W tym badaniu modyfikujemy istniejącą metodę eksperymentalną, aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki, ustanawiając mysi model zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Doustne podawanie ekstraktu metanolowego (GRex) Glycyrrhizae Radix et Rhizome (GR) po indukcji udaru znacznie zmniejszyło całkowitą objętość zawału w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena neuroprotekcyjnego działania ekstraktu z Glycyrrhizae radix et rhizoma przy użyciu przejściowego mysiego modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedokrwienie, po którym następuje reperfuzja przepływu krwi w mózgu po udarze, prowadzi do śmierci komórek nerwowych i utraty tkanki mózgowej. Najczęściej stosowanym modelem zwierzęcym do badania udaru mózgu jest model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Wcześniejsze badania naukowe wykazały różne rozmiary zawału, nawet gdy ten sam gatunek zwierząt doświadczalnych był używany w podobnych warunkach MCAO. W związku z tym opracowaliśmy ulepszoną metodę eksperymentalną, aby rozwiązać ten problem. Myszy poddano MCAO przy użyciu włókna jako materiału okluzyjnego, aby naśladować warunki ludzkiego udaru, a grubość włókna została zoptymalizowana w celu ustalenia bardziej powtarzalnej objętości zawału. Myszy leczone ekstraktem metanolowym Glycyrrhizae Radix et Rhizome (GRex) po indukcji udaru wykazały znacznie zmniejszoną całkowitą objętość zawału i zwiększoną liczbę komórek, które przeżyły, w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Ten zmodyfikowany protokół eksperymentalny z powodzeniem i w sposób powtarzalny wykazał korzystny wpływ GRex na udar niedokrwienny.
Wprowadzenie
Uszkodzenie mózgu spowodowane niedokrwieniem i reperfuzją przepływu krwi w mózgu prowadzi do śmierci komórek nerwowych i utraty tkanki mózgowej. Ten rodzaj uszkodzenia mózgu nadal rośnie wraz ze wzrostem częstości występowania chorób naczyń mózgowych spowodowanych rozprzestrzenianiem się chorób metabolicznych, takich jak otyłość, nadciśnienie i cukrzyca1,2. Bezwzględna liczba pacjentów w podeszłym wieku z udarem mózgu dramatycznie wzrosła na całym świecie, a koszty opieki medycznej dla tych pacjentów, którzy często pozostają z długotrwałą niepełnosprawnością, stanowią poważne obciążenie społeczne. W związku z tym należy w jak największym stopniu ograniczyć wtórne niepełnosprawności, aby zmniejszyć obciążenie ekonomiczne1,2.
Najczęściej używanym modelem zawału mózgu u gryzoni jest model zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCA) (MCAO), w którym MCA jest zasłonięte za pomocą pokrytego silikonem włókna do szycia chirurgicznego, aby zablokować przepływ krwi, powodując udar niedokrwienny3,4. Użycie żarnika jako materiału okluzyjnego umożliwia kontrolę czasu okluzji i trwałości poprzez manipulowanie czasem wprowadzania żarnika do wnętrza światła.
Poprzednie badania wykazały, że nawet gdy używany jest ten sam model MCAO gryzoni, całkowita objętość zawału mózgu różni się między eksperymentami, co powoduje niską powtarzalność badań. Aby poprawić odtwarzalność, zoptymalizowaliśmy grubość mięty filamentowej użytej w eksperymencie. Wyniki wstępnych badań okresu niedokrwiennego mózgu i indukowanego zawału wykazały, że okres niedokrwienia dłuższy niż 60 minut pozwolił na obserwację i ilościowe określenie obszaru wolumetrycznego uszkodzonej tkanki mózgowej.
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), znana również jako lukrecja, składa się z suszonych korzeni i kłączy Glycyrrhiza uralensis i G. glabra. Był używany w tradycyjnej medycynie chińskiej i koreańskiej do różnych celów, w tym jako dodatek do żywności i leczniczo5,6,7.
