Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58455

⸱

8 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę mikrodializy in vivo do analizy uwalniania asparaginianu i glutaminianu w brzusznym hipokampie u szczurów z padaczką i bez padaczki, w połączeniu z zapisami EEG. Zewnątrzkomórkowe stężenia asparaginianu i glutaminianu mogą być skorelowane z różnymi fazami choroby.

Streszczenie

Mikrodializa jest dobrze znaną techniką neurobiologiczną, która koreluje zmiany neurologicznie aktywnych substancji dyfundujących do przestrzeni śródmiąższowej mózgu z zachowaniem i/lub konkretnym wynikiem patologii (np. napady padaczkowe). Podczas badania padaczki technika mikrodializy jest często łączona z krótkotrwałym lub nawet długoterminowym monitorowaniem wideoelektroencefalografii (EEG) w celu oceny częstości napadów spontanicznych, ich nasilenia, progresji i grupowania. Kombinowana mikrodializa-EEG opiera się na zastosowaniu kilku metod i instrumentów. Tutaj przeprowadziliśmy mikrodializę in vivo i ciągły zapis wideo EEG w celu monitorowania odpływu glutaminianu i asparaginianu w czasie, w różnych fazach naturalnej historii padaczki w modelu szczurzym. To połączone podejście pozwala na powiązanie zmian w uwalnianiu neuroprzekaźników z określonymi etapami rozwoju i progresji choroby. Stężenie aminokwasów w dializacie oznaczono metodą chromatografii cieczowej. W tym miejscu opisano metody i nakreślono główne środki ostrożności, które należy podjąć podczas mikrodializy in vivo-EEG, ze szczególnym uwzględnieniem chirurgii stereotaktycznej, stymulacji bazowej i wysokiej zawartości potasu podczas mikrodializy, zapisu EEG na elektrodzie głębokości oraz analizy asparaginianu i glutaminianu w dializacie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Podejście to można dostosować do testowania różnych zmian fizjologicznych stężeń asparaginianu i glutaminianu w mózgu, wywołanych lekami lub chorobami. W zależności od dostępności odpowiedniego testu analitycznego, może on być dalej wykorzystywany do badania różnych rozpuszczalnych cząsteczek przy jednoczesnym zastosowaniu zapisu EEG.

Wprowadzenie

Aby zapewnić wgląd w funkcjonalne upośledzenie pobudzającego za pośrednictwem glutaminianu i hamującego GABA-ergicznego neurotransmisji skutkującego spontanicznymi napadami padaczkowego w padaczce skroniowej (TLE), systematycznie monitorowaliśmy zewnątrzkomórkowe stężenia GABA1 i później poziomy glutaminianu i asparaginianu2 poprzez mikrodializę w brzusznym hipokampie szczurów w różnych punktach czasowych naturalnego przebiegu choroby, tj. w okresie rozwoju i progresji padaczki. Wykorzystaliśmy model pilokarpiny TLE u szczurów, który bardzo dokładnie naśladuje chorobę pod względem zmian behawioralnych, elektrofizjologicznych i histopatologicznych3,4 i skorelowaliśmy stężenie aminokwasów w dializacie z jego różnymi fazami: fazą ostrą po zniewadze padaczkowej, fazą utajenia, czasem pierwszego napadu spontanicznego i przewlekłym phass5,6,7. Określenie faz choroby było możliwe dzięki długotrwałemu monitorowaniu wideo-EEG oraz precyzyjnemu EEG i charakterystyce klinicznej napadów samoistnych. Zastosowanie techniki mikrodializy w połączeniu z długotrwałym monitorowaniem wideo-EEG pozwoliło na zaproponowanie mechanistycznych hipotez dotyczących neuropatologii TLE. Podsumowując, technika opisana w tym manuskrypcie pozwala na powiązanie zmian neurochemicznych w określonym obszarze mózgu z rozwojem i progresją padaczki w modelu zwierzęcym.

Sparowane urządzenia, składające się z elektrody głębokościowej zestawionej z kaniulą do mikrodializy, są często wykorzystywane w badaniach nad padaczką, gdzie zmiany w neuroprzekaźnikach, ich metabolitach lub substratach energetycznych powinny być skorelowane z aktywnością neuronalną. W zdecydowanej większości przypadków stosuje się ją u swobodnie zachowujących się zwierząt, ale może być również przeprowadzana w podobny sposób u ludzi, np. u pacjentów z padaczką oporną na farmako, poddawanych badaniu elektrody głębinowej przed operacją8. Zarówno zapis EEG, jak i pobranie dializatu mogą być wykonywane oddzielnie (np. wszczepienie elektrody w jednej półkuli i sondy do mikrodializy w drugiej półkuli lub nawet wykonanie mikrodializy w jednej grupie zwierząt podczas wykonywania samego EEG w innej grupie zwierząt). Jednak sprzężenie elektrod z sondami może mieć wiele zalet: upraszcza chirurgię stereotaktyczną, ogranicza uszkodzenia tkanek tylko do jednej półkuli (pozostawiając drugą, nienaruszoną, jako kontrolę dla badań histologicznych) i homogenizuje wyniki, ponieważ są one uzyskiwane z tego samego obszaru mózgu i tego samego zwierzęcia.

Z drugiej strony, przygotowanie sprzężonego urządzenia do mikrodializy z elektrodą wymaga umiejętności i czasu, jeśli jest ono domowej roboty. Można było wydać stosunkowo wysokie sumy pieniędzy, jeśli zostało się zakupionym na rynku. Co więcej, gdy sondy do mikrodializy (końcówki sond mają zwykle średnicę 200-400 μm i długość 7-12 mm)9 i elektrody EEG (końcówki elektrod mają zwykle średnicę 300-500 μm i są wystarczająco długie, aby dotrzeć do interesującej nas struktury mózgu10), zamontowane urządzenie reprezentuje nieporęczny i stosunkowo ciężki przedmiot po jednej stronie głowy, co jest kłopotliwe dla zwierząt i podatne na zgubienie, zwłaszcza gdy jest podłączone do pompy dializacyjnej i przewodowego systemu rejestracji EEG. Ten aspekt jest bardziej istotny u zwierząt z padaczką, które są trudne w obsłudze i mniej przystosowują się do sesji mikrodializy. Właściwe techniki chirurgiczne i odpowiednia opieka pooperacyjna mogą skutkować długotrwałymi implantami, które powodują minimalny dyskomfort u zwierząt i powinny być stosowane w skojarzonych eksperymentach mikrodializy-EEG10,11,12.

