Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Czynniki wydzielane, receptory na uwięzi błonowej i ich partnerzy oddziałujący są głównymi regulatorami komunikacji komórkowej i inicjacji kaskad sygnałowych podczas homeostazy i choroby, i jako takie stanowią główne cele terapeutyczne. Pomimo ich istotności, te sieci interakcji są nadal znacznie niedostatecznie reprezentowane w obecnych bazach danych; Dlatego większość białek zewnątrzkomórkowych nie ma udokumentowanego partnera wiążącego. Rozbieżność ta wynika przede wszystkim z wyzwań związanych z badaniem białek zewnątrzkomórkowych, w tym ekspresji białek funkcjonalnych oraz słabych, niskich powinowacyzmów białkowych często tworzonych między receptorami na powierzchni komórki. Celem tej metody jest opisanie drukowania biblioteki białek zewnątrzkomórkowych w formacie mikromacierzy do badań przesiewowych interakcji białko-białko. Aby umożliwić wykrycie słabych oddziaływań, opisano metodę opartą na multimeryzacji badanego białka pytającego. W połączeniu z tym podejściem do multimeryzacji opartym na mikrokulkach w celu zwiększenia wielowartościowości, mikromacierz białkowa umożliwia niezawodne wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko przy wysokiej przepustowości. Metoda ta oferuje szybkie i nisko zużywające próbkę podejście do identyfikacji nowych interakcji mających zastosowanie do dowolnego białka zewnątrzkomórkowego. Opisano protokół drukowania i badań przesiewowych mikromacierzy białkowych. Technologia ta będzie przydatna dla badaczy poszukujących solidnej metody odkrywania interakcji białkowych w przestrzeni zewnątrzkomórkowej.
Wprowadzenie
Omawiana tutaj metoda opisuje drukowanie zbioru białek zewnątrzkomórkowych w formacie mikrotablicy, a następnie metodę przesiewową celu zainteresowania w stosunku do tej biblioteki. Zidentyfikowaliśmy multimeryzację białek jako kluczowy krok w wykrywaniu interakcji charakteryzujących się niskim powinowactwem do wiązania. Aby usprawnić wykrywanie tych interakcji, opisujemy protokół oparty na multimeryzacji interesującego nas białka zapytania za pomocą mikrogranulek.
Wydzielane i wyrażane na powierzchni komórki białka (zbiorczo określane jako białka zewnątrzkomórkowe) wraz z ich współdziałającymi partnerami są kluczowymi regulatorami komunikacji komórkowej, sygnalizacji i interakcji z mikrośrodowiskiem. Są zatem niezbędne w regulacji wielu procesów fizjologicznych i patologicznych. Około jedna czwarta ludzkiego genomu (≈5 000 białek) koduje białka zewnątrzkomórkowe, które, biorąc pod uwagę ich znaczenie i dostępność dla systematycznie dostarczanych leków, stanowią kluczowe cele dla rozwoju leków1. W związku z tym białka zewnątrzkomórkowe stanowią ponad 70% docelowych białek o znanym działaniu farmakologicznym dla leków dopuszczonych do obrotu, znanych jako "proteom lekowy". Pomimo ich znaczenia i obfitości, sieci zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko (ePPI) pozostają niezwykle niedostatecznie reprezentowane w dostępnych bazach danych. Wynika to zasadniczo ze złożonej biochemicznej natury białek zewnątrzkomórkowych, która uniemożliwia ich scharakteryzowanie przy użyciu większości dostępnych technologii2. Po pierwsze, białka błonowe są trudne do rozpuszczania, co często wiąże się z trudnymi warunkami prania i detergentami; Po drugie, białka zewnątrzkomórkowe często nie mają odpowiednich modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, które są nieobecne, gdy białka te ulegają ekspresji w powszechnie stosowanych układach heterologicznych. Wreszcie, interakcje między receptorami, takie jak koreceptory ulegające ekspresji na komórkach odpornościowych, są często przejściowe i charakteryzują się bardzo niskim powinowactwem (KD w zakresie od ~1 μM do >100 μM). Ogólnie rzecz biorąc, charakter tych białek i ich partnerów wiążących sprawia, że większość powszechnie stosowanych technologii, takich jak oczyszczanie powinowactwa/spektrometria mas (AP/MS) lub drożdże dwuhybrydowe, nie nadaje się do wykrywania interakcji w przestrzeni zewnątrzkomórkowej2,3.