W poprzednim badaniu8, wstępne leczenie ekstraktem metanolowym GR (GRex) wykazało działanie antyapoptotyczne u myszy MCAO, w tym znaczące zapobieganie spadkowi ekspresji białka chłoniaka B-komórkowego 2 (Bcl-2) i Bcl bardzo dużego (Bcl-xL). Badanie to zostało przeprowadzone w celu poprawy odtwarzalności konwencjonalnego modelu myszy MCAO poprzez ocenę jego skuteczności w określaniu, czy leczenie GRex po zawale skutecznie zmniejszyło objętość zawału w uszkodzeniu mózgu wywołanym przez MCAO.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez komisję etyki Uniwersytetu Narodowego Pusan (numer zatwierdzenia, PNU-2016-1087). Graficzny przegląd tego badania jest pokazany na Rysunek 1.
1. Przygotowanie i administracja GRex
UWAGA: GR użyty w tym badaniu został zakupiony od komercyjnej firmy farmaceutycznej.
- Umieścić 200 g GR w 2 000 ml metanolu i inkubować w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 5 dni.
- Przefiltrować mieszaninę za pomocą bibuły filtracyjnej o grubości 0,26 mm i wielkości porów 5 μm, a następnie usunąć supernatant. Dodaj 1,000 ml metanolu do pozostałości GR i ponownie przefiltruj.
- Połączyć dwa supernatanty, przefiltrować przez bibułę filtracyjną, skoncentrować w próżni, a następnie liofilizować pozostałość w celu wytworzenia GRex.
- Rozpuść GRex w dimetylosulfotlenku (DMSO), rozcieńczyć 0,9% solą fizjologiczną i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,45 μm. Następnie dostosuj końcowe stężenie DMSO do < 5%.
- Podać GRex (300 mg/kg masy ciała) 1 godzinę po reperfuzji MCAO przez zgłębnik doustny. Podawać DMSO rozcieńczony w soli fizjologicznej (10 ml/kg masy ciała) tylko odpowiednio grupie normalnej i grupie kontrolnej.
UWAGA: Stężenie GRex użyte w tym eksperymencie zostało określone zgodnie ze stężeniem, które było aktywne w naszym poprzednim badaniu8.
2. Mysi model MCAO
- Używaj samców myszy C57BL/6 w wieku 6 tygodni i o wadze 22-25 g. Zapewnij wszystkim zwierzętom swobodny dostęp do standardowej karmy i wody oraz trzymaj je w środowisku o kontrolowanej temperaturze (22 ± 1 °C) i 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.
- Podziel myszy na grupy po sześć myszy każda, które powinny składać się z pozorowanych grup normalnych, kontrolnych i leczonych GRex.
- Wykonaj operację MCAO (modyfikacja metody Koizumi i wsp.9) w grupie kontrolnej i grupie GRex za pomocą stereomikroskopu.
- Wywołać znieczulenie wziewne u myszy za pomocą 2% izofluranu w 70% N2O i 30% O2 . Znieczulenie jest uważane za wystarczające, gdy mysz przestaje reagować na bodziec mechaniczny przyłożony do ogona. Utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie 36,5 ± 0,5 °C za pomocą koca utrzymującego temperaturę ciała podłączonego do termometru.
- Usuń wszystkie włosy na klatce piersiowej i szyi myszy poprzez golenie, a następnie użycie kremu do depilacji, zdezynfekuj miejsce operowane skóry peelingiem betadynowym na przemian z alkoholem dwa razy, a następnie wykonaj nacięcie o długości około 2 cm ostrzem chirurgicznym na środku szyi. Ostrożnie odizoluj lewą tętnicę szyjną wspólną (LCCA), tętnicę szyjną zewnętrzną i odgałęzienie tętnicy szyjnej wewnętrznej od otaczających tkanek łącznych.
- Podwiązać tętnicę szyjną zewnętrzną i tętnicę szyjną wspólną za pomocą szwu chirurgicznego (szew jedwabny 4-0, węzeł półzaczepiający), aby tymczasowo zablokować przepływ krwi do tętnicy szyjnej wewnętrznej podczas operacji.
- Wprowadzić nylonowy szew pokryty silikonem (żyłka 8-0 o długości 11 mm) przez tętnicę szyjną wewnętrzną do początku lewego MCA. Dostosuj grubość pokrytej silikonem części filamentu w zakresie 0,10-0,12 mm.
- Zmierz spadek względnego przepływu krwi w mózgu (rCBF) w MCA za pomocą laserowego przepływomierza dopplerowskiego. MCAO zostanie potwierdzone, gdy rCBF zostanie utrzymany na poziomie < 20% wartości stanu spoczynku przez cały okres niedokrwienia.
