Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Bushra Husain; Sairupa Paduchuri; Sree R. Ramani; Nadia Martinez-Martin

doi:10.3791/58451

Method Article

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

DOI:

10.3791/58451

⸱

January 7th, 2019

Bushra Husain¹ , Sairupa Paduchuri¹ , Sree R. Ramani² , Nadia Martinez-Martin¹

¹Receptor Discovery group, Microchemistry, Proteomics and Lipidomics Department, Genentech, ²Portfolio Management and Operations, Genentech

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynniki wydzielane, receptory na uwięzi błonowej i ich partnerzy oddziałujący są głównymi regulatorami komunikacji komórkowej i inicjacji kaskad sygnałowych podczas homeostazy i choroby, i jako takie stanowią główne cele terapeutyczne. Pomimo ich istotności, te sieci interakcji są nadal znacznie niedostatecznie reprezentowane w obecnych bazach danych; Dlatego większość białek zewnątrzkomórkowych nie ma udokumentowanego partnera wiążącego. Rozbieżność ta wynika przede wszystkim z wyzwań związanych z badaniem białek zewnątrzkomórkowych, w tym ekspresji białek funkcjonalnych oraz słabych, niskich powinowacyzmów białkowych często tworzonych między receptorami na powierzchni komórki. Celem tej metody jest opisanie drukowania biblioteki białek zewnątrzkomórkowych w formacie mikromacierzy do badań przesiewowych interakcji białko-białko. Aby umożliwić wykrycie słabych oddziaływań, opisano metodę opartą na multimeryzacji badanego białka pytającego. W połączeniu z tym podejściem do multimeryzacji opartym na mikrokulkach w celu zwiększenia wielowartościowości, mikromacierz białkowa umożliwia niezawodne wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko przy wysokiej przepustowości. Metoda ta oferuje szybkie i nisko zużywające próbkę podejście do identyfikacji nowych interakcji mających zastosowanie do dowolnego białka zewnątrzkomórkowego. Opisano protokół drukowania i badań przesiewowych mikromacierzy białkowych. Technologia ta będzie przydatna dla badaczy poszukujących solidnej metody odkrywania interakcji białkowych w przestrzeni zewnątrzkomórkowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omawiana tutaj metoda opisuje drukowanie zbioru białek zewnątrzkomórkowych w formacie mikrotablicy, a następnie metodę przesiewową celu zainteresowania w stosunku do tej biblioteki. Zidentyfikowaliśmy multimeryzację białek jako kluczowy krok w wykrywaniu interakcji charakteryzujących się niskim powinowactwem do wiązania. Aby usprawnić wykrywanie tych interakcji, opisujemy protokół oparty na multimeryzacji interesującego nas białka zapytania za pomocą mikrogranulek.

Wydzielane i wyrażane na powierzchni komórki białka (zbiorczo określane jako białka zewnątrzkomórkowe) wraz z ich współdziałającymi partnerami są kluczowymi regulatorami komunika....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie biblioteki zewnątrzkomórkowych białek ludzkich

Sporządź listę receptorów powierzchniowych komórek lub wydzielanych białek, które Cię interesują, aby zbudować bibliotekę mikromacierzy białek. Do badania można wybrać określone rodziny białek (na przykład nadrodzinę immunoglobulin) lub białka selektywnie wyrażane w określonych typach komórek.
W przypadku receptorów na powierzchni komórki należy określić granice domeny zewnątrzkomórkowej (ECD), identyfikując peptyd sygnałowy i regiony transbłonowe za pomocą narzędzi programowych. Niektóre z odpowiednich narzędzi, dostępnych bezpłatnie online, znajdują się w Tabeli materiałów

