Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego

Podsumowanie

Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.

Streszczenie

W kandydozie jamy ustnej i gardła, członkowie rodzaju Candida muszą przylegać i rosnąć na powierzchni błony śluzowej jamy ustnej pod wpływem przepływu śliny. Chociaż opracowano modele wzrostu w przepływie, wiele z tych systemów jest drogich lub nie pozwala na obrazowanie, gdy komórki są w przepływie. Opracowaliśmy nowatorską aparaturę, która pozwala nam obrazować wzrost i rozwój komórek Candida albicans w przepływie i w czasie rzeczywistym. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół montażu i użytkowania tego urządzenia przepływowego, a także kwantyfikację generowanych danych. Jesteśmy w stanie określić ilościowo szybkość, w jakiej komórki przyczepiają się do zjeżdżalni i odłączają się od niej, a także określić miarę biomasy na zjeżdżalni w czasie. System ten jest zarówno ekonomiczny, jak i wszechstronny, współpracuje z wieloma typami mikroskopów świetlnych, w tym niedrogimi mikroskopami stacjonarnymi, i jest w stanie wydłużyć czas obrazowania w porównaniu z innymi systemami przepływowymi. Ogólnie rzecz biorąc, jest to system o niskiej przepustowości, który może dostarczać bardzo szczegółowych informacji w czasie rzeczywistym na temat wzrostu biofilmu gatunków grzybów pod przepływem.

Wprowadzenie

Candida albicans (C. albicans) to oportunistyczny patogen grzybiczy człowieka, który może infekować wiele typów tkanek, w tym powierzchnie błony śluzowej jamy ustnej, powodując kandydozę jamy ustnej i gardła i powodując niższą jakość życia osób dotkniętych chorobą¹. Tworzenie biofilmu jest ważną cechą patogenezy C. albicans, a liczne badania przeprowadzono nad powstawaniem i funkcją biofilmów C. albicans^2,3,4,5, z których wiele przeprowadzono przy użyciu statycznych (bez przepływu) modeli in vitro. Jednak C. albicans musi przylegać i rosnąć w obecności przepływu śliny w jamie ustnej. Opracowano liczne systemy przepływowe, aby umożliwić obrazowanie żywych komórek^6,7,8,9,10. Te różne systemy przepływu zostały zaprojektowane do różnych celów, dlatego każdy system ma inne mocne i słabe strony. Odkryliśmy, że wiele systemów przepływu odpowiednich dla C. albicans było kosztownych, wymagało skomplikowanych części prefabrykowanych lub nie można było ich zobrazować podczas przepływu i trzeba było je zatrzymać przed obrazowaniem. W związku z tym opracowaliśmy nowatorski aparat przepływowy do badania tworzenia się biofilmu C. albicans pod flow¹¹. Podczas projektowania naszego aparatu przepływowego kierowaliśmy się tymi głównymi względami. Po pierwsze, chcieliśmy być w stanie określić ilościowo wiele aspektów wzrostu i rozwoju biofilmu w czasie rzeczywistym bez konieczności stosowania komórek fluorescencyjnych (co pozwoliłoby nam łatwo badać zmutowane szczepy i niezmodyfikowane izolaty kliniczne). Po drugie, chcieliśmy, aby wszystkie części były dostępne na rynku z niewielkimi lub żadnymi modyfikacjami (tj. bez niestandardowej produkcji), co pozwoliłoby innym na łatwiejsze odtworzenie naszego systemu i umożliwiłoby łatwe naprawy. Po trzecie, chcieliśmy również umożliwić wydłużenie czasu obrazowania przy rozsądnie wysokich natężeniach przepływu. Wreszcie, chcieliśmy, po okresie przyczepiania się komórek do podłoża pod przepływem, móc monitorować wzrost biofilmu przez dłuższy czas bez wprowadzania nowych komórek.