Aby przezwyciężyć te techniczne wyzwania i przyspieszyć odkrywanie nowych interakcji dla białek zewnątrzkomórkowych, opracowaliśmy mikromacierz białek zewnątrzkomórkowych o wysokim zasięgu4,5. Mikromacierze mają tę zaletę, że generują powierzchnie o dużej gęstości z niewielkimi ilościami próbki i są generalnie podatne na badania o wysokiej przepustowości. Badania oparte na mikromacierzach białkowych dostarczyły wcześniej istotnych informacji na temat interakcji białkowych dla kilku organizmów modelowych, choć głównie koncentrują się na interakcjach cytozolowych lub na określonych rodzinach białek6,7,8. W przeciwieństwie do tego, wykonano ograniczone prace w celu zbadania interakcji białek zewnątrzkomórkowych przy użyciu tej technologii. Opracowaliśmy metodę mikromacierzy białkowych, aby umożliwić badania ePPI, budując obszerną i wysoce zróżnicowaną bibliotekę oczyszczonych wydzielanych białek i pojedynczych receptorów transbłonowych (STM) wyrażonych jako rekombinowane domeny zewnątrzkomórkowe (ECD) połączone ze wspólnymi znacznikami w celu oczyszczania powinowactwa4. Sukces badań przesiewowych mikromacierzy białkowych zależy w dużej mierze od stworzenia wysokiej jakości biblioteki białek. Do ekspresji zarówno białka bibliotecznego, jak i białkowego zapytania, komórki ssaków lub komórek owadów zostały preferencyjnie wybrane jako heterologiczne systemy ekspresji, aby zapewnić prawidłowe dodanie modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja lub wiązania dwusiarczkowe. SDS-PAGE, chromatografia wykluczania wielkości i wielokątowe rozpraszanie światła laserowego są technikami powszechnie stosowanymi do oceny jakości białek rekombinowanych. Biblioteka białek jest następnie nanoszona na szkiełka epoksydosilowe i przechowywana w temperaturze -20 °C do długotrwałego użytkowania. Stężenia białka powyżej 0,4 mg/ml są zalecane dla protokołu opisanego poniżej. W związku z tym białka o niskiej ekspresji mogą wymagać etapu koncentracji przed drukowaniem i przechowywaniem próbki. Niemniej jednak główną zaletą tej techniki jest niewielka wymagana ilość białka (50 μg białka wystarcza do wykonania >2000 badań przesiewowych), przy minimalnym zużyciu białka zapytania (20-25 μg na badanie przesiewowe). Korzystając z opisanego tutaj protokołu i sprzętu oraz pod warunkiem, że dostępne są biblioteki, wyniki dla poszczególnych białek zapytania mogą być generowane w ciągu jednego dnia roboczego.
Głównym wyzwaniem w wykrywaniu interakcji białek w środowisku zewnątrzkomórkowym jest ich charakterystycznie słaby lub przejściowy charakter, który uniemożliwia identyfikację za pomocą najczęściej stosowanych metodologii. Zwiększenie awidności wiązania znacznie poprawia czułość wykrywania słabych oddziaływań białkowych9,10,11. Opierając się na tej zasadzie, opracowaliśmy metodę multimeryzacji białek zapytania (wyrażonej jako fuzja Fc) za pomocą kulek powlekanych białkiem A4,5. Aby uniknąć potencjalnej inaktywacji białka pytającego przez losowe znakowanie, zamiast tego oznaczamy nieistotną ludzką immunoglobulinę G za pomocą Cy5 i dodajemy ją wraz z białkiem pytającym do kulek białka A, eliminując w ten sposób wszelkie artefakty spowodowane bezpośrednim sprzężeniem barwnika z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Biorąc pod uwagę powinowactwo mikromolowe kilku par koreceptorów, wielowartościowe kompleksy znacznie zwiększają stosunek sygnału do szumu w porównaniu z białkami zapytania o fuzję Fc przesiewanymi jako białka rozpuszczalne4.
