Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W kandydozie jamy ustnej i gardła, członkowie rodzaju Candida muszą przylegać i rosnąć na powierzchni błony śluzowej jamy ustnej pod wpływem przepływu śliny. Chociaż opracowano modele wzrostu w przepływie, wiele z tych systemów jest drogich lub nie pozwala na obrazowanie, gdy komórki są w przepływie. Opracowaliśmy nowatorską aparaturę, która pozwala nam obrazować wzrost i rozwój komórek Candida albicans w przepływie i w czasie rzeczywistym. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół montażu i użytkowania tego urządzenia przepływowego, a także kwantyfikację generowanych danych. Jesteśmy w stanie określić ilościowo szybkość, w jakiej komórki przyczepiają się do zjeżdżalni i odłączają się od niej, a także określić miarę biomasy na zjeżdżalni w czasie. System ten jest zarówno ekonomiczny, jak i wszechstronny, współpracuje z wieloma typami mikroskopów świetlnych, w tym niedrogimi mikroskopami stacjonarnymi, i jest w stanie wydłużyć czas obrazowania w porównaniu z innymi systemami przepływowymi. Ogólnie rzecz biorąc, jest to system o niskiej przepustowości, który może dostarczać bardzo szczegółowych informacji w czasie rzeczywistym na temat wzrostu biofilmu gatunków grzybów pod przepływem.
Wprowadzenie
Candida albicans (C. albicans) to oportunistyczny patogen grzybiczy człowieka, który może infekować wiele typów tkanek, w tym powierzchnie błony śluzowej jamy ustnej, powodując kandydozę jamy ustnej i gardła i powodując niższą jakość życia osób dotkniętych chorobą1. Tworzenie biofilmu jest ważną cechą patogenezy C. albicans, a liczne badania przeprowadzono nad powstawaniem i funkcją biofilmów C. albicans2,3,4,5, z których wiele przeprowadzono przy użyciu statycznych (bez przepływu) modeli in vitro. Jednak C. albicans musi przylegać i rosnąć w obecności przepływu śliny w jamie ustnej. Opracowano liczne systemy przepływowe, aby umożliwić obrazowanie żywych komórek6,7,8,9,10. Te różne systemy przepływu zostały zaprojektowane do różnych celów, dlatego każdy system ma inne mocne i słabe strony. Odkryliśmy, że wiele systemów przepływu odpowiednich dla C. albicans było kosztownych, wymagało skomplikowanych części prefabrykowanych lub nie można było ich zobrazować podczas przepływu i trzeba było je zatrzymać przed obrazowaniem. W związku z tym opracowaliśmy nowatorski aparat przepływowy do badania tworzenia się biofilmu C. albicans pod flow11. Podczas projektowania naszego aparatu przepływowego kierowaliśmy się tymi głównymi względami. Po pierwsze, chcieliśmy być w stanie określić ilościowo wiele aspektów wzrostu i rozwoju biofilmu w czasie rzeczywistym bez konieczności stosowania komórek fluorescencyjnych (co pozwoliłoby nam łatwo badać zmutowane szczepy i niezmodyfikowane izolaty kliniczne). Po drugie, chcieliśmy, aby wszystkie części były dostępne na rynku z niewielkimi lub żadnymi modyfikacjami (tj. bez niestandardowej produkcji), co pozwoliłoby innym na łatwiejsze odtworzenie naszego systemu i umożliwiłoby łatwe naprawy. Po trzecie, chcieliśmy również umożliwić wydłużenie czasu obrazowania przy rozsądnie wysokich natężeniach przepływu. Wreszcie, chcieliśmy, po okresie przyczepiania się komórek do podłoża pod przepływem, móc monitorować wzrost biofilmu przez dłuższy czas bez wprowadzania nowych komórek.