Te rozważania doprowadziły nas do opracowania dwukolbowego systemu przepływu recyrkulacyjnego, zilustrowanego w Rysunek 1. Dwie kolby pozwalają nam podzielić eksperyment na dwie fazy, fazę przyłączania, która czerpie z kolby przyłączeniowej z nasionami komórek, oraz fazę wzrostu, która wykorzystuje pożywki bezkomórkowe do kontynuowania wzrostu biofilmu bez dodawania nowych komórek. System ten jest przeznaczony do pracy z komorą inkubacyjną dla mikroskopu, z szkiełkiem podstawowym i poprzedzającym go wężem (od 2 do 5), Rysunek 1) umieszczonym wewnątrz inkubatora, a wszystkie inne elementy umieszczone w dużym pojemniku wtórnym na zewnątrz mikroskopu. Dodatkowo mieszadło z płytą grzejną z dołączoną sondą temperatury służy do utrzymywania komórek grzybów w kolbie nasadki w temperaturze 37 °C. Ponieważ jest to recyrkulacja, system ten jest zdolny do ciągłego obrazowania podczas przepływu (może trwać ponad 36 godzin w zależności od warunków) i może być używany w większości standardowych mikroskopów, w tym w pionowych lub odwróconych mikroskopach stołowych. W tym miejscu omawiamy montaż, obsługę i czyszczenie aparatury przepływowej, a także przedstawiamy podstawowe algorytmy ilościowe ImageJ do analizy filmów po eksperymencie.

Protokół

1. Montaż aparatu przepływowego

1. Skonfiguruj części wymienione w Tabeli materiałów zgodnie ze schematem w Rysunek 1 z uwzględnieniem poniżej.
   UWAGA: Dla wygody aparat przepływowy jest podzielony na dwie strony, stronę zieloną (wszystko przed szkiełkiem do kolb z pożywką) i stronę pomarańczową (wszystko za szkiełkiem do kolb z pożywką).
   1. Upewnij się, że wszystkie aparaty przepływowe są szczelne, aby zapobiec wyciekom, z jedynym wyjątkiem kolb z mediami (Rysunek 1, 1). Aby to osiągnąć, przed montażem należy nałożyć taśmę hydrauliczną na dowolny gwint męski, z wyjątkiem tłumika pulsacji (PD) i butelki filtrującej 2 μm (FB), które nie wymagają taśmy hydraulicznej, ponieważ gumowe uszczelki zapewniają ich szczelność.
   2. Założyć zaciski na ucho clamps na każdej złączce kolczastej, która jest pod nadciśnieniem podczas normalnej pracy (tj. za pompą).
   3. Użyj kolorowych taśm laboratoryjnych, aby oznaczyć lokalizacje zaworów literą A lub G (odpowiednio dla mocowania i wzrostu), lokalizację pompy, lokalizacje połączeń suwakowych i przyłącze filtra 0,2 μm.
   4. Określ długość przewodów, które mają być użyte, w oparciu o odległość między systemem przepływu a mikroskopem, pamiętając, że wszystkie urządzenia przepływowe za pompą do kolb (większość pomarańczowej strony) powinny znajdować się we wtórnym zbiorniku. Dodać około 1 m dodatkowej rurki przed szkiełkiem (i najlepiej pułapką bąbelkową), aby umieścić je w komorze inkubacyjnej mikroskopu, ponieważ gwarantuje to, że wszystkie media docierające do szkiełka będą miały odpowiednią temperaturę.
   5. Pułapkę bąbelkową należy umieścić jak najbliżej szkiełka, najlepiej w komorze inkubacyjnej podczas eksperymentu (pęcherzyki często tworzą się wzdłuż ścianki rurki); należy jednak pamiętać, że aby działała, musi być podłączona do próżni.
   6. Upewnij się, że rurka między FB a jednorazowym filtrem 0.2 μm ma około 0.5 m długości.
   7. Dodać mieszadło magnetyczne o średnicy około 2 cm do każdej kolby z podłożem.
   8. Zaopatrz się w jakąś formę zacisków rurowych, które będą działać jako zawory odcinające (można użyć hemostatów).
   9. Aby ułatwić użytkowanie, przechowuj aparat przepływowy w koszu, który można sterylizować w autoklawie. Pomocne może być posiadanie drugiego mniejszego kosza w większym, aby umożliwić łatwe oddzielenie zielonej strony od pomarańczowej.
   10. W przypadku kolby mocującej za pomocą wiertła 4 mm wywierć dodatkowy otwór w gumowym korku, aby pomieścić sondę termiczną (należy uważać, aby nie przejść przez kolejny otwór). Aby przeprowadzić rurkę przez porty, przepchnij rurkę pęsetą; Po przejściu zaciśnij rurkę, aby utrzymać ją na miejscu, a następnie wyciągnij pęsetę z powrotem.
       UWAGA: Jeśli nie jest możliwe dodanie dodatkowego otworu do gumowego korka, zamiast kolby i gumowego korka może działać butelka z szerokim otworem z czteroportową nakrętką.
2. Po całkowitym zmontowaniu systemu przepływu zamknij zawory zarówno zielonych, jak i pomarańczowych bocznych kolb wzrostu. Użyj wody z rurką kolby mocującej i cylindrem z podziałką, aby skalibrować pompę perystaltyczną zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Przeprowadź eksperyment