Podsumowując, celem tego protokołu jest opisanie przygotowania preparatów mikromacierzy zawierających istniejącą wcześniej bibliotekę białek zewnątrzkomórkowych do identyfikacji interakcji receptor-ligand. Dokonujemy przeglądu kroków drukowania slajdów, a następnie protokołu badania przesiewowego białka będącego przedmiotem zainteresowania w stosunku do biblioteki białek zewnątrzkomórkowych. Ponadto opisano metodę wzmocnionego wykrywania ePPI w oparciu o mikrogranulki w celu uzyskania zwiększonej awidności badanego białka. Opisana tutaj technologia mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych stanowi szybkie, solidne i skuteczne podejście do badań przesiewowych i wykrywania nowych ePPI o niskim współczynniku wyników fałszywie dodatnich oraz przy wykorzystaniu wyłącznie mikrogramowych ilości badanego białka zapytania. Technologia ta przyczyniła się do wielu badań, które dostarczyły istotnych informacji na temat nieznanych wcześniej funkcji komórkowych i szlaków sygnałowych dla różnych receptorów12,13, w tym immunoregulatorów wirusa14, i może być wykorzystana do de-sierotylizacji dowolnego interesującego białka zewnątrzkomórkowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generowanie biblioteki zewnątrzkomórkowych białek ludzkich
- Sporządź listę receptorów powierzchniowych komórek lub wydzielanych białek, które Cię interesują, aby zbudować bibliotekę mikromacierzy białek. Do badania można wybrać określone rodziny białek (na przykład nadrodzinę immunoglobulin) lub białka selektywnie wyrażane w określonych typach komórek.
- W przypadku receptorów na powierzchni komórki należy określić granice domeny zewnątrzkomórkowej (ECD), identyfikując peptyd sygnałowy i regiony transbłonowe za pomocą narzędzi programowych. Niektóre z odpowiednich narzędzi, dostępnych bezpłatnie online, znajdują się w Tabeli materiałów15,16,17,18.
- Zsyntetyzuj ECD dla genów będących przedmiotem zainteresowania i sklonuj do odpowiedniego wektora. Wydzielane białka lub ECD receptorów STM połączonych z wieloma powszechnymi znacznikami powinowactwa mogą być oczyszczone z kondycjonowanych pożywek komórek transfekowanych odpowiednim wektorem lub z systemów ekspresji komórek bakulowirusa-owada.
Uwaga: Systemy oparte na komórkach ssaków (takie jak komórki HEK/293 lub CHO) są zalecane w celu maksymalizacji prawdopodobieństwa prawidłowego fałdowania białek i dodania odpowiednich modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja. - Oczyść białka za pomocą standardowych metod oczyszczania powinowactwa. Wcześniejsze próby opisywały zautomatyzowane lub półautomatyczne procedury odpowiednie do oczyszczania setek białek, które można skalować w celu wygenerowania zestawu interesujących białek9,19,20,21.
Uwaga: SDS-PAGE, chromatografia wykluczania wielkości (S) lub wielokątowe rozpraszanie światła laserowego (MALLS) są zalecane w celu oceny każdej agregacji niekowalencyjnej i kontroli ogólnej jakości preparatów białkowych. - Jeśli to możliwe, dostosuj białka do 200 lub 400 μg/ml i rozcieńcz zapasy 80% glicerolem do długotrwałego przechowywania w fiolkach kriogenicznych w temperaturze -20 °C. Reprezentują one zapasy główne i powinny być dostępne tylko wtedy, gdy jest to konieczne.
- Przenieść porcje każdego białka (100 μl) na płytki 96-dołkowe (płytki podstawowe), zamknąć folią klejącą i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania szkiełek do mikromatrycy. Talerze wyjściowe są generowane w celu zminimalizowania cykli zamrażania i rozmrażania oraz zapewnienia stabilności białka.
2. Drukowanie mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych
- Do drukowania slajdów należy używać standardowego mikromacierzu. Przyrząd wykorzystany w opisanym tutaj protokole ma wydajność 57 slajdów / przebieg i wykorzystuje głowicę drukującą mieszczącą 48 kołków punktowych. Kołki te generują plamki o średnicy ~100 μm oddzielone odległością między punktami ~350 μm i pobierają 0,25 μl na ładunek. W tej konfiguracji można pomieścić do 8 000 miejsc na prowadnicę.