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat przepływu pracy dla technologii mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych jest pokazany w Rysunek 1. Gdy szkiełka mikromacierzy zawierające bibliotekę białek zewnątrzkomórkowych są dostępne, badanie przesiewowe białka będącego przedmiotem zainteresowania i analiza danych mogą zostać zakończone w ciągu jednego dnia. Wiele fizjologicznie istotnych interakcji między receptorami osadzonymi w błonie charakteryzuje się bardzo słabą siłą wiązania (K_{, D}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczna liczba receptorów sierocych pozostaje w ludzkim genomie, a nowi partnerzy oddziałujący nadal pojawiają się dla białek zewnątrzkomórkowych z wcześniej scharakteryzowanymi ligandami. Zdefiniowanie interakcji receptor-ligand w organizmach ludzkich i modelowych jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów, które dyktują komunikację komórkową podczas homeostazy, a także dysregulacji prowadzącej do choroby, a tym samym do informowania o nowych lub ulepszonych opcjach terapeutycznych. Niemniej jednak wykrywanie zewnątrzkom.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.H., S.R-R i N.M-M. są pracownikami Genentech i posiadają udziały w grupie Genentech Inc./Roche.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Philamerowi Calsesowi i Kobe Yuenowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni Randy'emu Yenowi za doskonałe doradztwo techniczne.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glicerol	USB Corporation	56-81-5	Bufor
blokujący SeptoMark do przechowywania białek	Zeptosens	BB1, 90-40	Szkiełka mikromacierzy buforowej blokującej
Albumina surowicy bydlęcej	Roche	03-117-957-001	Suwak do zakładania maski (opcjonalnie)
Polipropylenowe płytki wielodołkowe	Greiner Bio One	82050-678	Magazynowanie białka
Polipropylenowe płytki wielodołkowe	Arrayit	MMP384	Drukowanie slajdów
NanoPrint LM60, lub podobny kontakt mikromacierz	Arrayit	NanoPrint LM60 lub podobny mikromacierz kontaktowa	Druk slajdów
Mikroszpilki	Arrayit	Micro szpilki do punktowania	Drukowanie slajdów
Stacja blokująca ZeptoFOG	Zeptosens	Stacja blokująca ZeptoFOG, 1210	Prowadnice blokowe po wydrukowaniu
Odtłuszczone mleko w proszku	Thermo Fisher	LP0031	Roztwór
blokującySzkiełko szklane pokryte żywicą epoksysydową	Nextrion Slide E	1064016	Szkiełka Microarray
Zestaw uchwytów na szkło i stojaków na szkiełka	Wheaton	900303	Przechowywanie szkiełek
Barwnik monoreaktywny Cy5	GE Healthcare	PA23031	Etykietowanie albuminy
Barwnik monoreaktywny Cy5	GE Healthcare	PA25001	Znakowanie ludzkiej IgG Kolumna
odsalająca Pro-spin	Princeton Separacje	CS-800	Usuń wolny barwnik
Samoprzylepna uszczelka z folii aluminiowej	AlumaSeal	F-384-100	Uszczelka talerzy
magazynowych Fiolki kriogeniczne z polipropylenu	Fiolki Corning	430658	Master do przechowywania biblioteki białek
Mikrogranulki białka A	Miltenyi	120-000-396	Zapytanie o multimeryzację białka
Ludzka IgG	Jackson Immunoresearch	& nbsp; 009-000-003	Nieistotne IgG do znakowania
białka A	Sigma	P7837	Blokowanie szkiełek mikromacierzy
Stacja hybrydyzacyjna, a-Hyb lub podobna	Miltenyi	Stacja hybrydyzacyjna, a-Hyb lub podobna	Automatyczne przetwarzanie mikromacierzy (opcjonalnie)
Skaner GenePix 4000B lub podobne	urządzenia molekularne Skaner	GenePix 4000B lub podobny	Skanowanie slajdów
GenePix Pro lub równoważne oprogramowanie do ekstrakcji danych	Urządzenia	molekularneGenePix Pro lub równoważne oprogramowanie do ekstrakcji danych	Przetwarzanie danych
Signal P4.1	DTU Bioinformatyka,	oprogramowanie online	Technicznego Narzędzie predykcyjne do określania obecności i lokalizacji miejsc rozszczepienia peptydów sygnałowych
Serwer TMHMM 2.0	DTU Bioinformatyka, oprogramowanie online Duńskiego Uniwersytetu Technicznego		Przewidywanie helis transbłonowych w białkach
Phobius	Oprogramowanie online Centrum Bioinformatyki w Sztokholmie		Połączone topologia transbłonowa i predyktor peptydów sygnałowych
TOPCONS	Oprogramowanie online	Uniwersytetu Sztokholmskiego	Przewidywanie topologii błony i peptydów sygnałowych

punktowe Duńskiego Uniwersytetu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interact....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles