Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58467

⸱

20 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Streszczenie

W odniesieniu do problemów z efektami off-target i trudnościami w wstawianiu długiego fragmentu DNA w zastosowaniu zaprojektowanych nukleaz do edycji genomu, technologia celowania w geny oparta na embrionalnych komórkach macierzystych (ES) nie ma tych wad i jest szeroko stosowana do modyfikacji genomu zwierzęcia/myszy, począwszy od dużych delecji/insercji, a skończywszy na podstawieniach pojedynczych nukleotydów. Warto zauważyć, że identyfikacja stosunkowo niewielu zdarzeń rekombinacji homologicznej (HR) niezbędnych do uzyskania pożądanych klonów ES jest kluczowym krokiem, który wymaga dokładnych i wiarygodnych metod. W tym celu często stosuje się Southern blot i/lub konwencjonalny PCR. W tym miejscu opisujemy szczegółowe procedury stosowania tych dwóch metod do identyfikacji zdarzeń HR, które wystąpiły w mysich komórkach ES, w których endogenny gen Myh9 ma zostać zakłócony i zastąpiony przez cDNA kodujące inne niemięśniowe miozyny łańcuchy ciężkie II (NMHC II). Cała procedura Southern blotting obejmuje budowę wektora (wektorów) celowania, elektroporację, wybór leków, ekspansję i przechowywanie komórek/klonów ES, przygotowanie, trawienie i osuszanie genomowego DNA (gDNA), hybrydyzację i mycie sondy (sond) oraz ostatni etap autoradiografii na kliszach rentgenowskich. PCR można wykonać bezpośrednio z przygotowanym i rozcieńczonym gDNA. Aby uzyskać idealne wyniki, należy starannie zaplanować sondy i miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego (RE) do Southern blotting oraz startery do PCR. Chociaż wykonanie Southern blotting jest czasochłonne i pracochłonne, a wyniki PCR są fałszywie dodatnie, prawidłowa identyfikacja za pomocą Southern blotting i szybkie badanie przesiewowe za pomocą PCR pozwalają na jedyne lub połączone zastosowanie tych metod opisanych w tym artykule na szerokie zastosowanie i konsultacje większości laboratoriów w identyfikacji genotypów komórek ES i zwierząt modyfikowanych genetycznie.

Wprowadzenie

Technologia celowania genów przez HR w mysich komórkach ES dostarcza potężnego narzędzia do analizowania komórkowych konsekwencji określonych mutacji genetycznych1,2. O znaczeniu i znaczeniu tej technologii świadczy uznanie jej przez Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 2007 roku3,4; Tymczasem reprezentuje nadejście nowoczesnej ery inżynierii genetycznej5. Celowanie genów za pomocą HR może być wykorzystane do inżynierii praktycznie każdej zmiany, od mutacji punktowych po duże rearanżacje chromosomów w genomie mysich komórek ES6,7. Powszechnie wiadomo, że przed pojawieniem się tak zwanych narzędzi do edycji genomu, wygenerowanie myszy z nokautem genowym wymagało zastosowania technologii celowania w geny w komórkach ES8,9,10. W ciągu ostatnich dwóch dekad ponad 5000 myszy ukierunkowanych na geny zostało wyprodukowanych za pomocą tego podejścia do modelowania chorób ludzkich lub badania funkcji genów11. Podjęto próbę wyeliminowania całego genomu w celu dystrybucji wektorów ukierunkowanych na geny, docelowych klonów komórek ES i żywych myszy do społeczności naukowej2,12,13,14,15. Niewątpliwie, technologia ukierunkowania genów za pośrednictwem komórek ES za pośrednictwem HR znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat funkcji genów odgrywanych w kontekście fizjologicznym lub patologicznym.

