Charakterystyka komórek macierzystych serca

  1. Aby scharakteryzować hodowane CSC, obserwuj je pod mikroskopem z kontrastem fagowym lub pod mikroskopem jasnego pola. Umieść płytkę zawierającą CSC na obiektywie mikroskopu fluorescencyjnego. Ustaw powiększenie dość nisko (10X), aby ustawić ostrość komórek. Użyj apertury kontrastu fazowego, aby obserwować komórki. Zwiększ powiększenie do 20X, zmieniając soczewkę obiektywu i sfotografuj CSC. Zwiększ obiektyw do 40X i zobrazuj CSC. W ciągu dwóch dni CSC wydają się prawie okrągłe, ale rozmiar komórki zwiększa się z czasem, a po siedmiu dniach CSC wydają się mieć kształt prawie cylindryczny (Rysunek 1A - 1C).
  2. Wykonaj barwienie immunologiczne CSC za pomocą markerów pluripotencji/pnia (OCT4, SOX2 lub Nanog), proliferacji (Ki-67) (Figura 2A - 2D) i komórek sercowych / progenitorowych (Sca-1, NKX2-5 lub GATA4) (Figura 3A - 3C).
    1. W celu barwienia immunologicznego CSC należy wysiać 10 000 CSC na 24-dołkowej płytce hodowlanej.
    2. Następnego dnia (po 18 - 24 godzinach) utrwalić CSC w 300 μl 4% paraformaldehydu na 10 minut.
    3. Umyj CSC 500 μl lodowatego PBS, 3x w odstępach 5-minutowych.
    4. Przepuszczalność CSC za pomocą 300 μl 0,2% Triton X-100 rozcieńczonego w PBS przez 10 minut.
    5. Umyj CSC 500 μl lodowatego PBS, 3x w odstępach 5-minutowych.
    6. Przeprowadzić blokowanie CSC za pomocą 300 μl 1% BSA rozcieńczonego w PBST (PBS + 0,1% Tween 20) lub 300 μl 10% normalnej surowicy kurczaka rozcieńczonej w PBST przez 1 godzinę.
    7. Inkubować CSC w 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe zgodnie z zaleceniami zawartymi w karcie danych przeciwciał lub zgodnie ze standaryzacją.
    8. Umyj CSC 500 μl lodowatego PBS, 3x w odstępach 5-minutowych.
    9. Inkubować CSC w 200 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym (patrz krok 4.2.6) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe zgodnie z zaleceniami w karcie katalogowej przeciwciał lub zgodnie ze standaryzacją.
    10. Umyj CSC 500 μl lodowatego PBS, 3x w odstępach 5-minutowych.
    11. Wybarwić CSC 200 μl DAPI (1 μg/ml) rozcieńczonym w PBS przez 5 min.
    12. Umyj CSC 1x 500 μl lodowatego PBS. Następnie dodaj 300 μl lodowatego PBS do każdej studzienki.
    13. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Postępuj zgodnie z instrukcjami obrazowania fluorescencyjnego, na przykład aby uniknąć bezpośredniego światła padającego na płytkę. Trzymaj płytkę hodowlaną pod mikroskopem. Ustaw ostrość komórki pod różnymi powiększeniami. Obserwuj komórki pod wpływem kontrastu fazowego i/lub różnych filtrów wzbudzenia i zapisz obrazy.
    14. Przechowywać płytkę w ciemności w temperaturze 4 °C.

5. Różnicowanie komórek macierzystych serca w kardiomiocyty

  1. W celu rozróżnienia CSC należy wysiać 500 000 CSC na 6-dołkowej płytce z 2 ml wstępnie ogrzanej (37 °C) dostępnej w handlu pożywki do konserwacji CSC.
  2. Inkubować płytkę zawierającą CSC w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Pozwolić CSC na przyczepienie się i rozmnożenie aż do wzrostu subkonfluentnego. Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty, zastąp pożywkę hodowlaną świeżą pożywką konserwacyjną.
  3. Przy zbiegu 85% - 90% zastąp pożywkę podtrzymującą 2 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki różnicującej kardiomiocyty. Inkubować płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez okres do 2-3 tygodni.
  4. Zmieniaj pożywkę różnicującą co 2 - 3 dni. Obserwuj morfologię CSC pod mikroskopem za każdym razem podczas zmiany pożywki, aby zapewnić dobre warunki hodowli.
  5. Po 12 dniach hodowli CSC w pożywce różnicowej, zobrazować CSC pod kątem markerów różnicowania zgodnie ze standardowym protokołem barwienia immunologicznego (patrz kroki 4.2.1 - 4.2.14). Zapisz obrazy fluorescencyjne do ekspresji markerów kardiomiocytów (Rysunek 4A - 4B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym badaniu wyizolowaliśmy CSC od 10- do 12-tygodniowych samców myszy C57BL/6J. W tym miejscu przedstawiliśmy prostą metodę izolacji i charakterystyki CSC przy użyciu markerów pluripotencji. Przedstawiliśmy również elegancką metodę różnicowania CSC i charakterystykę CSC, które różnicowały się w kierunku linii kardiomiocytów. Zaobserwowaliśmy morfologię kształtu wrzeciona u CSC hodowanych w ciągu 2 do 3 dni pod mikroskopem z kontrastem fazowym (Rysunek 1A i