Zalety i ograniczenia techniki mikrodializy zostały szczegółowo omówione przez wielu neurobiologów. Jej główną przewagą nad innymi technikami perfuzji in vivo (np. szybkim przepływem push-pull lub perfuzją kubka korowego) jest mała średnica sondy, która pokrywa stosunkowo precyzyjny obszar zainteresowania13,14,15. Po drugie, błona mikrodializacyjna tworzy fizyczną barierę między tkanką a perfugatem; W związku z tym substancje o dużej masie cząsteczkowej nie krzyżują się i nie zakłócają analizy16,17. Ponadto tkanka jest chroniona przed turbulentnym przepływem perfuzatu18. Kolejną ważną zaletą jest możliwość modyfikacji przepływu perfuzatu w celu maksymalizacji stężenia analitu w perfuzacie (tj. proces mikrodializy może być dobrze zdefiniowany matematycznie i może być modyfikowany w celu uzyskania wysokich stężeń analitu w próbce)19. Wreszcie, technika ta może być wykorzystana do wprowadzenia leków lub substancji farmakologicznie czynnych do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania i do określenia ich działania w miejscu interwencji20. Z drugiej strony, mikrodializa ma ograniczony czas rozwiązywania (zwykle więcej niż 1 minutę ze względu na czas potrzebny na pobranie próbek) w porównaniu z czujnikami elektrochemicznymi lub biologicznymi; Jest to technika inwazyjna, która powoduje uszkodzenie tkanek; Narusza równowagę neurochemiczną w przestrzeni wokół błony ze względu na ciągły gradient stężeń wszystkich rozpuszczalnych substancji, które dostają się do perfuzatu wraz z interesującym analitem. Wreszcie, na technikę mikrodializy duży wpływ mają ograniczenia technik analitycznych stosowanych do ilościowego oznaczania substancji w klasie perfuzatów9,21,22,23. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) po derywatyzacji dialdehydem ortoftalowym do analizy glutaminianu i asparaginianu w próbkach biologicznych została dobrze zweryfikowana24,25,26,27 i jej obszerne omówienie wykracza poza zakres tego manuskryptu, ale dane uzyskane przy użyciu tej metody zostaną szczegółowo opisane.

Jeśli mikrodializa jest wykonywana prawidłowo i bez modyfikacji składu perfuzatu, może dostarczyć wiarygodnych informacji o podstawowych poziomach uwalniania neuroprzekaźników. Największa część poziomów podstawowych jest prawdopodobnie wynikiem rozlania się nadajnika z synaps9. Ponieważ w wielu przypadkach proste próbkowanie neuroprzekaźnika w dodatkowej przestrzeni synaptycznej nie jest wystarczające do osiągnięcia celów badania, technika mikrodializy może być również stosowana do stymulacji neuronów lub pozbawienia ich ważnych jonów fizjologicznych, takich jak K+ lub Ca2+, w celu wywołania lub zapobieżenia uwalnianiu neuroprzekaźnika.

Stymulacja o wysokim K+ jest często używana w neurobiologii do stymulowania aktywności neuronalnej nie tylko u obudzonych zwierząt, ale także w kulturach pierwotnych i organotypowych. Narażenie zdrowego ośrodkowego układu nerwowego na roztwory o wysokich stężeniach K+ (40-100 mM) wywołuje wypływ neuroprzekaźników28. Ta zdolność neuronów do zapewnienia dodatkowego uwalniania w odpowiedzi na wysoki poziom K+ może być zagrożona u zwierząt z padaczką1 i w innych chorobach neurodegeneracyjnych29,30. Podobnie, deprywacja Ca2 + (uzyskana przez perfuzję roztworów wolnych od Ca2 +) jest wykorzystywana do ustalenia zależnego od wapnia uwalniania większości neuroprzekaźników mierzonego za pomocą mikrodializy. Powszechnie uważa się, że uwalnianie zależne od Ca2+ jest pochodzenia neuronalnego, podczas gdy uwalnianie niezależne od Ca2+ pochodzi z gleju, ale wiele badań wzbudziło kontrowersje co do znaczenia wrażliwych na Ca2+ pomiarów np. glutaminianu lub GABA9: dlatego, jeśli to możliwe, wskazane jest wspieranie badań mikrodializ badaniami mikrosensorowymi, ponieważ te ostatnie mają wyższą rozdzielczość przestrzenną, a elektrody pozwalają zbliżyć się do synaps31.

Jeśli chodzi o badania mikrodializy u zwierząt z padaczką, ważne jest, aby podkreślić, że dane uzyskane od większości z nich opierają się na monitorowaniu wideo lub wideo-EEG napadów, tj. przejściowego występowania oznak i/lub objawów z powodu nieprawidłowej nadmiernej lub synchronicznej aktywności neuronalnej w mózgu32. Istnieją pewne cechy charakterystyczne napadów elektrograficznych u zwierząt leczonych pilokarpiną, które należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania doświadczenia. Po spontanicznych napadach następuje depresyjna aktywność z częstymi skokami międzynapadowymi EEG3 i występują w klastrach33,34. Zwierzęta nieepileptyczne operowane pozorami mogą wykazywać aktywność podobną do napadów padaczkowych35 i dlatego parametry oceny zapisów EEG powinny być ustandaryzowane36 i, jeśli to możliwe, czas sesji mikrodializy powinien być dobrze zdefiniowany. Na koniec zdecydowanie zalecamy przestrzeganie zasad i standardów metodologicznych monitorowania wideo-EEG u dorosłych gryzoni z grupy kontrolnej, przedstawionych przez ekspertów z Międzynarodowej Ligi Przeciwko Padaczce i Amerykańskiego Towarzystwa Epilepsji w ich najnowszych raportach37,38.

Tutaj opisujemy mikrodializę glutaminianu i asparaginianu równolegle z długoterminowymi zapisami wideo EEG u zwierząt z padaczką i ich analizą w dializacie za pomocą HPLC. Położymy nacisk na krytyczne kroki protokołu, o które należy zadbać, aby uzyskać najlepszy wynik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Ferrarze oraz przez Włoskie Ministerstwo Zdrowia (autoryzacja: D.M. 246/2012-B) zgodnie z wytycznymi określonymi w Dyrektywie Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG). Protokół ten jest specjalnie dostosowany do oznaczania glutaminianu i asparaginianu w dializatach mózgu szczurów uzyskanych pod kontrolą EEG sesji mikrodializy u szczurów z padaczką i bez padaczki. Wiele z opisanych tu materiałów można łatwo zastąpić tymi, które wykorzystuje się w swoim laboratorium do zapisów EEG czy mikrodializy.