Te rozważania doprowadziły nas do opracowania dwukolbowego systemu przepływu recyrkulacyjnego, zilustrowanego w Rysunek 1. Dwie kolby pozwalają nam podzielić eksperyment na dwie fazy, fazę przyłączania, która czerpie z kolby przyłączeniowej z nasionami komórek, oraz fazę wzrostu, która wykorzystuje pożywki bezkomórkowe do kontynuowania wzrostu biofilmu bez dodawania nowych komórek. System ten jest przeznaczony do pracy z komorą inkubacyjną dla mikroskopu, z szkiełkiem podstawowym i poprzedzającym go wężem (od 2 do 5), Rysunek 1) umieszczonym wewnątrz inkubatora, a wszystkie inne elementy umieszczone w dużym pojemniku wtórnym na zewnątrz mikroskopu. Dodatkowo mieszadło z płytą grzejną z dołączoną sondą temperatury służy do utrzymywania komórek grzybów w kolbie nasadki w temperaturze 37 °C. Ponieważ jest to recyrkulacja, system ten jest zdolny do ciągłego obrazowania podczas przepływu (może trwać ponad 36 godzin w zależności od warunków) i może być używany w większości standardowych mikroskopów, w tym w pionowych lub odwróconych mikroskopach stołowych. W tym miejscu omawiamy montaż, obsługę i czyszczenie aparatury przepływowej, a także przedstawiamy podstawowe algorytmy ilościowe ImageJ do analizy filmów po eksperymencie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Złożenie aparatury przepływowej
- Skonfiguruj elementy wymienione w Tabeli materiałów zgodnie ze schematem na Rysunku 1, uwzględniając poniższe uwagi.
UWAGA: Dla ułatwienia aparatura przepływowa została podzielona na dwie strony: zieloną (wszystko przed szkiełkiem po stronie kolb z pożywką) oraz pomarańczową (wszystko za szkiełkiem po stronie kolb z pożywką).- Upewnij się, że cała aparatura przepływowa jest szczelna, aby zapobiec wyciekom, z jedynym wyjątkiem kolb z pożywką (Rysunek 1, 1). Aby to osiągnąć, owiń taśmą teflonową wszystkie gwinty zewnętrzne przed montażem, z wyjątkiem tłumika pulsacji (PD) oraz butelki z filtrem 2 µm (FB), które nie wymagają taśmy teflonowej, ponieważ uszczelki gumowe zapewniają im szczelność.
- Załóż obejmy zaciskowe na każde złączone przejście z karbem, które znajduje się pod dodatnim ciśnieniem podczas normalnej pracy (tj. za pompą).
- Użyj kolorowych taśm laboratoryjnych, aby oznaczyć lokalizację zaworów literami A lub G (odpowiednio dla etapu przywierania i wzrostu), lokalizację pompy, punkty podłączenia szkiełka oraz podłączenie filtra 0.2 µm.
- Wyznacz długość rurek w zależności od odległości między systemem przepływowym a mikroskopem, pamiętając, że cała aparatura przepływowa od pompy do kolb (większość strony pomarańczowej) powinna znajdować się w wtórnym pojemniku zabezpieczającym. Dodaj około 1 m dodatkowej rurki przed szkiełkiem (i najlepiej przed pułapką pęcherzykową), aby umieścić ją w komorze inkubacyjnej mikroskopu; zapewni to, że cała pożywka docierająca do szkiełka będzie miała odpowiednią temperaturę.
- Umieść pułapkę pęcherzykową tak blisko szkiełka, jak to możliwe, najlepiej wewnątrz komory inkubacyjnej podczas eksperymentu (pęcherzyki powietrza często tworzą się wzdłuż ścianek rurek); pamiętaj jednak, że do działania musi być ona podłączona do próżni.
- Upewnij się, że rurka między FB a jednorazowym filtrem 0.2 µm ma około 0.5 m długości.
- Do każdej kolby z pożywką dodaj magnetyczny mieszadło o długości około 2 cm.
- Przygotuj dowolne zaciski do rurek, które będą pełnić funkcję zaworów odcinających (można użyć kleszczyków hemostatycznych).