Ponieważ HR jest stosunkowo rzadkim zjawiskiem w komórkach ssaków16,17, ważnym i następnym krokiem po celowaniu w geny w mysich komórkach ES jest analiza licznych kolonii ES w celu zidentyfikowania kilku klonów z mutacjami wynikającymi z HR za pomocą wektora docelowego18. Złote metody identyfikacji zdarzeń HR obejmują Southern blotting i PCR19,20. Do zalet tych podejść należy to, że Southern blotting może zidentyfikować prawidłowo ukierunkowane klony ES i pozwala naukowcom analizować strukturę zdarzenia docelowego genem, takiego jak weryfikacja pojedynczej insercji konstruktu, podczas gdy strategia oparta na PCR pozwala na szybsze badania przesiewowe pod kątem zdarzeń HR21,22. Chociaż metody te mają wady, takie jak to, że są czasochłonne i mogą dawać wyniki fałszywie dodatnie, ich kombinacyjne zastosowanie jest powszechnie akceptowane i stosowane przez większość laboratoriów w identyfikacji zdarzeń HR, szczególnie w komórkach ES, w celu generowania genetycznie modyfikowanych zwierząt.

Trzy izoformy niemięśniowej miozyny II (NM II) u ssaków, każda składająca się z dwóch identycznych NMHC II, które są kodowane przez trzy różne geny (o nazwach Myh9, Myh10 i Myh14) oraz dwóch par łańcuchów świetlnych, są określane jako NM II-A, II-B i II-C23. Wcześniejsze badania wykazały, że przynajmniej izoformy NM II-A i II-B są niezbędne do rozwoju myszy, ponieważ ablacja in vivo tych izoform powoduje śmiertelność embrionalną24,25,26. Aby obejść ten problem i uzyskać nowy wgląd w specyficzne dla izoform funkcje NM II-A i II-B w późniejszych etapach rozwoju myszy, przyjęto strategię zastępowania genetycznego przy użyciu technologii ukierunkowania genów za pośrednictwem HR opartej na komórkach ES w celu wygenerowania serii modeli mysich27. W trakcie identyfikacji pożądanych klonów ES wykorzystano zarówno metody Southern blot, jak i PCR, które okazały się skuteczne i niezawodne27,28.

Ten artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowego opisu Southern blotting i PCR, w tym projektowania wektorów celowania, sond i starterów, a także przeprowadzania eksperymentów, a także analizy wyników zilustrowanych identyfikacją wystąpienia zdarzenia HR w komórkach ES w celu stworzenia genetycznych modeli myszy NM II i reprezentatywnych danych. Przedstawione tutaj protokoły tych dwóch metod mogą być również przyjęte do identyfikacji genotypów genetycznie zmodyfikowanych komórek lub zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projekt konstrukcji celowniczej, sond do Southern Blot i starterów do PCR

  1. Wybierz pierwszy egzon kodujący (ekson 2) genu Myh9 do zakłócenia lub insercji w zastosowaniu knockout/knock-in opisanym tutaj.
  2. Pobierz 5-kb sekwencje DNA w górę i 5 kb w dół otaczające ekson 2 Myh9 ze strony internetowej genome.ucsc.edu.
  3. Analizuj wzorce trawienia restrykcyjnego enzymów (RE) z 1–2 cięciami w tym regionie 10 kb za pomocą oprogramowania pDRAW w celu określenia odpowiednich RE do trawienia genomowego DNA dla Southern blotting.
    UWAGA: Dra I spełnia ten wymóg i jest wybierana do tego celu.
  4. Wybierz fragment o wielkości 4 kb bezpośrednio przed eksonem 2 Myh9 jako lewe ramię homologii (LHA) i fragment o rozmiarze 1,7 kb bezpośrednio za nim jako prawe ramię homologii (RHA); wybierz fragment o wielkości 1 kb znajdujący się 5' przed LHA jako lewą sondę (LP) dla Southern blot i fragment o długości 1,2 kb znajdujący się 3' za RHA jako prawą sondę (RP), w oparciu o powyższą analizę.
  5. Użyj programu starter3, aby zaprojektować startery do przodu i do tyłu do amplifikacji tych czterech fragmentów DNA metodą PCR. Zaprojektuj parę starterów z przednim starterem umieszczonym w pobliżu końcówki 3' markera selekcyjnego genu oporności na neomiocynę (P1) i odwrotnym starterem znajdującym się tuż na zewnątrz RHA (P2).
    UWAGA: Ta para starterów będzie używana do identyfikacji docelowych klonów ES przez PCR29.
  6. Znajdź klon 129Sv BAC pokrywający locus genu Myh9 myszy, odwiedzając stronę internetową bacpac.chori.org (uwaga: preferowane jest izogeniczne DNA). Wyizolować DNA BAC za pomocą zestawu odpowiedniego do oczyszczania dużych fragmentów DNA zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta.
    UWAGA: Oczyszczone DNA BAC zostanie użyte jako matryca do amplifikacji PCR.
  7. Narysuj schematyczną reprezentację konstruktów celowniczych, sond i starterów, aby podsumować te informacje.