- Przymocuj wprowadzony filament do naczynia krwionośnego na 2 godziny, podczas gdy tętnica mózgowa jest niedrożna, a następnie ostrożnie wycofaj włókno, aby przywrócić przepływ krwi przez 22 godziny reperfuzji. Zszyj skórę, szyjąc w 5 miejscach (szew jedwabny 3-0, dwa węzły półzaczepowe) i pozwól każdej myszy obudzić się ze znieczulenia.
- W grupie normalnej należy wykonać operację pozorowaną, postępując zgodnie z tą samą procedurą powyżej (do ppkt 2.4), z następującym wyjątkiem. Podwiązać tętnicę szyjną wspólną i zszyć nacięty mięsień i skórę.
3. Pomiar objętości uszkodzonej tkanki mózgowej
- Po eutanazji myszy w celu pomiaru uszkodzenia mózgu za pomocą wdychania CO2 należy wyciąć mózg myszy 24 godziny po wystąpieniu MCAO za pomocą nożyczek chirurgicznych tęczówki i kleszczy kątowych.
- Po usunięciu głowy za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odwrócić skórę od czaszki.
- Złam kości ciemieniowe za pomocą ustawionych pod kątem kleszczy, jednocześnie odrywając oponę twardą, a następnie ostrożnie odizoluj mózg od czaszki.
- Wyciętą tkankę pociąć na skrawki (o grubości 1 mm) za pomocą macierzy mózgowej myszy, a następnie wybarwić skrawki przez 17 minut w roztworze 2% chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).
- Utrwal skrawki w 10% formalinie przez co najmniej 2 godziny, a następnie sfotografuj je aparatem cyfrowym. Obserwuje się, że TTC barwi żywotną tkankę na czerwono, podczas gdy obszary martwicze będą białe.
- Przeanalizuj i określ ilościowo obszar zawału mózgu każdej sekcji za pomocą ImageJ.
4. Barwienie skrawków histologicznych hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz fioletem krezylowym
- Poddaj myszy eutanazji do badania histologicznego przez wdychanie CO2 i perfuzjuj je przezsercowo za pomocą 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 10 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Odizolować mózg zgodnie z tą samą procedurą, co powyżej (3.1) i zanurzyć mózg w 10 ml 30% sacharozy na noc.
- Osadź tkankę mózgową w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i pokrój ją koronalnie na odcinki o grubości 15 μm za pomocą kriostatu. Zamontuj sekcje na szkiełkach podstawowych, a następnie zabarwij je hematoksyliną i eozyną (H&E) lub fioletem krezylowym.
- Zanurz szkiełka podstawowe w 80% etanolu na 1 minutę, a następnie zabarwić w roztworze hematoksyliny na 5 minut.
- Zanurz szkiełka dwukrotnie w 1% kwaśnym alkoholu, zanurz w nasyconym roztworze węglanu litu na 30 s, przemyj wodą z kranu przez 30 s, a następnie przeciwplam w roztworze eozyny na 30 s.
- Opłucz szkiełka w wodzie z kranu, namocz kolejno w 95% i absolutnym etanolu.
- Wysuszyć szkiełka na powietrzu, oczyścić je z ksylenu przez co najmniej 10 minut, a następnie zamontować szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego.
- Umieść szkiełka podstawowe na podgrzewaczu na co najmniej 1 godzinę, a następnie zanurz na noc w 50% etanolu rozcieńczonym chloroformem.
- Szkiełka należy zabarwić 0,1% fioletem krezylowym przez 10 minut w suchym piekarniku o temperaturze 40 °C.
- Zanurz w 95% etanolu na 30 minut, a następnie odwodnij w absolutnym etanolu 2 razy.
- Wyczyść 2 razy w ksylenie przez 5 minut, a następnie zamontuj z podłożem montażowym po wyschnięciu na powietrzu.
- Za pomocą mikroskopu obserwuj zmiany histologiczne, które wystąpiły po uszkodzeniu mózgu wywołanym przez MCAO.
5. Analiza statystyczna
- Wyraź wyniki eksperymentalne jako średnie ± odchylenia standardowego i określ istotność statystyczną między grupami za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie analizy post hoc Tukeya przy użyciu oprogramowania do analizy danych.