- Wygeneruj płytki robocze (płytki 384-dołkowe, 10 μl próbki/studzienkę) z płytek wyjściowych. Wykonaj ten krok ręcznie przed drukowaniem slajdów za pomocą mikromacierzy. Następnie natrzyj białka za pomocą szpilek do plam typu pióro na szkiełkach epoksysydowych przy wilgotności 60% (aby zapobiec odwodnieniu plamek białkowych).
Uwaga: Albuminę surowicy bydlęcej znakowaną Cy3 (BSA) można dostrzec w duplikatach między każdą próbką białka (5 μg/ml w PBS/40% glicerolu) w celu wizualizacji układu do dopasowania maski (patrz punkt 4). Chociaż jest to zalecane, ten krok jest opcjonalny. - Po wydrukowaniu wyjmij szkiełka białkowe z mikromacierzy z wilgotnego środowiska i zablokuj je na noc 5% mlekiem w PBST, aby dezaktywować powierzchnię.
Uwaga: Preferowanym podejściem jest użycie zamgławiacza ultradźwiękowego w celu wytworzenia drobnej mgiełki roztworu blokującego, która osadza się na powierzchni szkiełka. - Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C w 50% glicerolu, aby zapobiec zamarzaniu.
3. Przygotowanie kompleksów przynęt wielowartościowych
Uwaga: Interakcje między białkami zewnątrzkomórkowymi często charakteryzują się niskim powinowactwem. Aby umożliwić wykrywanie tych interakcji poprzez zwiększenie awidności wiązania, opracowano podejście wielowartościowe oparte na wychwytywaniu białka zapytania, wyrażonego jako ECD znakowane Fc, na mikrogranulkach pokrytych białkiem A4.
- Oznaczyć nośnik IgG używany do wykrywania barwnikiem monoreaktywnym Cy5 i oddzielić wolny barwnik za pomocą kolumn odsalających. Określić stosunek barwnika do białka, mierząc absorbancję ultrafioletu przy 280 i 650 nm.
Uwaga: Zwykle stosuje się proporcje białka do barwnika od 2,0 do 4,0. Zaleca się wirowanie koniugatów Cy5 przy 100 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia potencjalnych rozpuszczalnych agregatów w wyniku procesu znakowania. - Określ optymalny stosunek mikrogranulek do białka poprzez miareczkowanie białka A w stosunku do stałej ilości białka pytającego. Do badań przesiewowych wykorzystuje się minimalną objętość nasycenia kulek, w których nie pozostaje wolne białko znakowane Fc, mierzoną za pomocą testu konkurencyjnego określonego za pomocą interferometrii biowarstw.
- Utworzyć kompleksy mikrokule-białko przez inkubację zapytania znakowanego Fc i Cy5-IgG z mikrogranulkami białka A i mieszać na rotatorze probówkowym w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.
- Aby utworzyć te kompleksy, należy użyć białka zapytania o końcowym stężeniu 20 μg/ml. Aby obliczyć stosunek molowy białka pytającego i Cy5-IgG, podziel masę cząsteczkową białka pytającego przez masę cząsteczkową IgG (150 000 Da) i pomnóż przez 40 μg/ml, aby określić potrzebne stężenie Cy5-IgG.
- Uzupełnić próbki rozpuszczalnym białkiem A (1 mg/ml) bezpośrednio przed inkubacją za pomocą szkiełek do mikromacierzy (patrz sekcja 4.2 poniżej), aby zapobiec wiązaniu się jakichkolwiek wolnych kulek białka A z białkami fuzyjnymi Fc, które mogą być obecne na matrycy.
Uwaga: Końcowa objętość reakcji może się różnić w zależności od użytej stacji hybrydyzacji lub komory inkubacyjnej. Oprzyrządowanie opisane w Tabeli Materiałów pozwala na inkubację próbki przy użyciu stosunkowo małych objętości (~200 μL na szkiełko).
4. Badania przesiewowe i przetwarzanie mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych.
Uwaga: Jest wielu producentów, którzy oferują platformy automatycznego przetwarzania. Jeśli stacja hybrydyzacji nie jest dostępna, następujące kroki można wykonać ręcznie, upewniając się, że objętość bufora jest wystarczająca, aby szkiełka były przez cały czas zanurzone.