2. Generowanie konstruktów celujących i sond do Southern Blot oraz przygotowanie starterów do PCR

  1. Zamów opisane powyżej startery PCR i rozpuść je w stężeniu 20 μM.
  2. Amplifikować ramiona i sondy homologiczne metodą PCR w roztworze reakcyjnym zawierającym 1 μl starterów do przodu i 1 μl starterów do tyłu, 1 μl DNA BAC (50 ng) jako matrycę, 5 μl buforu dla Pfu i 1 μl Pfu ultra jako polimerazę DNA iH2Odo 50 μL. Wykonaj PCR w maszynie do PCR w następujących warunkach: 95 °C przez 3 min; 95 °C przez 30 s; 60 °C przez 30 s; 72 °C i 1 kb/min; 30 cykli; na koniec 72 °C przez 10 min.
  3. Oczyścić produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta i wymyć fragmenty DNA za pomocą 40 μlH2O. Strawić oczyszczone produkty PCR z wstępnie zaprojektowanymi RE w roztworze reakcyjnym zawierającym 5 μL 10x buforu dla RE, 2,5 μL RE1 i 2,5 μL RE2, i eluowanego DNA, w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Uruchomić 1% żel DNA, aby oddzielić docelowe prążki DNA, wyciąć żel zawierający docelowe DNA w świetle UV, oczyścić docelowe fragmenty DNA z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta i wymyć fragmenty DNA za pomocą 40 μlH2O.
  4. Sklonuj ramiona homologii i zastępczą kasetę ekspresji do wektora mpNTKV-LoxP zgodnie z kolejnością amplifikowanych i oczyszczonych kaset ekspresji RHA, LHA i zastępczych uwolnionych z innych wektorów, aby uzyskać ostateczny konstrukt (konstrukcje) ukierunkowany(e). Sklonuj fragmenty DNA amplifikowanych i oczyszczonych sond do wektora T-easy.
  5. Potwierdź sekwencje nukleotydowe wszystkich sklonowanych fragmentów DNA, sekwencjonując27,28.