1. Dzień przed eksperymentem należy rozpocząć wstępne podgrzewanie komory inkubacyjnej mikroskopu do temperatury 37 °C i przygotować na noc hodowlę szczepu grzyba (fluorescencja nie jest wymagana).
2. Zebrać jednorazowe komponenty i pompę, a następnie umieścić w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Wyjmij pułapkę bąbelkową i sondę temperatury z aparatu przepływowego i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
4. W razie potrzeby rozczesz i uporządkuj rurkę.
5. Aparat przepływowy, w tym mieszadła, należy sterylizować w autoklawie przez 30 minut, aby zapewnić sterylność; po zakończeniu przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego.
6. Podłącz pułapkę bąbelkową, sondę temperatury i wszystkie elementy jednorazowego użytku (z wyjątkiem szkiełka), jak pokazano na Rysunek 1.
   1. W przypadku filtra 0,2 μm (Rysunek 1, 11) wyjmij tłok ze strzykawki o pojemności 1 ml, aby uczynić go "adapterem". Wciśnij rurkę z FB do tego końca i przymocuj filtr 0,2 μm do rurki prowadzącej do kolby wzrostowej.
   2. Nałóż silikonowy smar próżniowy wokół zadzioru adaptera suwakowego (uważaj, aby smar nie dostał się do środka) przed jego podłączeniem, ponieważ pomaga to zapobiec wyciekom powietrza do systemu.
7. Napełnić kolbę mocującą 100 ml 1% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 2% (w/v) peptonu i 2% (w/v) glukozy (YPD) i napełnić kolbę wzrostową 200 ml YPD. Upewnij się, że rurka po zielonej stronie dociera do podłoża w każdej kolbie.
8. Upewnij się, że wszystkie zawory są otwarte. Podłącz pułapkę bąbelkową do próżni i podłącz pompę do zielonej rurki bocznej za pułapką bąbelkową.
9. Pompuj płyn z natężeniem przepływu 3,3 ml/min, aby całkowicie wypełnić zieloną stronę, a następnie dozuj i wyrzuć około 1–2 ml pożywki, ponieważ pierwsze kilka mililitrów często zawiera martwe komórki lub przypadkowe zanieczyszczenia. Przed kontynuowaniem upewnij się, że zielona strona rurki jest wypełniona mediami i nie ma pęcherzyków powietrza za pułapką bąbelkową.
10. Napełnij zjeżdżalnię kanałową i zbiornik YPD, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków.
11. Podłącz szkiełko do aparatu przepływowego i pompuj więcej płynu, aby utworzyć bufor o długości około 0,5 m po stronie pomarańczowej. Ma to na celu zapobieżenie przypadkowemu uwięzieniu powietrza w zjeżdżalni w przypadku przepływu wstecznego.
12. Przygotować aparat przepływowy do transportu do mikroskopu: Clamp zamknął wlot i wylot pułapki pęcherzykowej, a następnie zacisnął zawory kolby z zieloną i pomarańczową mocą boczną. Upewnij się, że nakrętki PD i FB są szczelne, ponieważ mogą się poluzować podczas autoklawowania.
13. Odłącz pompę od rurki, aby ułatwić transport. Następnie przenieś wszystkie elementy, w tym mieszadło z płytą grzejną, do dodatkowego pojemnika w pobliżu mikroskopu.
14. Przygotować aparaturę przepływową do obrazowania.
    1. Podłączyć sondę temperatury do mieszadła z płytą grzejną i rozpocząć podgrzewanie kolby nasadki do 37 °C. Wymieszać pożywkę z prędkością 300 obr./min i utrzymywać to przez cały eksperyment.
    2. Zamontuj szkiełko na mikroskopie i w razie potrzeby użyj taśmy, aby je szczelnie zabezpieczyć.
    3. Przymocuj pułapkę bąbelkową do odkurzacza (nie odkręcaj jeszcze zacisku).
    4. Podłączyć pompę do aparatu przepływowego w miejscu wskazanym na Rysunek 1.
    5. Uruchom pompę przy natężeniu przepływu 3,3 ml/min, pozwól jej pracować przez około 5–10 sekund, a następnie wyjmij zacisk wlotowy/wylotowy pułapki bąbelkowej.
    6. Pozwól pompie kontynuować pracę, podczas gdy kolba nasadkowa nagrzewa się. Gdy media zaczną krążyć w całym układzie przepływowym, sprawdź, czy działa normalnie.
       1. Sprawdź złączki pod kątem wycieków powietrza przed pompą (normalne jest tworzenie się pęcherzyków powietrza) lub wycieku płynu za pompą.
       2. Sprawdź, czy kolba pożywki wzrostowej, PD i FB kapią z rurki wlotowej (jeśli nie, może to wskazywać na zatkany filtr lub zbyt mocno dokręcone ucho clamp).
       3. Za pomocą mikroskopu sprawdź, czy na szkiełku kanałowym nie ma przyczepionych lub toczących się komórek. Nadmierna liczba ogniw może wskazywać na zanieczyszczenie podczas ustawiania lub na konieczność wymiany membrany z politetrafluoroetylenu (PTFE) pułapki pęcherzykowej.
15. Gdy kolba przyłączająca i komora inkubacyjna osiągną temperaturę 37 °C, dodać do kolby przyłączeniowej wystarczającą ilość nocnych hodowli komórek grzyba, aby osiągnąć 1 x 10⁶ komórek/ml.
    UWAGA: Objętość do dodania w μL można obliczyć za pomocą tego wzoru:
    