- Ogrzej szkiełka w temperaturze pokojowej i spłucz PBS/0,1% Tween 20 (PBST) w celu usunięcia pozostałości glicerolu przed załadowaniem do stacji hybrydyzacji.
- Należy zastosować następujący protokół kontroli przesiewowej:
- Myć PBST przez 1 min.
- Załaduj 200 μl 1 mg/ml białka A do PBS/5% mleka i inkubuj przez 30 minut, aby zapobiec wiązaniu się nieskompleksowanych mikrogranulek białka A z białkami znakowanymi Fc, które mogą być obecne w mikromacierzy.
- Umyć pięć razy PBST przez 1 min.
- Załadować 200 μl kompleksu zapytanie: mikrogranulki w obecności 1 mg/ml białka A i inkubować przez 30 minut.
- Myć PBST przez 1 min.
- Po hybrydyzacji przepłukać szkiełka wodą, umieścić w pojedynczych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i wysuszyć, wirując w temperaturze 900 x g przez 5 minut.
- Na koniec zeskanuj szkiełka za pomocą skanera mikromatrycowego odpowiedniego do wykrycia fluorescencji Cy3 (jeśli wydrukowano BSA-Cy3) i Cy5 poprzez wzbudzenie odpowiednio przy 532 i 635 nm.
- Przeprowadź analizę danych, korzystając z dołączonej analizy danych z mikromacierzy. Odpowiednia lista tablic (w postaci pliku .gal) jest ładowana do oprogramowania do ekstrakcji danych. Na tym etapie wykorzystaj miejsca Cy3-BSA, aby znaleźć bloki i skorzystać z opcji automatycznego dopasowania w oprogramowaniu, a następnie w razie potrzeby ręcznie wyrównaj funkcje. Zapisz pliki jako pliki .gpr do dalszej analizy.
5. Analiza danych
- Zapisz dane jako pliki GPR i przetwarzaj je w R za pomocą pakietu limma, powszechnie używanego do analizy danych z mikromacierzy4,5.
- W celu wstępnego przetwarzania wykonaj korekcję tła i normalizację wewnątrz slajdu. Ponieważ każde białko jest drukowane w zduplikowanych miejscach, połącz oba powtórzone pomiary, aby utworzyć jeden wynik dla tego białka w bibliotece.
- Oblicz wyniki dla każdego slajdu i przeanalizuj wyniki dla przecięcia się wysoko ocenionych kandydatów między slajdami.
- Użyj zduplikowanych mikromacierzy z oddzielnych nakładów, aby kontrolować zmienność slajdów i użyj wykresów przecięć reprezentujących dane z obu ekranów, aby wywołać końcowe trafienia.
- Na koniec wykonaj dodatkowy poziom filtrowania, aby wykluczyć rozwiązłe białka w macierzy. Takie niespecyficzne spoiwa są identyfikowane jako białka przekraczające określoną progową częstotliwość trafień zdefiniowaną przez użytkownika na niezależnych ekranach.
Uwaga: Ten protokół jest szczegółowo opisany w Tom et al. 20135. W naszym przypadku niespecyficzne wywołanie bindera opiera się na określeniu skumulowanego współczynnika trafień zdobyczy i stosuje się próg eliminacji oparty na danych wynoszący 5%.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schemat przepływu pracy dla technologii mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych przedstawiono na Rysunku 1. Po przygotowaniu szkiełek z mikromacierzami zawierającymi bibliotekę białek zewnątrzkomórkowych, przesiewanie białka docelowego oraz analiza danych mogą zostać ukończone w ciągu jednego dnia. Wiele fizjologicznie istotnych oddziaływań między receptorami osadzonymi w błonie charakteryzuje się bardzo słabym powinowactwem (KD w zakresie mikromo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Znaczna liczba receptorów sierocych pozostaje w ludzkim genomie, a nowi partnerzy oddziałujący nadal pojawiają się dla białek zewnątrzkomórkowych z wcześniej scharakteryzowanymi ligandami. Zdefiniowanie interakcji receptor-ligand w organizmach ludzkich i modelowych jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów, które dyktują komunikację komórkową podczas homeostazy, a także dysregulacji prowadzącej do choroby, a tym samym do informowania o nowych lub ulepszonych opcjach terapeutycznych. Niemniej jednak wykrywanie zewnątrzkom...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
B.H., S.R-R i N.M-M. są pracownikami Genentech i posiadają udziały w grupie Genentech Inc./Roche.