1. Montaż sondy mikrodializy z elektrodą

  1. Użyj 3-kanałowej, dwuskręconej elektrody (z elektrodą rejestrującą o długości co najmniej 20 mm i elektrodą uziemiającą o długości 10 cm) i połącz ją z kaniulą prowadzącą, aby przygotować urządzenie. Zobacz przykłady 3-kanałowej elektrody i kaniuli prowadzącej do dializy w Rysunek 1A-1B.
  2. Wyjmij (Rysunek 1C) i włóż (Rysunek 1D) metalową kaniulę prowadzącą do atrapy plastikowej kaniuli kilka razy przed użyciem, aby ułatwić jej wyjęcie w momencie przełączenia na sondę do mikrodializy u zwierząt.
  3. Zegnij skręcone druty elektrody rejestrującej dwa razy (Rysunek 1E-1F) w celu wyrównania drutów z atrapą kaniuli prowadnicy i przyciąć końcówkę elektrody (Rysunek 1G) tak, aby była o 0,5 mm dłuższa niż końcówka kaniuli prowadzącej (Rysunek 1H) za pomocą suwmiarki cyfrowej.
  4. Przygotuj silikonowy krążek o długości 1 mm (średnica zewnętrzna 2 mm, grubość 0,3 mm; Rysunek 1I) i włóż końcówkę kaniuli prowadzącej i końcówkę skręconych elektrod do silikonowego kółka za pomocą pęsety (Rysunek 1J). Przymocuj go do podstawy cokołu kaniuli prowadzącej za pomocą kleju polimerowego o szybkim działaniu lub żywicy (Rysunek 1K). Zobacz przykład ukończonych urządzeń w Rysunek 1L i Rysunek 2A.
  5. Sterylizuj urządzenie w bakteriobójczym świetle UV przez 4 godziny. Odwróć urządzenie cztery razy, tak aby każda z jego stron była wystawiona na działanie światła przez 1 godzinę
    Uwaga: Wiele domowych elektrod i sond do mikrodializy może być montowanych w podobny sposób. Głowa wyżej opisanego implantu dla szczurów ma następujące wymiary: 7 mm szerokości x 5 mm głębokości x 10 mm długości od czubka do palca cokołu; Końcówka implantu ma około 11 mm długości, średnicę 600 μm, a całe urządzenie waży około 330-360 mg. Wyrób może być ponownie użyty dwa lub trzy razy, jeżeli (i) wystarczająca długość elektrody uziemiającej zostanie pozostawiona na czaszce podczas operacji do następnego użycia oraz (ii) gdy zwierzę zostanie uśmiercone, a wyrób odzyskany wraz z cementem dentystycznym pozostawia się go na noc w acetonie, tak aby cement mógł zostać mechanicznie zdezagregowany, a urządzenie ponownie umyte i wysterylizowane.

2. Chirurgia stereotaktyczna

  1. Użyj aparatu stereotaktycznego i uchwytu na klips do sondy (Rysunek 2B) do implantacji urządzenia zgodnie ze współczesnymi standardami aseptycznych i bezbolesnych operacji39,40,41.
    1. Znieczulić dorosłe szczury Sprague-Dawley mieszaniną ketaminy/ksylazyny (43 mg/kg i 7 mg/kg, i.p.) i przymocować ją do ramki stereotaktycznej. Dodać znieczulenie izofluranem (1,4% w powietrzu; 1,2 ml/min) do początkowego wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny, ponieważ pozwala to kontrolować głębokość znieczulenia w czasie. Ogol futro na głowie zwierzęcia.
  2. Przetrzyj powierzchnię skóry głowy roztworem na bazie jodu, a następnie 70% etanolem, aby przygotować ją do operacji aseptycznej39.
    1. Wszczepić rurkę prowadzącą kaniulę-elektrodę przygotowaną w pierwszej kolejności (1,1 – 1,5) do prawego brzusznego hipokampa, używając następujących współrzędnych: pasek nosowy + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm do bregma1,2. Postępuj zgodnie ze standardowymi technikami dla operacji stereotaktycznych10,11,12.
    2. Upewnij się, że nie zakrywa kotwiących. Montując go na aparacie stereotaktycznym, chwyć urządzenie za głowicę kaniuli prowadzącej, ponieważ można ją łatwo dopasować do uchwytu sondy.
  3. Zakotwicz urządzenie w czaszce za pomocą co najmniej czterech ze stali nierdzewnej, wkręcając je w kość czaszki (1 śruba w lewą i 1 śruba w prawą przednią płytkę kostną, 1 śruba w lewą płytkę ciemieniową i 1 śruba w płytki kości międzyciemieniowej). Dodaj kroplę kleju tkankowego, aby dodatkowo przymocować każdą do kości czaszki.
    1. Przykryj połowę gwintów cementem metakrylowym. Promuj wiązanie cementu, wykonując płytkie rowki w kości, aby zwiększyć przyczepność.
  4. Gdy końcówka urządzenia zostanie umieszczona w tkance mózgowej, skręć drut elektrody uziemiającej wokół 3 kotwiących. Przykryj wszystkie zamontowane i urządzenie cementem dentystycznym12,42,43.
  5. Monitoruj zwierzęta podczas zabiegu i przez około 1 godzinę po jego zakończeniu, aż osiągną pozycję pionową i będą poruszać się po klatce. Trzymaj je na podkładce rozgrzewającej, aby uniknąć hipotermii. Pozwól szczurom dojść do siebie przez co najmniej 7 dni po implantacji urządzenia.
  6. Monitoruj zwierzęta co najmniej raz dziennie przez 3 dni po operacji pod kątem oznak bólu lub niepokoju. Podawać zwierzętom krem z antybiotykiem (gentamycyna 0,1%) w pobliżu miejsca nacięcia, aby zapobiec zakażeniu, oraz ze środkiem przeciwbólowym (tramadol 5 mg/kg mc., i.p.) przez 3 dni, aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu.