- Dla ułatwienia użytkowania przechowuj aparaturę przepływową w koszyku autoklawowalnym. Pomocne może być umieszczenie drugiego, mniejszego koszyka w większym, co pozwoli na łatwe oddzielenie strony zielonej od pomarańczowej.
- W kolbie do przywierania, używając wiertła 4 mm, wywierć dodatkowy otwór w gumowym korku, aby pomieścić sondę termiczną (uważaj, aby nie trafić w inny otwór). Aby przeprowadzić rurkę przez otwory, przesuń ją za pomocą pęsety; po przejściu zaciśnij rurkę, aby utrzymać ją na miejscu, a następnie wyjmij pęsetę.
UWAGA: Jeśli dodanie dodatkowego otworu w gumowym korku nie jest możliwe, zamiast kolby i korka gumowego można zastosować butelkę z szeroką szyjką i zakrętką z czterema portami.
- Po pełnym zmontowaniu systemu przepływowego zamknij zawory obu kolb wzrostowych strony zielonej i pomarańczowej. Użyj wody w rurkach kolby do przywierania oraz cylindra miarowego, aby skalibrować pompę perystaltyczną zgodnie z instrukcją producenta.
2. Przeprowadzenie eksperymentu
- Dzień przed eksperymentem należy rozpocząć wstępne podgrzewanie komory inkubacyjnej mikroskopu do 37 °Coraz przygotować nocną kulturę szczepu grzyba (fluorescencja nie jest wymagana).
- Przygotuj komponenty jednorazowego użytku oraz pompę, a następnie umieść je w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Wyjąć pułapkę pęcherzykową oraz sondę temperatury z aparatury przepływowej i umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- W razie potrzeby rozplątać i uporządkować przewody.
- Autoklawować aparat przepływowy wraz z mieszadełkami magnetycznymi przez 30 min w celu zapewnienia sterylności; po zakończeniu przenieść do komory bezpiecznej (kabiny biologicznej).
- Podłącz pułapkę pęcherzykową, sondę temperatury oraz wszystkie komponenty jednorazowe (z wyjąt preparatu), zgodnie z przedstawionym schematem w Rysunek 1.
- Dla 0.2 µm filtr (Rycina 1, 11), należy wyjąć tłok ze strzykawki 1 ml, aby służyła ona jako „adapter”. Wcisnąć rurkę z FB do tego końca i przymocować 0.2 µm filtr do rurki prowadzącej do kolby hodowlanej.
- Przed podłączeniem adaptera do szkiełka przedmiotowego należy nałożyć silikonowy smar próżniowy wokół króćca (należy uważać, aby smar nie dostał się do wnętrza), co pomaga zapobiegać wyciekom powietrza do układu.
- Napełnić kolbę z powierzchnią do przyкрепania 100 ml ekstraktu z drożdży 1% (m/v), peptonu 2% (m/v) i glukozy 2% (m/v) (YPD), a kolbę do hodowli napełnić 200 ml pożywki YPD. Upewnić się, że rurka po zielonej stronie sięga pożywki w każdej z kolb.
- Upewnij się, że wszystkie zawory są otwarte. Podłącz pułapkę pęcherzykową do pompy próżniowej, a pompę podłącz do zielonego przewodu znajdującego się za pułapką pęcherzykową.
- Przepompuj płyn z prędkością przepływu 3,3 ml/min, aby całkowicie wypełnić zieloną stronę, następnie pobierz i zutylizuj około 1–2 ml medium, ponieważ pierwsze kilka mililitrów często zawiera martwe komórki lub przypadkowe zanieczyszczenia. Przed kontynuowaniem upewnij się, że zielona strona rurki jest wypełniona medium i że za pułapką pęcherzyków powietrza nie ma pęcherzyków.
- Wypełnić slajd z kanałem oraz zbiornik pożywką YPD, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
- Podłącz preparat do aparatury przepływowej i pompuj dodatkową ciecz, aby stworzyć bufor o objętości około 0,5 ml po pomarańczowej stronie. Ma to na celu zapobieganie przypadkowemu uwięzieniu powietrza w preparacie w przypadku cofnięcia się przepływu.