Podziękowania
Dziękujemy Philamerowi Calsesowi i Kobe Yuenowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni Randy'emu Yenowi za doskonałe doradztwo techniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ultra Pure MB Grade glicerol | USB Corporation | 56-81-5 | Bufor |
| blokujący SeptoMark do przechowywania białek | Zeptosens | BB1, 90-40 | Szkiełka mikromacierzy buforowej blokującej |
| Albumina surowicy bydlęcej | Roche | 03-117-957-001 | Suwak do zakładania maski (opcjonalnie) |
| Polipropylenowe płytki wielodołkowe | Greiner Bio One | 82050-678 | Magazynowanie białka |
| Polipropylenowe płytki wielodołkowe | Arrayit | MMP384 | Drukowanie slajdów |
| NanoPrint LM60, lub podobny kontakt mikromacierz | Arrayit | NanoPrint LM60 lub podobny mikromacierz kontaktowa | Druk slajdów |
| Mikroszpilki | Arrayit | Micro szpilki do punktowania | Drukowanie slajdów |
| Stacja blokująca ZeptoFOG | Zeptosens | Stacja blokująca ZeptoFOG, 1210 | Prowadnice blokowe po wydrukowaniu |
| Odtłuszczone mleko w proszku | Thermo Fisher | LP0031 | Roztwór |
| blokującySzkiełko szklane pokryte żywicą epoksysydową | Nextrion Slide E | 1064016 | Szkiełka Microarray |
| Zestaw uchwytów na szkło i stojaków na szkiełka | Wheaton | 900303 | Przechowywanie szkiełek |
| Barwnik monoreaktywny Cy5 | GE Healthcare | PA23031 | Etykietowanie albuminy |
| Barwnik monoreaktywny Cy5 | GE Healthcare | PA25001 | Znakowanie ludzkiej IgG Kolumna |
| odsalająca Pro-spin | Princeton Separacje | CS-800 | Usuń wolny barwnik |
| Samoprzylepna uszczelka z folii aluminiowej | AlumaSeal | F-384-100 | Uszczelka talerzy |
| magazynowych Fiolki kriogeniczne z polipropylenu | Fiolki Corning | 430658 | Master do przechowywania biblioteki białek |
| Mikrogranulki białka A | Miltenyi | 120-000-396 | Zapytanie o multimeryzację białka |
| Ludzka IgG | Jackson Immunoresearch | & nbsp; 009-000-003 | Nieistotne IgG do znakowania |
| białka A | Sigma | P7837 | Blokowanie szkiełek mikromacierzy |
| Stacja hybrydyzacyjna, a-Hyb lub podobna | Miltenyi | Stacja hybrydyzacyjna, a-Hyb lub podobna | Automatyczne przetwarzanie mikromacierzy (opcjonalnie) |
| Skaner GenePix 4000B lub podobne | urządzenia molekularne Skaner | GenePix 4000B lub podobny | Skanowanie slajdów |
| GenePix Pro lub równoważne oprogramowanie do ekstrakcji danych | Urządzenia | molekularneGenePix Pro lub równoważne oprogramowanie do ekstrakcji danych | Przetwarzanie danych |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatyka, | oprogramowanie online | Technicznego Narzędzie predykcyjne do określania obecności i lokalizacji miejsc rozszczepienia peptydów sygnałowych |
| Serwer TMHMM 2.0 | DTU Bioinformatyka, oprogramowanie online Duńskiego Uniwersytetu Technicznego | Przewidywanie helis transbłonowych w białkach | |
| Phobius | Oprogramowanie online Centrum Bioinformatyki w Sztokholmie | Połączone topologia transbłonowa i predyktor peptydów sygnałowych | |
| TOPCONS | Oprogramowanie online | Uniwersytetu Sztokholmskiego | Przewidywanie topologii błony i peptydów sygnałowych |
Bibliografia
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473(2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9(2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