3. Indukcja padaczki skroniowej przez pilokarpinę i przypisanie zwierząt do grup eksperymentalnych

  1. Po tygodniu rekonwalescencji pooperacyjnej należy losowo przydzielić zwierzęta do grup: (i) zwierzęta kontrolne otrzymujące nośnik oraz (ii) zwierzęta z padaczką, które otrzymają pilokarpinę. W grupie chorych na padaczkę należy stosować proporcjonalnie większą liczbę zwierząt, ponieważ nie u wszystkich szczurów, którym podawano pilokarpinę, choroba zachoruje.
  2. Wstrzyknąć dawkę metyloskopolaminy (1 mg/kg mc., s.c.), a 30 minut po niej, pojedyncze wstrzyknięcie pilokarpiny (350 mg/kg mc., i.p.) w celu wywołania stanu padaczkowego (SE). Wstrzyknąć metyloskopolaminę i nośnik (sól fizjologiczną) szczurom kontrolnym. Do wszystkich podań dożylnych należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25G.
    1. Sprawdź wzrokowo, czy zwierzęta zaczynają mieć napady behawioralne (poruszanie wibrysami w ciągu 5 minut, głową, klonowanie kończyn) i w ciągu 25 minut, ciągłe klonowanie całego ciała (SE).
  3. Zatrzymaj SE 2 godziny po wystąpieniu, aby mieć śmiertelność około 25% i średni okres utajenia wynoszący około 10 dni po podaniu diazepamu (20 mg / kg, i.p.). Należy obserwować i rejestrować wszelkie napady drgawkowe, które rozpoczynają się bezpośrednio po wstrzyknięciu pilokarpiny i kontynuują przez co najmniej 6 godzin po wstrzyknięciu.
  4. Podawać zwierzętom sól fizjologiczną (1 ml, i.p.) za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 25 g i roztworem sacharozy (1 ml, p.o.) za pomocą strzykawki 1 ml i elastycznej igły do karmienia 17G przez 2-3 dni po SE, aby przyspieszyć utratę masy ciała.
    1. Z badania należy wykluczyć zwierzęta, które nie osiągnęły początkowej masy ciała w ciągu pierwszego tygodnia po zastosowaniu pilokarpiny SE (z wyjątkiem grupy z ostrą postacią uśmierconą 24 godziny po SE, w której obserwacja masy ciała nie jest możliwa).
  5. Zwierzęta po SE przypisz losowo do różnych grup eksperymentalnych (Ryc. 3): ostra faza (w której mikrodializa ma miejsce 24 godziny po SE), latencja (7-9 dni po SE), pierwszy spontaniczny napad (około 11 dni po SE) i okres przewlekły (rozpoczyna się około 22-24 dni po SE, tj. około 10 dni po pierwszym napadzie). Monitorować zwierzęta pod kątem występowania napadów samoistnych.
    nuta: Stosować następujące kryteria włączenia/wykluczenia do dalszych doświadczeń na szczurach z padaczką: rozwój konwulsyjnego SE w ciągu 1 godziny po podaniu pilokarpiny; przyrost masy ciała w pierwszym tygodniu po SE i prawidłowe ustawienie sondy i elektrody do mikrodializy.

4. Monitorowanie i analiza zachowania epilepsji

  1. Długoterminowe monitorowanie zachowań padaczkowych
    1. Około 6 godzin po podaniu pilokarpiny (tj. po zakończeniu bezpośredniej obserwacji przez badaczy) należy umieścić zwierzęta w czystych klatkach domowych i rozpocząć 24-godzinny monitoring wideo.
    2. Kontynuuj 24-godzinny monitoring wizyjny do 5 dnia, korzystając z cyfrowego systemu nadzoru wizyjnego.
    3. Począwszy od 5 dnia, podłącz szczury w ich domowych prostokątnych klatkach do systemu rejestracji EEG na uwięzi i kontynuuj 24-godzinny monitoring wideo.
    4. Ustaw parametry na wzmacniaczu umieszczonym na zewnątrz klatki Faradaya (ustaw współczynnik wzmocnienia na każdym kanale zgodnie ze specyfiką sygnału EEG każdego zwierzęcia) i rozpocznij akwizycję EEG obserwując sygnał EEG wytwarzany przez niepodłączone. Użyj częstotliwości próbkowania 200 Hz i filtra dolnoprzepustowego ustawionego na 0.5 Hz.
    5. Podłącz zwierzę do trzymających głowę zwierzęcia między dwoma rozciągniętymi palcami jednej ręki i przykręcając złącza do cokołu elektrody drugą wolną ręką. Rozpocznij pobieranie.
      ostrożność: Upewnij się, że sygnał jest wolny od artefaktów. Typowymi artefaktami są kolce znacznie przekraczające skalę.
    6. Dzień przed eksperymentem mikrodializy przenieś zwierzęta do systemu EEG na uwięzi wyposażonego w cylindry z pleksiglasu do mikrodializy. Odłącz zwierzęta od systemu uwięzi EEG w domowej klatce, przykręcając łączniki od elektrody bez krępowania zwierzęcia. Umieść zwierzę w wysokich cylindrach z pleksi.
  2. Monitorowanie zachowania chorego na padaczkę na dzień przed i w trakcie sesji mikrodializy
    1. Włącz amplifier umieszczony na zewnątrz klatki Faradaya. Otwórz oprogramowanie EEG. Rozpocznij akwizycję EEG, obserwując sygnał EEG wytwarzany przez niepodłączone.
    2. Podłącz zwierzę do systemu rejestracji EEG na uwięzi, trzymając głowę zwierzęcia między dwoma rozciągniętymi palcami jednej ręki i przykręcając łączniki do cokołu elektrody drugą wolną ręką. Ustaw współczynnik wzmocnienia (wzmocnienie) na każdym kanale wzmacniacza zgodnie z sygnałem elektrody pojedynczego zwierzęcia, tak aby sygnał EEG był w skali. Pozwól zwierzęciu eksplorować nową klatkę (cylinder) przez co najmniej 1 godzinę pod bezpośrednią obserwacją badacza.
    3. UWAGA: 24 godziny przed eksperymentem mikrodializy szczury są krótko znieczulane izofluranem w celu zamiany kaniul prowadzących na sondę do mikrodializy. Wykorzystaj moment, w którym są znieczulane, aby podłączyć je do systemu rejestracji EEG.
    4. Skróć lub przedłuż zwisający w zależności od towaru zwierzęcia. Upewnij się, że nie przeszkadzają w ruchach zwierzęcia i pozycji leżącej.
    5. Sprawdź, czy kamery wideo są prawidłowo kadrowane w celu uzyskania efektu kadrowania. Rozpocznij zapis wideo-EEG.
  3. Identyfikacja napadów padaczkowych i aktywności EEG
    1. Użyj odtwarzacza programowego, aby oglądać filmy. Przewiń film 8 razy szybciej niż podczas odtwarzania w czasie rzeczywistym i zindywidualizuj uogólnione napady (patrz zwierzę do tyłu z klonusem kończyn przednich lub zwierzę podnoszeniem i upadkiem z klonusem kończyn przednich). Zwolnij film i zanotuj dokładny czas rozpoczęcia i zakończenia napadu behawioralnego.
    2. Przetwarzaj dane, zliczając liczbę uogólnionych napadów zaobserwowanych w ciągu 24 godzin nagrań wideo i wyraź je pod względem częstotliwości i czasu trwania napadów jako średnie wartości wszystkich napadów zaobserwowanych w ciągu 24 godzin.
    3. Zdefiniuj napady EEG jako okresy napadowej aktywności o wysokiej częstotliwości (>5 Hz) charakteryzujące się >3-krotnym przyrostem amplitudy w stosunku do wartości wyjściowej z progresją częstotliwości skoku, która trwa co najmniej 3 s2,44 lub podobny28. Użyj oprogramowania EEG do przetworzenia surowych zapisów EEG. Podziel ślady EEG na frakcje 1 godziny. Skopiuj frakcje śledzące EEG do pliku w celu automatycznej analizy spajków oprogramowania.
    4. Analizuj dane dotyczące aktywności EEG za pomocą oprogramowania EEG i predefiniowanych parametrów (4.3.3.). Przeprowadź wszystkie analizy wideo u dwóch niezależnych badaczy, którzy są niewidomi dla grupy analizowanych zwierząt. W przypadku rozbieżności poproś ich o ponowne przeanalizowanie danych, aby osiągnąć konsensus45.