3. Przygotowanie konstrukcji celującej, elektroporacja komórek ES i amplifikacja klonów ES

  1. Przygotuj każdy konstrukt celowniczy za pomocą zestawu maxiprep plazmidu zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Linearyzować każdy plazmid konstruktu, trawiąc go z Not I w reakcji 400 μL, w tym 40 μL 10x buforu dla Not I, 10 μL Not I, 100 μg DNA iH2Odo 400 μL, w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Oczyść zlinearyzowane konstrukcje docelowe.
    1. Wyekstrahować strawiony roztwór reakcyjny 1x równą objętością fenolu:Chloroformu:Alkoholu izoamylowego (25:24:1) i odwirować z siłą 2 000 x g przez 10 min.
    2. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, wytrącić DNA za pomocą 2,5 x etanolu i 0,1 x octanu sodu 3M (pH 5,2) (stosunek objętościowy) i odwirować z siłą 2 000 x g przez 10 minut.
    3. Usunąć supernatant, przemyć osad DNA 1x 1 ml 75% etanolu i odwirować z siłą 2 000 x g przez 5 minut.
    4. Usunąć supernatant i wysuszyć osad DNA na powietrzu przez 5 minut.
    5. Rozpuścić zlinearyzowany osad DNA w sterylnym buforze Tris-EDTA (TE) w końcowym stężeniu 1 μg/μl.
  3. Wymieszaj 50 μg każdego zlinearyzowanego konstruktu celowniczego z komórkami ES 0,5 x 107. Wykonaj elektroporację przy napięciu 320 V i 250 μF. Umieść elektroporowane ogniwa ES na naczyniach z neoodpornymi podajnikami MEF.
  4. Po 24 godzinach należy przejść na pożywkę komórkową ES z 400 μg/ml G418 i 200 μM gancyklowiru i kontynuować hodowlę przez 4–5 dni z codzienną zmianą pożywki. Pobieraj lekooporne klony ES do 48-dołkowych płytek.
    UWAGA: Zwykle na konstrukt stosuje się cztery płytki 48-dołkowe.
  5. Zduplikować płytki 48-dołkowe.
    UWAGA: Jeden zestaw płytek jest kriokonserwowany, a drugi zestaw służy do przygotowania genomowego DNA.

4. Przygotowanie genomowego DNA i trawienie za pomocą enzymu restrykcyjnego(-ych)

  1. Przygotuj gDNA z komórek ES za pomocą komercyjnego zestawu (zestaw do oczyszczania genomowego DNA) z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Usunąć pożywkę z hodowli komórek ES i dodać 500 μl roztworu do lizy jąder, w tym RNazyA, bezpośrednio do studzienek w celu lizy komórek.
      UWAGA: Lizat komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast poddać obróbce.
    2. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby całkowicie zlizować komórki i przenieść je do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać jedną trzecią objętości roztworu do wytrącania białek do probówki o pojemności 1,5 ml, energicznie wirować przez 20 s, schładzać próbki na lodzie przez 5 minut, a następnie wirować z siłą 2 000 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do innej czystej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej równą objętość izopropanolu; delikatnie wymieszać roztwór. (Odnotuj, że w tym momencie widać białe nitkowate pasma.) Wirować z siłą 2 000 x g przez 1 min; Następnie odrzuć supernatant.
    4. Umyj osad gDNA 1 ml 70% etanolu w temperaturze pokojowej, odwiruj z siłą 2,000 x g przez 1 minutę, ostrożnie odessaj supernatant, a następnie wysusz granulkę gDNA na powietrzu przez 3 minuty.
    5. Rozpuścić gDNA w 100 μl roztworu do rehydratacji DNA, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Przechowuj gDNA w temperaturze 2–8 °C.
  2. Trawić gDNA za pomocą wstępnie zaprojektowanego RE Dra I. Ustawić reakcję trawienia 30 μl, mieszając 3 μl 10-krotnego buforu dla Dra I, 3 μl Dra I, 10 μg gDNA/próbkę iH2Odo 30 μl i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Sprawdź kompletność trawienia za pomocą żelu DNA, analizując 5 μl strawionej reakcji, a następnie dodaj 3 μl 10-krotnego buforu ładującego DNA do następnego etapu.