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki tego protokołu izolacji CSC są następujące. 1) W celu ekstrakcji serc od myszy należy utrzymać stan sterylizacji. Jakiekolwiek zanieczyszczenie podczas ekstrakcji serca może mieć negatywny wpływ na jakość CSC. 2) Krew musi zostać całkowicie usunięta przed rozdrobnieniem serca, co odbywa się poprzez kilka płukań całego serca i kawałków serca roztworem HBSS. 3) Kawałki serca muszą być całkowicie zlizowane do jednokomórkowej zawiesiny z roztworem kolagenazy. 4) Gradientowy roztwór polisacharozy i ditrizoinia...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health HL-113281 i HL116205 dla Paras Kumar Mishra.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MyszyLaboratorium Jacksona, USANumer magazynowy 000664
Przeciwciała:
OCT4-Abcamab18976 (poliklonalny królik)OCT4-Przeciwciało pierwotne – rozcieńczenie 1:100, przeciwciało wtórne – rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
SOX2Abcamab97959 (poliklonalny królik)SOX2-Przeciwciało pierwotne - rozcieńczenie 1:100, Przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
NanogAbcamab80892 (poliklonalny królik)Nanog - Przeciwciało pierwotne - rozcieńczenie 1:100, Przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
Ki67Abcamab16667 (poliklonalny królik)Ki67 - Przeciwciało pierwotne - rozcieńczenie 1:100, Przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
Sca IMilliporeAB4336 (poliklonalny królik)Sca I Przeciwciało pierwszorzędowe - rozcieńczenie 1:100, przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (koza poliklonalna)NKX2-5-Przeciwciało pierwotne - rozcieńczenie 1:50, Przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
GATA4Abcamab84593 (poliklonalny królik)GATA4-Przeciwciało pierwotne - rozcieńczenie 1:100, Przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
MEF2CSanta Cruzsc-13268 (koza poliklonalna)MEF2C-Przeciwciało pierwszorzędowe - rozcieńczenie 1:50, Przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
Troponina IMiliporeMAB1691 (mysi monoklonalny)Troponina I-Przeciwciało pierwotne - rozcieńczenie 1:100, Przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze
blokującymAktyninaMiliporeMAB1682 (mysi monoklonalny)Przeciwciało pierwszorzędowe aktyniny - rozcieńczenie 1:100, przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
ANPMilliporeAB5490 (mysz poliklonalna)ANP-Przeciwciało pierwszorzędowe - rozcieńczenie 1:100, przeciwciało wtórne - rozcieńczenie 1:200, w roztworze blokującym
Alex Fluor-488 sprawdź anty-królikTechnologia życiaNr ref. A21441
Alex Fluor-594 koza anty-królikTechnologia życiaNr ref. A11012
Alex Fluor-594 królik anty-koziołTechnologia życiaNr ref. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouseTechnologia życiaNr ref. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-koziołTechnologia życiaNr ref. A21468
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Pożywka hodowlana:
Pożywka podtrzymująca CSCMilliporeSCM101Uwaga: W przypadku hodowli CSC do przemywania komórek kardiomiocytów użyto pożywki różnicującej kardiomiocytów PBS lub niekompletnej pożywki DMEM
MilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cell Isolation buffer:
polisacharoza i roztwór diatrizoinianu sodu (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
Kolagenaza ISigmaC0130
Roztwór do dyspasySTEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro AccutaseThermoscientificA1110501
Inne odczynniki:
BSASigmaA7030
Normalna surowica kontrolnaLaboratorium wektoroweS3000
Roztwór DAPIApplichemA100,0010Dapi, stężenie robocze-1 i mikro; g / ml
Błękit trypanowyBiorad145-0013
TrypsynaSigmaT4049
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórekThermo Fisher ScientificA1110501
FormaldehydSigma158127
Triton X-100ACROSNr CAS 900-293-1
Tween 20Fisher SceintificNumer partii 160170
EthanolThermo Scientific
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Materiały do hodowli tkankowych:
100 mm szalka PetriegoThermo Scientific
Płytka 6-dołkowaThermo Scientific Termo Scientific
Scientific
Termos T-25Termos Scientific
Termos T-75Termo Scientific
Rurka stożkowa 15 mlThermo Scientific
stożkowa 50 mlThermo Scientific
40 i mikro; m Barwnikkomórkowy Fisher Scientific22363547
100 µ m Barwnikkomórkowy Fisher Scientific22363549
0,22 &mikro; m filtrFisher Scientific09-719C
10 mL strzykawkaBDNr ref. 309604
10 µ L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; Końcówki do pipet LFisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL jednorazowe pipety plastikoweThermo Scientific
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Instrumenty
WirówkaThermo ScientificLEGEND X1R Mikroskop
EVOSTechnologia
Automatyczny licznik komórekBiorad
Szkiełko do liczenia komórekBiorad145-0011
UrządzenieThermo ScientificS1
Nazwa>< strong>Firma<strong>Numer katalogowyKomentarze
Instrumenty chirurgiczne:
Nożyczki chirurgiczneFine Scientific Tool
Drobne nożyczki chirurgiczneFine Scientific Tool
Kleszcze do trzpienia krzywegoFine Scientific Tool
Ostrze chirurgiczneFine Scientific Tool
Termo Rurkażycia do napełniania pipet

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146(2017).
  2. Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
  3. Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
  4. Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
  6. Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
  7. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
  8. Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
  9. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
  10. Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
  11. Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
  12. Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
  13. Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162(2015).
  14. Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
  15. Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
  16. Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
  17. Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
  18. Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
  19. Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
  20. Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
  21. Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
  22. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  23. Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265(2011).
  24. Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17(2017).
  25. Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
  26. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
  27. Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
  28. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
  29. Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
  30. Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
  31. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
  32. Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
  33. Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
  34. Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
  35. Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75(2014).
  36. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac Stem CellsCSC IsolationDensity GradientTissue DigestionCollagenase IICell CharacterizationMarker ExpressionDifferentiation ProtocolCardiomyocyte DifferentiationCell Proliferation

Related Articles