5. Mikrodializa

  1. Odzyskiwanie sondy in vitro
    1. Przygotuj sondę do pierwszego użycia zgodnie z instrukcjami producenta, dotykając jej w pokrowcu ochronnym.
    2. Przeprowadź eksperyment w trzech egzemplarzach: przygotuj trzy probówki o pojemności 1,5 ml, ładując je 1 ml roztworu Ringera zawierającego mieszaninę wzorców (2,5 μM glutaminianu i 2,5 μM asparaginianu). Umieścić trzy załadowane probówki o pojemności 1,5 ml do podgrzewacza bloku ustawionego na 37 °C i umieścić je na mieszadle.
      nuta: Do kalibracji chromatograficznych należy używać tych samych roztworów wzorcowych.
    3. Uszczelnij probówki o pojemności 1,5 ml folią parafinową i nakłuj je ostrym pęsetą, aby zrobić otwór o średnicy około 1 mm.
    4. Weź sondę i włóż ją do otworu wykonanego w folii parafinowej. Zanurz membranę co najmniej 2 mm poniżej poziomu roztworu. Dalej przymocuj sondę do probówki o pojemności 1.5 ml za pomocą folii parafinowej.
      ostrożność: Upewnij się, że końcówka nie dotyka ścianek probówki o pojemności 1.5 ml.
    5. Podłączyć wlot sondy do strzykawki zamontowanej na pompie infuzyjnej za pomocą wężyka FEP i adapterów przewodów. Opcjonalnie do połączeń należy użyć rurek polietylenowych o drobnych otworach o średnicy wewnętrznej 0,28 mm i średnicy zewnętrznej 0,61 mm oraz kolorowych adapterów rurek (czerwone i niebieskie adaptery przewodów).
    6. Uruchom pompę z prędkością 2 μl/min i pozwól, aby płyn pojawił się na końcówce wylotowej. Podłącz wylot sondy do probówki zbiorczej o pojemności 0.2 ml za pomocą rurki FEP i adapterów przewodów.
      nuta: Do wszystkich połączeń należy używać węży FEP. Przytnij żądaną długość rurki za pomocą żyletki. Użyj adapterów rurek w innym kolorze do wlotu i wylotu sondy. Pozwól pompie pracować przez 60 minut. Sprawdź, czy nie ma wycieków i pęcherzyków powietrza. Nie powinny one być obecne.
    7. Ustaw pompę na natężenie przepływu 2 μl/min i zacznij pobierać próbki po stronie wylotowej rurki.
    8. Zebrać trzy 30-minutowe próbki perfuzatu i trzy równe objętości próbki roztworu w probówce o pojemności 1,5 ml. Pobieraj próbki o równej objętości z probówki o pojemności 1,5 ml co 30 minut za pomocą mikrostrzykawki zanurzonej w roztworze wzorcowym w probówce o pojemności 1,5 ml.
    9. Powtórzyć doświadczenie (5.1.1-5.1.8), ustawiając pompę na natężenie przepływu 3 μl/min (5.1.7), aby uzyskać porównanie odzysku sondy przy użyciu dwóch różnych prędkości przepływu perfuzyjnego.
    10. Po zakończeniu zatrzymaj pompę i przepłucz rurkę wodą destylowaną, 70% etanolem i wepchnij do niej powietrze. Sondę należy przechowywać w fiolce wypełnionej czystą wodą destylowaną. Dokładnie wypłucz sondę, przetapiając ją w ilości 2 μl/min wodą destylowaną przed przechowywaniem.
    11. Przeanalizować stężenie glutaminianu i asparaginianu w próbkach metodą chromatograficzną (patrz szczegóły poniżej; 6.3).
    12. Oblicz odzysk, korzystając z następującego równania:
      Odzysk (%) = (perfuzat C / Croztwór dializowany) x 100.
  2. Sesje mikrodializy u swobodnie poruszających się szczurów
    1. Procedury przygotowawcze: wprowadzenie i testowanie sondy, ustawienie i uruchomienie pompy infuzyjnej
      1. Przygotuj sondy do mikrodializy do pierwszego użycia zgodnie z instrukcją obsługi producenta i napełnij je roztworem Ringera. Wytnij kawałki rurki FEP o długości około 10 cm i podłącz je do kaniul wlotowych i wylotowych sondy za pomocą adapterów rurek w różnych kolorach.
      2. Upewnij się, że rurka styka się z adapterami bez martwych przestrzeni we wszystkich połączeniach.
      3. 5.2.1.3. Na 24 godziny przed eksperymentem mikrodializy znieczulić zwierzę na krótko izofluranem (5% w powietrzu) w komorze indukcyjnej do momentu leżenia. Wyjmij atrapę kaniuli z prowadnicy za pomocą pęsety i mocno przytrzymując głowę zwierzęcia. Włóż sondę do mikrodializy, wyposażoną w membranę dializującą, do kaniuli prowadzącej i dalej dokręć kaniule do mikrodializy wprowadzone do ich prowadnicy za pomocą plasteliny.
        ostrożność: Nie pozwól, aby sonda dotykała ścianek ochronnej tulei sondy podczas wyjmowania.
      4. Włóż zwierzę do cylindra z pleksi i pozwól mu odkrywać nową atmosferę. Podłączyć zwierzę do systemu rejestracji EEG na uwięzi, jak opisano powyżej (zgodnie z ppkt 4.2.2 i 4.2.3).
      5. Podążaj za obudzonymi i swobodnie poruszającymi się ruchami szczura i podłącz wlot sondy do strzykawki o pojemności 2,5 ml z igłą 22G zawierającą roztwór Ringera za pomocą adapterów rurek. Wepchnij roztwór Ringera do sondy, wyrzucając 1 ml roztworu Ringera w ciągu 10 sekund, naciskając w sposób ciągły tłok strzykawki o pojemności 2,5 ml. Sprawdź, czy na wylocie nie pojawiła się kropla płynu. Sonda jest teraz gotowa do użycia.
      6. Napełnij strzykawki o pojemności 2,5 ml podłączone do rurki FEP za pomocą adapterów przewodów roztworem Ringera i zamontuj je na pompie infuzyjnej. Uruchomić pompę z prędkością 2 μl/min. Pozwól mu działać przez noc.
        nuta: Użyj żądanej długości wszystkich przewodów FEP, ale oblicz martwą objętość rurki, aby wiedzieć, kiedy należy rozpocząć stymulację o wysokiej zawartości K+ i skorelować dane ilościowe ze zmianami neurochemicznymi w mózgu zwierzęcia. Użyj pęcherzyka powietrza utworzonego w rurce pod przepływem roboczym, aby obliczyć ten czas.