5. Identyfikacja Southern Blotting i PCR

  1. Badania przesiewowe w kierunku blottingu południowego
    1. Oddziel strawione gDNA za pomocą elektroforezy i przenieś do membrany.
      1. Przygotować 1% żel do elektroforezy agarozowej z bromkiem etydyny (EB), załadować próbki z kroku 4.3 i drabinkę o rozmiarze 1 kb, a następnie uruchomić żel pod niskim napięciem (30–40 V) przez noc.
      2. Wyjmij żel i zrób zdjęcie za pomocą systemu obrazowania DNA w żelu po elektroforezie. Sprawdź, czy strawione i oddzielone gDNA wyświetlają obraz podobny do rozmazu.
      3. Namocz żel na tacce z 0,2 N roztworem HCl i delikatnie potrząsaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Przenieś żel do roztworu denaturującego DNA i delikatnie wstrząsaj nim przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      5. Zamień żel na roztwór neutralizujący DNA i delikatnie potrząsaj nim przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Po tym kroku żel jest podatny na pękanie, dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie.
      6. Użyj systemu szybkiego transferu w dół, aby przenieść DNA z żelu do błony. Zmontuj TurboBlotter i stos bibuły zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta.
        UWAGA: Jako bufor transferowy stosuje się 10x lub 20x roztwór cytrynianu soli fizjologicznej (SSC). Ogólnie rzecz biorąc, 3 godziny transferu wystarczają do przeniesienia 95% gDNA z żelu na błonę; Jednak dłuższy czas transferu jest nieszkodliwy.
      7. Wyjmij membranę i przemyj ją 2x SSC przez 1 min, wchłoń płyn z tkankami, a następnie usieciuj DNA z błoną za pomocą środka sieciującego UV.
        UWAGA: Membrana może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez tydzień.
    2. Oznacz sondy DNA radioaktywnością.
      1. Oczyść plazmidy sondy za pomocą zestawu miniprep zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.
      2. Uwolnić fragmenty DNA sond z wektora plazmidowego przez mineralizację EcoR I w roztworze reakcyjnym zawierającym 5 μl buforu dla EcoR I, 2 μl enzymu EcoR I, 20 μg plazmidowego DNA iH2Odo 50 μl, przez 2 godziny.
      3. Uruchom 1% żel DNA do oddzielenia fragmentów DNA sondy od wektora i oczyść fragmenty DNA sond za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.
      4. Używając 1 μl roztworu DNA, zmierz stężenie DNA we fragmentach DNA sondy za pomocą spektrofotometru o długości fali 260/280 nm.
      5. Przygotuj 40 ng DNA sondy w probówce o pojemności 1,5 ml z 45 μl buforu TE, gotuj przez 3 minuty, krótko wiruj, a następnie umieść probówkę (probówki) na lodzie na 2 minuty.
      6. Dodać denaturowane termicznie DNA sondy do probówki zawierającej gotowe do użycia kulki znakujące DNA (-dCTP), pipetować w górę i w dół do mieszania, dodać 5 μl [α32P]dCTP, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
      7. Oczyścić oznakowane sondy za pomocą mikrokolumn G-50 zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta, a następnie zmierzyć radioaktywność za pomocą licznika scyntylacyjnego (opcjonalnie).
    3. Zhybrydyzuj membranę (membrany) z oznakowanymi sondami.
      1. Prehybrydyzacja błony.
        1. Podgrzej roztwór hybrydyzacyjny w temperaturze 42 °C przez 30 minut. Wymieszaj 20 ml podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego z 200 μg DNA plemników łososia w probówce o pojemności 50 ml.
        2. Umieść membranę w probówce hybrydyzacyjnej. Dodaj mieszany roztwór prehybrydyzacyjny do probówki hybrydyzacyjnej. Umieścić go w piecu do hybrydyzacji (ustawić walcowanie i temperaturę na 42 °C) i pozostawić prehybrydyzację przez 30 minut.
      2. Zhybrydyzuj membranę za pomocą oznakowanych sond (sond).
        1. Wyjąć probówkę do hybrydyzacji i wlać roztwór do hybrydyzacji do probówki o pojemności 50 ml; dodać zdenaturowaną sondę (podgrzewaną w temperaturze 100 °C przez 3 minuty) z kroku 5.1.2.7 do tej probówki i delikatnie wymieszać.