- Przygotować układ przepływowy do transportu pod mikroskop: zakleszczować wlot i wylot pułapki pęcherzykowej oraz zakleszczować zawory bocznych kolb przyłącznych w kolorze zielonym i pomarańczowym. Upewnić się, że nakrętki śrubowe PD i FB są dokręcone, ponieważ mogą się poluzować podczas autoklawowania.
- Odłącz pompę od drenów, aby ułatwić transport. Następnie przenieś wszystkie elementy, w tym mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem, do pojemnika zewnętrznego w pobliżu mikroskopu.
- Przygotuj aparat przepływowy do obrazowania.
- Podłącz sondę temperatury do mieszadła z funkcją grzania i rozpocznij ogrzewanie kolby przystawki do 37 °CMieszać pożywkę z prędkością 300 obr./min i utrzymywać ten parametr przez cały czas trwania eksperymentu.
- Zamocuj preparat na mikroskopie, a w razie potrzeby użyj taśmy, aby go ściśle utrwalić.
- Podłącz pułapkę na pęcherzyki powietrza do pompy próżniowej (nie odkręcaj jeszcze zacisku).
- Podłącz pompę do aparatury przepływowej w miejscu wskazanym na Rycina 1.
- Uruchom pompę z przepływem 3,3 ml/min, pozwól jej pracować przez około 5–10 s, a następnie zdejmij zacisk z wlotu/wylotu pułapki na pęcherzyki powietrza.
- Pozostaw pompę włączoną podczas podgrzewania kolby dołączonej do układu. Po przepłukaniu całego systemu przepływowego pożywką sprawdź, czy urządzenie pracuje prawidłowo.
- Należy sprawdzić szczelność połączeń pod kątem wycieków powietrza przed pompą (powstawanie niektórych pęcherzyków jest zjawiskiem normalnym) oraz wycieków cieczy za pompą.
- Należy sprawdzić, czy z rurki wlotowej do kolby z pożywką wzrostową, PD oraz FB wycieka pożywka (brak wycieku może świadczyć o zapchaniu filtra lub zbyt mocno zaciśniętym zacisku typu ear clamp).
- Za pomocą mikroskopu należy sprawdzić, czy na płytce kanałowej znajdują się przytwierdzone lub toczące się komórki. Nadmierna liczba komórek może wskazywać na zanieczyszczenie podczas przygotowania układu lub na konieczność wymiany membrany z politetrafluoroetylenu (PTFE) w pułapce pęcherzyków powietrza.
- Gdy kolba do hodowli adherentnej oraz komora inkubacyjna osiągną odpowiednią temperaturę, 37 °Cdodaj do kolby z powierzchnią adhezyjną odpowiednią ilość hodowli komórek grzybowych z nocnego namnażania, aby osiągnąć stężenie 1 x 106 komórek/ml
UWAGA: Objętość do dodania do µL można obliczyć za pomocą następującego wzoru:
- Odczekać 15 min, aby umożliwić komórkom aklimatyzację.
- Otwórz oba zawory bocznych kolb przyłącznych (zielony i pomarańczowy), jednocześnie zamykając oba zawory kolb hodowlanych, aby rozpocząć przepływ komórek.
- Odczekać około 5 min, aby komórki dotarły do szkiełka, oraz przeprowadzić wstępne ustawienie ostrości mikroskopu (czas ten może wymagać korekty w zależności od długości zielonej rurki bocznej). W tym czasie należy ustawić parametry obrazowania mikroskopu identycznie jak w poprzednich eksperymentach. Jeśli jest to pierwsze uruchomienie, należy wykonać następujące kroki:
- Przełącz na obiektyw powietrzny o niskim powiększeniu.
- Znaleźć i ustawić ostrość na przytwierdzonej komórce lub małej komórce pączkującej.