    2. Pobieranie próbek podczas zapisu EEG i stymulacji potasu
      1. Sprawdzić, czy w ciągu 3 godzin poprzedzających pobranie próbki nie wystąpiły napady padaczkowe (zapisy wideo-EEG) i kontynuować monitorowanie aktywności napadów podczas mikrodializy.
      2. Zatrzymać pompę przenoszącą kaniulowane strzykawki z rurką FEP wypełnione roztworem Ringera. Zamontuj na pompie kolejny zestaw strzykawek o pojemności 2,5 ml połączonych z rurką FEP z adapterami rurek wypełnionymi zmodyfikowanym roztworem Ringera zawierającym 100 mM roztwór K+.
      3. Uruchom pompę z prędkością 2 μl/min i pozwól jej pracować. W celu szybszego napełnienia rurki należy ustawić pompę na 5 μl/min na czas napełniania. Sprawdź, czy w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. Upewnij się, że rurka styka się z adapterami bez martwych przestrzeni we wszystkich połączeniach.
      4. Zbadać sondę, jeśli jest gotowa do użycia u zwierząt, jak opisano powyżej (5.2.1.5).
        nuta: Jeśli z jakiegoś powodu sonda nie działa, wymień ją. W takich przypadkach należy przechowywać kilka przygotowanych sond do mikrodializy gotowych do użycia w pobliżu stacji roboczej mikrodializy EEG. Odłącz zwierzę od EEG i w razie potrzeby znieczulenie go na krótko izofluranem, aby zrealizować zmianę.
      5. Podłącz rurkę FEP strzykawek wypełnionych roztworem Ringera do kaniuli wlotowej sondy w każdym zwierzęciu i poczekaj na pojawienie się kropli płynu na końcówce wylotu.
      6. Podłącz wylot sondy do rurki FEP, co prowadzi do gromadzenia się w probówce. Włóż rurkę FEP do zamkniętej probówki o pojemności 0.2 ml z perforowaną nasadką. Upewnij się, że rurka pozostaje na swoim miejscu, mocując ją kawałkiem plasteliny.
      7. Kontynuować pracę pompy z prędkością 2 μl/min przez 60 minut bez pobierania próbek w celu zrównoważenia systemu (próbka zerowa).
      8. Zebrać 5 kolejnych 30-minutowych próbek dializatu (odpowiednio 60 μl) w warunkach wyjściowych (perfuzja z normalnym roztworem Ringera). Próbki należy przechowywać na lodzie.
      9. Obliczyć czas potrzebny na przejście cieczy z pompy do głowy zwierzęcia (zależy to od martwej objętości rurki, tj. czasu pęcherzyków powietrza) i w tym czasie przełączyć rurkę FEP, która przechodzi ze strzykawek zawierających normalny roztwór Ringera, na strzykawki zawierające zmodyfikowany (100 mM K+) roztwór Ringera w tym czasie bez zatrzymywania pompy. Sprawdź, czy w układzie nie ma pęcherzyków powietrza. Pozwól pompie pracować przez 10 minut
        ostrożność: W ciągu 10 minut stymulacji o wysokim poziomie K+ zwierzęta mają tendencję do gorączkowego poruszania się i zwykle prezentują dużą liczbę mokrych wstrząsów psich (zwierzęta z grupy kontrolnej i poza napadami) lub napadów behawioralnych (zwierzęta padaczkowe), więc bądź gotowy do interwencji, aby chronić rurki i przed skręcaniem.
      10. Po 10 minutach przełączyć rurkę ze strzykawek zawierających 100 mM K+ roztwór Ringera na normalny roztwór Ringera i pozwolić pompie pracować. Nie wyłączaj pompy podczas wymiany roztworu, aby na końcu rurki, która ma być podłączona w linii, znalazła się kropla płynu.
      11. Od momentu, w którym dialilat zawiera wysoką zawartość potasu, tj. po pobraniu piątego dialiatu po równowadze, frakcje dializatu należy pobierać co 10 minut (20 μL) przez 1 godzinę. Pobrać 3 dodatkowe próbki dializatu po 30 minutach i zatrzymać pompę. Próbki należy przechowywać na lodzie.
      12. Po zakończeniu doświadczenia próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy HPLC.
      13. Powtórz eksperyment mikrodializy przez 3 kolejne dni, z wyjątkiem grupy z ostrym (24 godziny) i pierwszym napadem, w której tylko jedna sesja mikrodializy ma miejsce 24 godziny po SE lub w ciągu 24 godzin po pierwszym spontanicznym napadzie (Ryc. 3).
      14. Po zakończeniu każdego eksperymentu należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania środka znieczulającego i usunąć mózg w celu sprawdzenia umieszczenia sondy i elektrody.
  3. Zabiegi po mikrodializie
    1. Wypłucz zużyte sondy do mikrodializy wodą destylowaną i przechowuj je w fiolce wypełnionej czystą wodą destylowaną do następnego użycia.
      nuta: Ponownie użyte membrany mogą mieć zwiększoną przepuszczalność; Sprawdź, czy sonda jest odzyskiwana przed jej ponownym użyciem.
    2. Przepłukać cały zestaw do mikrodializy (rurki, łączniki i strzykawki) wodą destylowaną, a następnie 70% etanolem. Zastąp etanol powietrzem i przechowuj zestaw w sterylnym środowisku.
    3. Podzielić próbki dializatu podstawowego na frakcje o objętości 20 μl i użyć tylko jednej frakcji o pojemności 20 μl do analizy stężenia podstawowego aminokwasów. Pozostałą objętość próbki przechowywać do dalszej analizy lub analizy potwierdzającej w temperaturze -80 °C.
    4. Napraw mózgi w 10% formalinie i zakonserwuj je poprzez zatapianie w parafinie1. Koronnie pokrój mózgi na plasterki i zabarwij je hematoksyliną i eozyną. Zbadaj mózgi pod kątem prawidłowego umieszczenia sondy i elektrody1,2.
      nuta: Utrwal mózgi w schłodzonym 2-metylobutanie i przechowuj je w temperaturze -80 °C. Użyj dowolnego innego sprawdzonego barwienia na skrawkach tkanki nerwowej, które pozwala na wizualizację sondy i przewodu elektrody.