16. Odczekaj 15 minut, aby komórki mogły się zaaklimatyzować.
17. Otwórz zarówno zielone, jak i pomarańczowe zawory kolby bocznej, jednocześnie zamykając oba zawory kolby wzrostu, aby rozpocząć przepływ komórek.
18. Odczekaj około 5 minut, aby komórki mogły dotrzeć do szkiełka i umożliwić wstępne ustawienie ostrości mikroskopu (czas ten może wymagać dostosowania w zależności od długości rurki po zielonej stronie). W tym czasie należy dostosować mikroskop do tych samych parametrów obrazowania, które były używane w poprzednich eksperymentach. Jeśli jest to pierwszy przebieg, wykonaj następujące kroki:
    1. Przełącz się na obiektyw powietrzny o małym powiększeniu.
    2. Znajdź dołączoną komórkę lub małą pączkującą komórkę i skup się na niej.
    3. Skonfiguruj kondensator do oświetlenia Köhlera, a następnie przełącz na ciemne pole.
    4. Ustaw czas naświetlania na 300 ms.
    5. Dostosuj intensywność oświetlenia, aż mała komórka będzie przyciemniona, ale wyraźnie widoczna na tle (stosunek sygnału do tła wynoszący około 7–8 dla pączkującej komórki potomnej jest rozsądną wartością). Zanotuj/zaznacz intensywność oświetlenia dla przyszłych eksperymentów.
    6. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby pobierało obraz co 2 minuty przez 2 godziny.
19. Rozpocznij akwizycję obrazu w fazie przywiązania. Sprawdź ponownie po około 5 i 10 minutach, aby upewnić się, że ostrość została utrzymana. Jeśli nie, spróbuj wyregulować ostrość natychmiast po uzyskaniu następnego obrazu.
20. Natychmiast po zakończeniu fazy dołączania zapisz plik, a następnie otwórz zarówno zielone, jak i pomarańczowe zawory kolby bocznej, zamykając jednocześnie oba zawory kolby nasadki. Uważaj, aby nie uderzyć w scenę, jeśli w komorze inkubacyjnej znajdują się jakiekolwiek zawory.
21. Odłącz sondę termometru od mieszadła płyty grzejnej.
22. Wyjąć kolbę nasadkową z mieszadła z płytą grzejną i umieścić kolbę wzrostową na swoim miejscu.
23. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby pobierało obraz co 15 minut przez 22 godziny i rozpocznij akwizycję obrazu w fazie wzrostu. Ponowne ustawianie ostrości nie powinno być konieczne, ale zdecydowanie zaleca się sprawdzenie aparatu przepływowego po kilku godzinach.
    1. Sprawdź, czy złączki nie przeciekają powietrzem przed pompą (ponownie normalne jest tworzenie się pęcherzyków powietrza) lub czy płyn nie wycieka za pompą
    2. Sprawdź, czy kolba pożywki wzrostowej, PD i FB są kapiącymi pożywkami (jeśli nie, może to wskazywać na zatkany filtr, zbyt mocno dokręcone ucho clamp lub zatkanie w kolczastej złączce, jeśli używane komórki się kłaczą).
    3. Sprawdź poziom płynu w FB. Jeśli pożywka zbliża się do górnej części butelki (ponad 1,5 cm powyżej górnej części filtra), dokręć obie nakrętki (nie odkręcaj ich, ponieważ kolba jest pod ciśnieniem). Jeśli nie będą dalej dokręcane, kontynuuj eksperyment (choć może to spowodować wyciek) i wymień gumowe uszczelki w PD i FB po następnym czyszczeniu.
24. Po zakończeniu akwizycji fazy wzrostu zapisz plik, a następnie otwórz zawory kolby z zieloną i pomarańczową stroną, które mogą wydawać dźwięki, gdy ciśnienie spada po stronie pomarańczowej. Pociągnij do góry zieloną rurkę wychodzącą z obu kolb z pożywką, aż znajdą się co najmniej kilka centymetrów nad pożywką. Uruchom pompę z dużą prędkością (około 100 ml/min lub przytrzymaj przycisk szybkiego przewijania do przodu na pompie), aby usunąć wszystkie media z rurki, co znacznie ułatwia czyszczenie. Po opróżnieniu odłącz aparat przepływowy od pompy i wyjmij go z mikroskopu.