- Skonfiguruj kondensator dla oświetlenia Köhlera, a następnie przełącz na ciemne pole.
- Ustaw czas ekspozycji na 300 ms.
- Dostosuj natężenie oświetlenia do momentu, aż mała komórka będzie słabo widoczna, lecz wyraźnie odróżnialna na tle (rozsądnym parametrem jest stosunek sygnału do tła wynoszący około 7–8 dla pączkującej komórki potomnej). Zanotuj/oznacz natężenie oświetlenia na potrzeby przyszłych eksperymentów.
- Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rejestrować obraz co 2 min przez 2 h.
- Rozpocznij akwizycję obrazów dla fazy przywierania. Sprawdź stan po około 5 i 10 minutach, aby upewnić się, że ostrość została zachowana. W przeciwnym razie spróbuj skorygować ustawienie ostrości natychmiast po zarejestrowaniu kolejnego obrazu.
- Niezwłocznie po zakończeniu fazy przylegania należy zapisać plik, a następnie otworzyć zawory kolb wzrostu bocznych (zarówno zielony, jak i pomarańczowy), jednocześnie zamykając oba zawory kolby do przylegania. Należy uważać, aby nie uderzyć w stolik, jeśli jakiekolwiek zawory znajdują się wewnątrz komory inkubacyjnej.
- Odłącz sondę termometru od mieszalnika z podgrzewaniem.
- Zdejmij kolbę z przyczepem z mieszadła magnetycznego z podgrzewaniem i w jej miejsce wstaw kolbę hodowlaną.
- Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby pozyskiwać obraz co 15 min przez 22 h, a następnie rozpocznij akwizycję obrazów dla fazy wzrostu. Ponowne ustawienie ostrości nie powinno być konieczne, jednak zdecydowanie zaleca się sprawdzenie aparatury przepływowej po kilku godzinach.
- Należy sprawdzić, czy złączy nie ma nieszczelności prowadzących do zasysania powietrza przed pompą (ponownie: niewielkie tworzenie się pęcherzyków jest zjawiskiem normalnym) lub wycieku cieczy za pompą.
- Należy sprawdzić, czy z kolby z pożywką wzrostową, PD oraz FB wycieka pożywka (w przeciwnym razie może to wskazywać na zapchany filtr, zbyt mocno zaciśniętą opaskę zaciskową lub zator w złączce kolczastej, jeżeli używane komórki ulegają flokulacji).
- Sprawdź poziom cieczy w FB. Jeśli pożywka zbliża się do górnej krawędzi butelki (znajduje się powyżej 1,5 cm nad górną częścią filtra), mocno dokręć obie nakrętki (nie poluzowuj ich, ponieważ kolba znajduje się pod ciśnieniem). Jeśli nakrętki nie można dokręcić mocniej, kontynuuj eksperyment (choć może to doprowadzić do wycieku), a po kolejnym czyszczeniu wymień uszczelki gumowe w PD i FB.
- Po zakończeniu akwizycji fazy wzrostu należy zapisać plik, a następnie otworzyć zawory bocznych kolb przyłączonych w kolorze zielonym i pomarańczowym; podczas uwalniania ciśnienia po stronie pomarańczowej może wystąpić hałas. Należy unieść rurki po stronie zielonej wychodzące z obu kolb z medium, tak aby znajdowały się co najmniej kilka centymetrów powyżej poziomu medium. Pompę należy uruchomić z wysoką prędkością (około 100 ml/min lub przytrzymując przycisk szybkiego przewijania na pompie), aby usunąć całe medium z rurek, co znacznie ułatwia czyszczenie. Po opróżnieniu należy odłączyć aparat przepływowy od pompy i wyjąć go z mikroskopu.
3. Czyszczenie aparatury przepływowej
- Usuń wszystkie komponenty niepodlegające autoklawowaniu (elementy jednorazowe, pułapkę powietrzną oraz sondę temperatury), a następnie autoklawuj aparat przepływowy przez 30 min. Wyrzuć zużyte komponenty jednorazowe, oczyść sondę 70% etanolem i odstaw pułapkę powietrzną.