- Ustaw istotność statystyczną na wartość p < 0,05.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W grupie normalnej poddanej operacji pozorowanej nie zaobserwowano zawału mózgu, podczas gdy w grupie kontrolnej stwierdzono stosunkowo szeroki zakres obszarów uszkodzonych. U myszy z grupy modelu MCAO, którym podano 300 mg/kg GRex, zaobserwowano statystycznie istotną redukcję obszaru uszkodzenia (Rycina 2).
Zmiany histologiczne badano poprzez barwienie ischemicznych przekrojów mózgu H&E lub fio...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wraz z rosnącym rozpowszechnieniem chorób metabolicznych, takich jak przewlekłe nadciśnienie, cukrzyca i hiperlipidemia, które są głównymi czynnikami ryzyka udaru mózgu, zapobieganie i leczenie udaru stało się ważnym obszarem badań medycznych12,13. Deficyty językowe i ruchowe po udarze mózgu są silnie skorelowane ze stopniem uszkodzenia tkanki mózgowej14 i skutkują niską jakością życia pacjentów i ich rodzin15. Ważn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Nie dotyczy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea | Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | |
| Jakościowa bibuła filtracyjna | Advantec | Bibuła filtracyjna nr 2 | Jakościowa bibuła filtracyjna |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma | D8418-250ML | Dimetylosulfotlenek (DMSO) |
| Filtr strzykawkowy (0,45 &mikro; m) | Filtr | strzykawkowy Sigma CLS431220 (0,45 &mikro; m) | |
| Mikroskop stereoskopowy | Leica | M50 | Mikroskop |
| stereoskopowy Mikroskop stereoskopowy | Nikon | SMZ745 | |
| Laserowy instrument dopplerowski | moorVMS-LDF | Laserowy doppler | |
| anestezjologiczny wspornik stołowy z N2O i System przepływomierza O2 | Harvard Appratus | 34-1352 | Anestezjologiczny wspornik stołowy z N2O& System przepływomierza O2 |
| System monitorowania homeotermicznego Harvard | Appratus | 55-7020 | System monitorowania homeotermicznego |
| Aparat cyfrowy | Aparat cyfrowy | Canon | Eos-M2 |
| Cryostat Mikroskop | kriostatowy | Leica | CM3050S |
| Zeiss | Analiza danych mikroskopu | Zeiss Axio | |
| Systat | Software Inc. | SigmaPlot wersja 12 | Analiza |
| danych Analiza danych | NIH Image | ImageJ | Analiza danych |
| Dieta myszy | Doo Yeol Biotech | Standardowa karma dla gryzoni | Dieta dla myszy |
| Izofluran | JOONGWAE | A02104781 | Izofluran |
| Izofluran | TROIKAA | ISOTROY 100 | Isofluran |
| Szew jedwabny (4-0 jedwab) | AILEE | SK47510 | Jedwabny szew (4-0 jedwab) |
| Szew jedwabny (3-0 Biały jedwab) | Baekjae | 57 | Szew jedwabny (3-0 Biały jedwab) |
| Szew nylonowy (monofilament 8-0) | AILEE | NB825 | Szew nylonowy (8-0 monofilament) |
| Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) | Sigma | T8877-25G | Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) |
| Formalina (roztwór formaldehydu) | JUNSEI | 69360-1263 20KG | Formalina (roztwór formaldehydu) |
| Hematoksylina (Harris Hematoxylin) | YD Diagnostics | EasyStain | Hematoksylina (Harris Hematoxylin) |
| Eozyna (1% roztwór eozyny Y) | MUTO PURE CHEMICALS | 3200-2 | Eozyna (1% roztwór eozyny Y) |
| Fiolet krezylowy (octan) | Sigma | C5042-10G | Fiolet krezylowy (octan) |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Paraformaldehyd |
| Sacharoza | JUNSEI | 31365-0350 1KG | Sacharoza |
| Optymalna temperatura cięcia (OCT) związek | Scigen | 4583 | Optymalna temperatura cięcia (OCT) związek |
| Nóż preparacyjny | Fine Science Tools | 10055-12 | Nóż preparacyjny |
| #4 Kleszcze | Fine Science Tools | 11241-30 | #4 Kleszcz# |
| 5 Kleszcze | Narzędzia do nauki | 11254-20 | #5 Kleszcz# |
| 6 Kleszcze | Narzędzia naukowe | 11260-20 | #6 Kleszcze |
| #7 Kleszcze | Drobne narzędzia naukowe | 11274-20 | #7 Cienkie |
| nożyczki chirurgiczne | Narzędzia naukowe | 14001-12 | Nożyczki chirurgiczne |
| Bardzo cienkie nożyczki Bonn | Narzędzia naukowe | 14084-08 | Bardzo cienkie nożyczki do bonn |
| Moria Pascheff-Wolff Wiosna Nożyczki | Narzędzia do nauki | 15371-92 | Moria Pascheff-Wolff Nożyczki sprężynowe |
| Kleszcze rozszerzające naczynia | Narzędzia do nauki o naczyniach | 18153-11 | Kleszcze do rozszerzania naczyń |
Bibliografia
- Bejot, Y., Delpont, B., Giroud, M. Rising stroke incidence in young adults: more epidemiological evidence, more questions to be answered. Journal of the American Heart Association. 11 (5), (2016).