3. Wyczyść aparat przepływowy

1. Usuń wszystkie elementy, które nie nadają się do sterylizacji w autoklawie (elementy jednorazowego użytku, pułapka bąbelkowa i sonda temperatury) i sterylizuj w autoklawie aparat przepływowy przez 30 minut. Wyrzuć zużyte elementy jednorazowego użytku, wyczyść sondę 70% etanolem i odłóż pułapkę bąbelkową.
2. Po zakończeniu autoklawowania wyrzuć pożywkę, a następnie przepłucz i odłóż kolby na media. Następnie ponownie podłącz pułapkę bąbelkową, podłącz suwak kanałowy ibidi, który ma być używany do czyszczenia (wielokrotnego użytku) i podłącz system przepływu do pompy w miejscu pokazanym na Rysunek 1.
3. Zacisk zamknął zawór kolby bocznej pomarańczowej.
4. Umieścić około 200 ml nierozcieńczonego wybielacza w zlewce. Umieść gumowe korki w wybielaczu, a następnie uruchom pompę z dużą prędkością, aby rozprowadzić wybielacz w całym aparacie przepływowym (z wyjątkiem wszystkich filtrów). Po napełnieniu wybielaczem zatrzymaj pompę, ponieważ pozostawienie pompy włączonej na dużej prędkości może spowodować zużycie i uszkodzenie rurki.
5. Po wybielaniu przez 15 minut należy przytrzymać gumowe korki nad zlewką i ponownie uruchomić pompę, aby usunąć wybielacz z aparatu przepływowego.
6. Powtórz kroki 3.4 i 3.5 dwukrotnie z nadmiarem wody zamiast wybielacza, aby przepłukać system przepływowy. W tym czasie filtry należy czyścić tylko wodą, ponieważ inne środki czyszczące będą korodować lub zatykać filtry.
   1. Umieść rurkę, która normalnie łączy się z filtrem mediów filtracyjnych 0,2 μm (pochodzącą z FB 2 μm) w wodzie ze zlewki za pomocą gumowych korków z kroku 3.6.
   2. Odłącz rurkę podłączoną do wlotu filtra liniowego 20 μm, który zwykle można łatwo rozdzielić pomimo ucha clamp.
   3. Użyj termosu z filtrem próżniowym i długiego odcinka rurki przez zapasowy 3-otworowy korek, aby stworzyć system próżniowy, który można podłączyć do aparatu przepływowego.
   4. Podłącz ten system próżniowy do wlotu wlotu filtra 20 μm i uruchom podciśnienie; spowoduje to przeciągnięcie wody przez filtry w odwrotnym kierunku, usuwając martwe komórki.
   5. Przeciągnij co najmniej 200 ml wody przez filtry, a następnie wyjmij rurkę z wody, aby opróżnić przewody filtra z wody.
   6. Odłącz system próżniowy od filtra 20 μm i ponownie podłącz filtr do normalnego przewodu.