- Po zakończeniu autoklawowania wylej pożywkę, a kolby do pożywki wypłucz i odstaw. Następnie ponownie podłącz pułapkę powietrzną, podłącz szkiełko z kanałem ibidi przeznaczone do czyszczenia (wielorazowe) i podłącz system przepływowy do pompy w miejscu pokazanym na Rysunku 1.
- Zamknij zawór pomarańczowej kolby do hodowli bocznej za pomocą zacisku.
- Wlej około 200 mL nierozcieńczonego wybielacza do zlewki. Zanurz gumowe korki w wybielaczu, a następnie uruchom pompę z dużą prędkością, aby przepuścić wybielacz przez cały aparat przepływowy (z wyjątkiem wszystkich filtrów). Po wypełnieniu systemu wybielaczem wyłącz pompę, ponieważ pozostawienie pompy włączonej przy dużej prędkości może doprowadzić do zużycia i pęknięcia przewodów.
- Po 15 min odkażania wybielaczem, unieś gumowe korki nad zlewką i ponownie uruchom pompę, aby usunąć wybielacz z aparatu przepływowego.
- Powtórz kroki 3.4 i 3.5 dwukrotnie, używając nadmiaru wody zamiast wybielacza, aby wypłukać system przepływowy. W tym czasie czyść filtry wyłącznie wodą, ponieważ inne środki czyszczące mogą spowodować korozję lub zapchanie filtrów.
- Włóż przewód, który normalnie łączy się z filtrem do pożywki 0,2 µm (wychodzący z FB 2 µm), do wody w zlewce z gumowymi korkami z kroku 3.6.
- Odłącz przewód przytwierdzony do wlotu filtra liniowego 20 µm, który zazwyczaj można łatwo odciągnąć mimo obecności zacisku.
- Użyj kolby z filtrem próżniowym i długiego odcinka przewodu przechodzącego przez zapasowy korek 3-otworowy, aby stworzyć system próżniowy, który można podłączyć do aparatu przepływowego.
- Podłącz ten system próżniowy do wlotu filtra 20 µm i uruchom próżnię; spowoduje to przepływ wody przez filtry w kierunku przeciwnym, co usunie martwe komórki.
- Przepompuj przez filtry co najmniej 200 mL wody, a następnie wyjmij przewód z wody, aby opróżnić linie filtrów z wody.
- Odłącz system próżniowy od filtra 20 µm i ponownie podłącz filtr do standardowych przewodów.
4. Analiza ilościowa materiałów wideo
UWAGA: Wszystkie pliki muszą zostać przekonwertowane do formatu plików obrazów TIF, aby móc z nich korzystać. Ponadto, w celu umożliwienia porównania wyników między eksperymentami, kluczowe jest, aby wszystkie obrazy zostały wykonane przy użyciu tego samego mikroskopu i tych samych parametrów obrazowania, zgodnie z powyższymi opisami.
- Pobierz i zainstaluj program ImageJ, jeśli nie został on jeszcze zainstalowany.
- Pobierz pomocniczy plik makra i umieść go w folderze ImageJ\macros.
- Dostosuj dostarczone makro:
- Otwórz w programie ImageJ stos obrazów z poprzedniego eksperymentu i wybierz punkt czasowy, w którym obecne są komórki.
- Wybierz z menu opcję "Image | Type | 8-bit".
- Wybierz z menu opcję "Image | Adjust | Threshold". Zaznacz pole "Dark Background". W rozwijanym menu po prawej stronie ustaw kolor czerwony (Red).
- Dostosuj dolną wartość tak, aby wszystkie komórki były pokryte kolorem czerwonym przy minimalnym nadmiarze szumu (dopuszczalne są pojedyncze kropki poza komórkami, które zostaną usunięte przez makro). Zanotuj tę dolną wartość.
- Zamknij okno Threshold oraz otwarty obraz.