- Hadadha, M., Vakili, A., Bandegi, A. R. Effect of the inhibition of hydrogen sulfide synthesis on ischemic injury and oxidative stress biomarkers in a transient model of focal cerebral ischemia in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24 (12), 2676-2684 (2015).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Article in Handbook of Clinical Neurology. 92, 43-66 (2009).
- Kim, D. Animal Models of Stroke. Brain and Neurorehabilitation. 4 (1), 1-11 (2011).
- Rizzato, G., Scalabrin, E., Radaelli, M., Capodaglio, G., Piccolo, O. A new exploration of licorice metabolome. Food Chemistry. 221, 959-968 (2017).
- Zhu, Z., et al. Rapid determination of flavonoids in licorice and comparison of three licorice species. Journal of Separation Science. 39 (3), 473-482 (2016).
- Ota, M., Mikage, M., Cai, S. Q. Herbological study on the medicinal effects of roasted licorice and honey-roasted licorice. Yakushigaku Zasshi. 50 (1), 38-45 (2015).
- Lim, C., et al. Licorice pretreatment protects against brain damage induced by middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Medicinal Food. 21 (5), 474-480 (2018).
- Koizumi, J. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Zhu, Y., Liu, F., Zou, X., Torbey, M. Comparison of unbiased estimation of neuronal number in the rat hippocampus with different staining methods. Journal of Neuroscience Methods. 254, 73-79 (2005).
- Alberts, M. J., Ovbiagele, B. Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. Journal of Neurology. 254 (10), 1414-1426 (2007).
- Pinto, A., Tuttolomondo, A., Di Raimondo, D., Fernandez, P., Licata, G. Cerebrovascular risk factors and clinical classification of strokes. Seminars in Vascular Medicine. 4 (3), 287-303 (2004).
- Barlow, S. J. Identifying the brain regions associated with acute spasticity in patients diagnosed with an ischemic stroke. Somatosensory and Motor Research. 33 (2), 1-8 (2016).
- Roth, S., Liesz, A. Stroke research at the crossroads - where are we heading. Swiss Medical Weekly. 146, 14329(2016).
- Feuerstein, G. Z., Wang, X. Animal models of stroke. Molecular Medicine Today. 6 (3), 133-135 (2000).
- Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9 (5), 541-551 (2014).
- Kumar, A., Gupta Aakriti, V. A review on animal models of stroke: an update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
- O'Collins, V. E., Donnan, G. A., Howells, D. W. History of animal models of stroke. International Journal of Stroke. 6 (1), 77-78 (2011).
- Ji, S., et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis (licorice): discovery of the effective components of a traditional herbal medicine. Journal of Natural Products. 79 (2), 281-292 (2016).
- Yang, R., Wang, L. Q., Yuan, B. C., Liu, Y. The pharmacological activities of licorice. Planta Medica. 81 (18), 1654-1669 (2015).
- Yang, R., Yuan, B. C., Ma, Y. S., Zhou, S., Liu, Y. The anti-inflammatory activity of licorice, a widely used Chinese herb. Pharmaceutical Biology. 55 (1), 5-18 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