4. Kwantyfikacja filmów

UWAGA: Wszystkie pliki muszą być przekonwertowane do formatu TIF (tag image file), aby działały. Dodatkowo, aby porównać eksperymenty, ważne jest, aby wszystkie obrazy były wykonywane przy użyciu tego samego mikroskopu i parametrów obrazowania, jak omówiono powyżej.

1. Pobierz i zainstaluj ImageJ, jeśli nie jest jeszcze zainstalowany.
2. Pobierz uzupełniający plik makra i umieść go w folderze ImageJ\macros.
3. Dostosuj dostarczone makro:
   1. Otwórz stos obrazów z poprzedniego eksperymentu w ImageJ i wybierz punkt czasowy z obecnymi komórkami.
   2. Wybierz z menu za pomocą "Obraz | Rodzaj | 8-bitowy".
   3. Wybierz z menu za pomocą "Obraz | Dostosuj | Próg". Zaznacz pole "Ciemne tło". Ustaw menu rozwijane po prawej stronie na czerwone.
   4. Dostosuj dolną wartość, aż wszystkie komórki zostaną pokryte kolorem czerwonym z minimalnym nadmiarem szumu (niektóre plamki inne niż komórki są w porządku i zostaną przetworzone przez makro). Zanotuj tę niższą wartość.
   5. Zamknij zarówno okno Próg, jak i otwarty obraz.
   6. Wybierz z menu za pomocą "Wtyczki | Makra | Edycja". Po wyświetleniu monitu o otwarcie pliku: "przenieś o jeden poziom folderu w górę", a następnie wybierz folder makr i otwórz plik makra kwantyfikacji biofilmu przepływowego.
   7. Zmień wartość 15 we wszystkich wystąpieniach "setThreshold(15, 255); " do wartości określonej w kroku 4.3.4. Zapisz plik i zamknij to okno.
4. Wybierz z menu za pomocą "Wtyczki | Makra | Zainstaluj" i wybierz plik do oceny ilościowej biofilmu przepływowego.
5. Teraz w sekcji "Wtyczki | Makra", pojawia się sześć nowych opcji dla różnych kwantyfikacji wideo. Uruchom pełną analizę i wybierz pliki wideo załącznika i wzrostu, gdy pojawi się monit o wykonanie wszystkich dostępnych analiz na pozyskanych danych i automatyczne wygenerowanie plików wyjściowych.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy normalnego nocnego eksperymentu poklatkowego z użyciem dzikich komórek C. albicans w temperaturze 37 °C można zobaczyć w Rysunek 2A i Dodatkowe Wideo 1. Obrazy zostały wzmocnione kontrastem w celu poprawy widoczności. Przeprowadzono kwantyfikację oryginalnych danych, a reprezentatywne wykresy można zobaczyć w Rysunek 2B. Aby wygenerować te wykresy, dane zost...