- Wybierz z menu opcję "Plugins | Macros | Edit". Gdy pojawi się prośba o otwarcie pliku: "przejdź o jeden poziom folderu wyżej", następnie wybierz folder macros i otwórz plik makra do kwantyfikacji biofilmu przepływowego (flow biofilm quantification).
- Zmień wartość 15 we wszystkich wystąpieniach "setThreshold(15, 255);" na wartość wyznaczoną w kroku 4.3.4. Zapisz plik i zamknij to okno.
- Wybierz z menu opcję "Plugins | Macros | Install" i wybierz plik do kwantyfikacji biofilmu przepływowego.
- Teraz w menu "Plugins | Macros" pojawi się sześć nowych opcji dla różnych kwantyfikacji wideo. Uruchom funkcję Complete analysis i wybierz pliki wideo z adhezją i wzrostem, gdy pojawi się prośba o przeprowadzenie wszystkich dostępnych analiz na uzyskanych danych i automatyczne wygenerowanie plików wynikowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne obrazy z typowego nocnego eksperymentu time-lapse z wykorzystaniem typu dzikiego C. albicans komórki w 37 °C można zaobserwować w Rycina 2A i Wideo dodatkowe 1Kontrast obrazów został zwiększony w celu poprawy widoczności. Przeprowadzono kwantyfikację oryginalnych danych, a reprezentatywne wykresy przedstawiono w Rycina 2BW celu wygenerowania tych wykresów...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykorzystanie systemu przepływu, jak opisano powyżej, pozwala na generowanie ilościowych filmów poklatkowych przedstawiających wzrost i rozwój biofilmu grzybów. Aby umożliwić porównania między eksperymentami, niezwykle ważne jest zapewnienie, że parametry obrazowania są takie same. Obejmuje to upewnienie się, że mikroskop jest ustawiony na oświetlenie Köhlera dla każdego eksperymentu (wiele przewodników jest dostępnych online na temat tego procesu). Oprócz parametrów obrazowania, istnieje kilka ważnych kroków, o których ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr Wade'owi Sigurdosonowi za dostarczenie cennego wkładu w projektowanie aparatu przepływowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pompa | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Głowica pompy | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Rurka | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Adapter pułapki bąbelkowej | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Adapter próżniowy pułapki bąbelkowej do 1/4" ID przewód próżniowy | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| Adapter filtra liniowego (potrzebne 4) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Pomarańczowa strona Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Zielona strona Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Prowadnice | ibidi | 80196 | 4 |
| * Suwak luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Próżnia wspomagana pułapka bąbelkowa | Elveflow/Darwin mikrofluidyka | KBTLarge - Zestaw mikroprzepływowych pułapek bąbelkowych | 3 |
| Kolby na media | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0,2 i mikro; m filtr powietrza | Corning | 431229 | 1 |
| Gwintowana szklana butelka do PD i kolby filtra (potrzebne 2 | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Portowa nakrętka do PD i kolby filtracyjnej (2 potrzebne) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Złączka z nakrętką | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Złączka do węży z podkładką skośną | Danco | 88579 | 5,10 |
| Łącznik rurki podkładka płaska | Danco | 88569 | 5,10 |
| Zaciski do filtrów liniowych i za Y (7 potrzebnych) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Narzędzie do zacisków | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μ m liniowy filtr mediów | Analityczne instrumenty naukowe | 850-1331 | 8 |
| 10 μ m liniowy filtr mediów | Analityczne instrumenty naukowe | 850-1333 | 9 |
| 2 μ m filtr mediów wlotowych | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0,22 i mikro; m filtr mediów | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0,22 i mikro; m filtr mediów » adapter" | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Korek gumowy | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Mieszadło z płytą grzejną z zewnętrznym portem sondy | ThermoFisher Scientific | 88880006 | Nie dotyczy |
| Sonda temperatury | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
Bibliografia
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304(2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349(2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), Basel, Switzerland. 13(2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522(2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