6. Analiza chromatograficzna glutaminianu i asparaginianu

  1. Przygotowanie czynnika do derywatyzacji
    1. Wymieszać odpowiednie objętości odczynnika dialdehydu ortoftalowego (OPA) i 2-merkaptoetanolu (5-ME) w proporcji 20:1 (v/v) w fiolce. Zamknąć fiolkę za pomocą nakrętki i szczelnej przegrody międzypłytowej.
      ostrożność: Pracuj pod maską chemiczną.
    2. Przygotowany roztwór należy zwirować i umieścić w autosamplerze w pozycji do derywatyzacji.
  2. Przygotowanie próbek dializatu
    1. Umieścić szklaną wkładkę z dolną sprężyną do brązowej fiolki z automatycznym samplerem o pojemności 2 ml. Przygotować fiolki na wszystkie próbki mierzone w jednej partii.
    2. Pobrać 20 μl próbek do dializy z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić je do stopienia. Usunąć 1 μl roztworu i dodać 1 μl wzorca wewnętrznego (IS) L-homoseryny (50 μM) do 19 μl próbki, tak aby próbka zawierała 2,5 μM IS. Pobrać pipetę z 20 μl próbki dializacyjnej do szklanej wkładki w fiolce i zamknąć ją hermetyczną przegrodą.
    3. Umieścić fiolki zawierające próbki w automatycznym podajniku próbek za pomocą oprogramowania chromatograficznego w celu oznaczenia próbek w ich pozycjach.
  3. Analiza chromatograficzna próbek w celu oznaczenia stężenia glutaminianu i asparaginianu
    1. Przeprowadzić analizy w systemie chromatografu cieczowego z detekcją spektrofluorometryczną. Wykryć aminokwasy po 2-minutowej derywatyzacji przedkolumnowej za pomocą 20 μl dialdehydu ortoftalowego/5-merkaptoetanolu 20:1 (v/v) dodanego do 20 μl próbki.
    2. Przygotuj system do analizy aminokwasów. Włączyć automatyczny podajnik próbek, pompę, odgazowywacz, detektor i jednostkę sterującą wraz z komputerem.
    3. Zanurzyć syfony w butelkach zawierających fazę ruchomą i oczyścić kanały pompy chromatograficznej, która ma być użyta do analizy.
    4. Zacznij zwiększać przepływ fazy ruchomej, sprawdzając ciśnienie w kolumnie (np. zacznij od 0,2 ml/min i zwiększaj przepływ o dodatkowe 0,2 ml/min co 5 minut, aż do osiągnięcia przepływu roboczego). Pozwól systemowi pracować z przepływem roboczym 0,8 ml/min przez co najmniej 1 godzinę, aby zrównoważyć kolumnę.
      ostrożność: Niestabilne ciśnienie wskazuje na obecność powietrza w układzie. Ciśnienie nie powinno przekraczać 25 MPa.
    5. Ustaw wzmocnienie, wysoką czułość oraz długości fal wzbudzenia i emisji na detektorze odpowiednio na 345/455 nm. Zresetuj sygnał detektora (AUTOZERO).
    6. Korzystając z oprogramowania chromatograficznego, wyślij metodę do urządzenia. Teraz chromatograf powinien być gotowy do pomiaru.
    7. Oddzielić próbki dializatu, wzorcowe próbki dializatu wzbogaconego oraz wzorce (0,25 μM – 2,5 μM asparaginianu i glutaminianu w roztworze Ringera) na odpowiedniej kolumnie chromatograficznej. Skalibrować metodę chromatograficzną i ustalić granice wykrywalności i kwantyfikacji przed jakąkolwiek analizą próbek dializowanych.
    8. Aktywuj pojedynczą analizę lub utwórz sekwencję próbek do analizy za pomocą oprogramowania chromatograficznego i uruchom sekwencję.
      ostrożność: W sekwencji próbek dializatu należy przeprowadzić więcej niż jedną próbkę ślepą i różne próbki wzorcowe w celu kontroli dokładności metody.
    9. Po uzyskaniu chromatogramów należy je przeanalizować za pomocą oprogramowania chromatograficznego. Sprawdzić całkowanie interesujących pików na wykresie kalibracyjnym. Użyj wysokości piku lub obszaru piku do ilościowego określenia.
    10. Po zakończeniu zapisu próbki należy napełnić kolumnę i system rozpuszczalnikiem organicznym (np. 50% acetonitrylu w ultraczystej wodzie), aby zapobiec jego starzeniu się i rozwojowi pleśni.
    11. Zamknij system.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Odzyskiwanie sondy