Dyskusja

Wykorzystanie systemu przepływu, jak opisano powyżej, pozwala na generowanie ilościowych filmów poklatkowych przedstawiających wzrost i rozwój biofilmu grzybów. Aby umożliwić porównania między eksperymentami, niezwykle ważne jest zapewnienie, że parametry obrazowania są takie same. Obejmuje to upewnienie się, że mikroskop jest ustawiony na oświetlenie Köhlera dla każdego eksperymentu (wiele przewodników jest dostępnych online na temat tego procesu). Oprócz parametrów obrazowania, istnieje kilka ważnych kroków, o których ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pompa	Cole Parmer	07522-20	6
Głowica pompy	Cole Parmer	77200-60	6
Rurka	Cole Parmer	96410-14	N/A
Adapter pułapki bąbelkowej	Cole Parmer	30704-84	3
Adapter próżniowy pułapki bąbelkowej do 1/4" ID przewód próżniowy	Cole Parmer	31500-55	3
Adapter filtra liniowego (potrzebne 4)	Cole Parmer	31209-40	8,9
Pomarańczowa strona Y	Cole Parmer	31209-55	7
Zielona strona Y	ibidi	10827	2
* Prowadnice	ibidi	80196	4
* Suwak luers	ibidi	10802	4
Próżnia wspomagana pułapka bąbelkowa	Elveflow/Darwin mikrofluidyka	KBTLarge - Zestaw mikroprzepływowych pułapek bąbelkowych	3
Kolby na media	Corning	4980-500	1
0,2 i mikro; m filtr powietrza	Corning	431229	1
Gwintowana szklana butelka do PD i kolby filtra (potrzebne 2	Corning	1395-100	5,10
Portowa nakrętka do PD i kolby filtracyjnej (2 potrzebne)	Wheaton	1129750	5,10
Złączka z nakrętką	Wheaton	1129814	5,10
Złączka do węży z podkładką skośną	Danco	88579	5,10
Łącznik rurki podkładka płaska	Danco	88569	5,10
Zaciski do filtrów liniowych i za Y (7 potrzebnych)	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	15100002-100	7,8,9
Narzędzie do zacisków	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	14100386	N/A
20 μ m liniowy filtr mediów	Analityczne instrumenty naukowe	850-1331	8
10 μ m liniowy filtr mediów	Analityczne instrumenty naukowe	850-1333	9
2 μ m filtr mediów wlotowych	Supelco/Sigma-Aldrich	58267	10
* 0,22 i mikro; m filtr mediów	Millipore	SVGV010RS	11
* 0,22 i mikro; m filtr mediów » adapter"	BD Biosciences	329654	11
Korek gumowy	Fisher Scientific	14-131E	1
Mieszadło z płytą grzejną z zewnętrznym portem sondy	ThermoFisher Scientific	88880006	Nie dotyczy
Sonda temperatury	ThermoFisher Scientific	88880147	N/A