Średnia wydajność odzysku (tj. średnia zawartość aminokwasów w perfuzacie wyrażona jako procent zawartości w równym objętości roztworze z fiolki) wynosiła 15,49 ± 0,42% przy szybkości przepływu 2 μL/min oraz 6,32 ± 0,64 przy 3 μL/min dla glutaminianu oraz 14,89 ± 0,36% przy szybkości przepływu 2 μL/min i 10,13 ± 0,51 przy 3 μL/min dla asparaginianu przy zastosowaniu sondy z membraną z kuprofanu. W przypa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tej pracy pokazujemy, w jaki sposób można przeprowadzić ciągły zapis wideo-EEG w połączeniu z mikrodializą w eksperymentalnym modelu TLE. Techniki zapisu wideo-EEG są wykorzystywane do prawidłowego diagnozowania różnych faz progresji choroby u zwierząt, a technika mikrodializy służy do opisania zmian w uwalnianiu glutaminianu, które zachodzą w czasie (nie stwierdzono żadnych zmian dla asparaginianu we wcześniej opublikowanym badaniu2). Zdecydowanie zalecamy użycie jednego urządzenia/implantu do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Annie Binaschi, Paolo Ronconowi i Eleonorze Palmie za ich wkład w powstanie manuskryptów opublikowanych w pierwszej kolejności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-kanałowa dwuskrętna elektrodaInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPC
Kaniula prowadzącaAgn Tho's, Lindigö, SzwecjaMAB 4.15.ICMateriał
Żywica KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, WłochyMateriał KK2
Żel Super Attack LoctiteHenkel Italia Srl, Mediolan, Włochy2047420_71941materiał
Imalgene-KetamineMerial, Tuluza, Francja221300288 (AIC)Solution
XylazineSigma, Milano, ItalyX1251Material
Isoflurane-VetMerial, Tuluza, Francja103120022 (AIC)Solution
Altadol 50 mg / ml - tramadolFormevet, Milano, Włochy103703017 (AIC)Solution
Gentalyn 0,1% crm - gentamycynaMSD Italia, Roma, Włochy20891077 (AIC)Materiał
simplex szybki cement dentystycznyKemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Wielka BrytaniaACR811Materiał
GlasIonomer CX-Plus CementShofu, Kioto, JaponiaPN1167
Uchwyt klipsa do sondyAgn Tho's, Lindigö, Szwecjap/n 100 5001Wyposażenie
Histoacryl® Niebieski miejscowy klej do skóryTissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FPMateriał
Valium 10 mg/2 ml - diazepamRoche, Monza, Włochy019995063 (AIC)Materiał
1 ml strzykawka z igłą 25GVetrotecnica, Padwa, Włochy11.3500.05Materiał
elastyczna igła do karmienia szczura 17GAgn Tho's, Lindigö Szwecja7206Materiał
Aparatura do technologii trawyGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Kalifornia, USAM665G08Sprzęt (wzmacniacz AS40, skrzynka główna, połączeniowe, telefaktor model RPSA S40)
modułowa akwizycja danych i  system analityczny MP150Biopac, Goleta, Kalifornia, USAMP150WSWSprzęt
cyfrowy system nadzoru wizyjnegoAverMedia Technologies, Fremont, Kalifornia, USAV4.7.0041FDSprzęt
do mikrodializyAgn Tho's, Lindigö SzwecjaMAB 4.15.1.CuMateriałowa
sonda do mikrodializySynaptech, Colorado Springs, Kolorado, USAS-8010Materiałowy
grzejnikblokowy Grant Instruments, Cambridge, AngliaQBD2Mieszadło sprzętowe
Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Włochy711Sprzęt
pompy infuzyjnejUniventor, Zejtun, Malta864sprzęt
polietylenowe o drobnym otworzeSmiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA800/100/100/100Materiał
niebieskie adaptery ruroweAgn Tho's, Lindigö Szwecja1002Materiał
czerwone adaptery rurAgn Tho's, Lindigö Szwecja1003Materiał
2,5 ml strzykawka z igłą 22GChemil, Padwa, WłochyS02G22Materiał
nasadka na fiolkęCronus, Labicom, Ołomuniec, CzechyVCA-1004TB-100Materiał
przegrodyThermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USANational C4013-60 Przegroda 8 mm TEF/SIL Materiał
szklany wkład z dolną sprężynąSupelco, Sigma, Mediolan, Włochy27400-U
Fiolka z autosampleremNational Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, WłochyC4013-2Materiał
Sterownik systemu i jednostka odgazowująca Smartline manager 5000Knauer, Berlin, NiemcyWyposażenie V7602Pompa
o nachyleniu czwartorzędowym Smartline 1000Knauer, Berlin, NiemcyWyposażenie
V7603detektor spektrofluorometrycznyShimadzu, Kioto, JaponiaRF-551Sprzęt
Kolumna chromatograficznaKnauer, Berlin, Niemcy25EK181EBJMateriał
chromatogrficzna kolumna wstępnaKnauer, Berlin, NiemcyP5DK181EBJMateriał:
roztwór fazy ruchomej A0,1 M bufor fosforanu sodu, pH 6,0Roztwór
fazy ruchomej, roztwór B40% 0,1 M bufor fosforanu sodu, 30% metanol, 30% acetonitryl, pH 6,5Roztwór
Skład roztworu Ringeraw mM: MgCl2 0,85, KCl 2,7, NaCl 148, CaCl2 1,2, 0,3% BSAZmodyfikowany roztwór
Ringeraw mM: MgCl2 0,85, KCl 100, NaCl 50,7, CaCl2 1,2, 0,3% BSARoztwór
0,9% NaCl, ph dostosowane do 7,0Roztwór
sacharozy10% sacharozy w wodzieRoztwór
po materiałach materiału rurki materiału Skład roztworu soli fizjologicznej destylowanej

Bibliografia

  1. Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  2. Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
  3. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  4. Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
  5. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  6. Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
  7. Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
  8. Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
  9. Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
  10. Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82(2013).
  11. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
  12. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528(2012).
  13. Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
  14. Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
  15. Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
  16. Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
  17. Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
  18. Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
  19. Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
  20. Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
  21. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  22. Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
  23. Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
  24. Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
  25. Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
  26. Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
  27. Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
  28. Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
  29. Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
  30. Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
  31. Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
  32. Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
  33. Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
  34. Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
  35. Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
  36. Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
  37. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
  38. Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
  39. Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
  40. Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
  41. Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
  42. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
  43. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  44. Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
  45. Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
  46. Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845(2017).
  47. Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
  48. Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
  49. Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
  50. Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
  51. Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
  52. Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
  53. Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
  54. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  55. Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
  56. Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
  57. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  58. Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
  59. Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
  60. Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
  61. Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
  62. Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
  63. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
  64. Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
  65. Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
  66. Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
  67. Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239(2017).
  68. Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
  69. Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
  70. Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
  71. Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrodializa EEGmikrodializa in vivowideorejestracja EEGwysokosprawna chromatografia cieczowachirurgia stereotaktycznapodstawowa stymulacja potasemEEG z elektrodami g binowymianaliza glutaminianu i aspartanianu
Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.