          UWAGA: Zmniejsz wszelkie pęcherzyki indukujące.
        2. Zwróć zmieszany roztwór do probówki hybrydyzacyjnej i przeprowadź hybrydyzację w temperaturze 42 °C przez noc.
    4. Umyj membranę(y), aby usunąć niezhybrydyzowane sondy.
      1. Umieść membranę (membrany) na tacy z 1x SSC + 0,1% SDS i delikatnie wstrząsaj w temperaturze 55–60 °C przez 10 minut.
      2. Przenieś membranę(y) na tackę z 0,5x SSC + 0,1% SDS i delikatnie wstrząsaj w temperaturze 55–60 °C przez 10 minut.
      3. Sprawdź radioaktywność membrany (membran) za pomocą przenośnego licznika Geigera, aby zdecydować, czy wymagane jest trzecie mycie.
    5. Wystaw radioaktywność na membranie na klisze rentgenowskie.
      1. Usuń płyn z umytej membrany (membran).
      2. Owiń membranę (membrany) folią i zamocuj ją/je w kasecie ekspozycyjnej.
      3. Wystaw membranę na dwa arkusze kliszy rentgenowskiej w ciemnym pomieszczeniu.
      4. Umieść kasetę naświetlacyjną w temperaturze -80 °C na noc lub dłużej.
    6. Wywołaj filmy, aby zwizualizować wyniki. Oceń, czy odpowiedni klon ES jest pożądany z ukierunkowaną rekombinacją, czy nie, zgodnie z rozmiarami prążków DNA wykrytych przez sondy.
    7. Tę samą membranę należy ponownie zrehybrydyzować za pomocą innej sondy po usunięciu zużytej sondy zgodnie z następującą procedurą: wyjąć zużytą membranę, przemyć ją 1x czystymH2O, a następnie inkubować w roztworze do striptizowania (55% formamidu, 2% SSPE, 1% SDS,H2O) w temperaturze 65 °C z delikatnym wstrząsaniem przez 1–2 godziny.
  2. Identyfikacja PCR
    1. Przeprowadzić identyfikację PCR pożądanych klonów ES w 50-μl roztworze reakcyjnym, w tym 5 μL 10x buforu PCR, 2 μL 50 mM MgSO4, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 20 μM startera do przodu, 1 μL 20 μM startera odwrotnego, 1 μL platyny o wysokiej wierności Taq, gDNA (~100 ng) iH2Odo 50 μL.
    2. Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94°C przez 3 minuty, 30 cykli denaturacji w temperaturze 94°C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 60°C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 68°C przez 132 s oraz końcowy etap 68°C przez 10 minut.
    3. Analizuj produkty PCR przez elektroforezę w 1,0% agarozie.
    4. Sklonuj fragmenty PCR o oczekiwanym rozmiarze do wektora i sekwencji T-easy, aby potwierdzić obecność częściowej sekwencji wektora docelowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy opisano szczegółowy protokół transfere Southern i PCR, wykorzystywany do identyfikacji zdarzeń HR, które wystąpiły w komórkach ES myszy w celu generowania modeli myszy z genetycznym zastąpieniem NM II, z zastosowaniem technologii targetowania opartego na HR w komórkach ES. Chociaż transfer Southern i PCR, a także tradycyjna technologia targetowania genów, są szeroko stosowane od kilku dekad, ich pomyślne zastosowanie wymaga starannego zaplanowania. Należy rozważyć co na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecnie projektowane nukleazy do edycji genomu nadal nie mogą zastąpić technologii celowania genowego opartej na komórkach ES ze względu na problemy z efektami niedocelowymi i trudnościami we wprowadzaniu długiego fragmentu DNA30,31. Jako złota metoda identyfikacji zdarzeń HR, które wystąpiły w mysich komórkach ES, raport ten zawiera szczegółowy protokół Southern blotting i PCR dla tej dziedziny. Zweryfikowaliśmy wiarygodność tych metod, analizując poszczególne k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca otrzymała wsparcie od Programu Ogólnego Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Granty nr 31571432), Human Provincial Natural Science Foundation of China (Grant nr 2015JC3097) oraz Fundacji Badawczej Biura Edukacji Prowincji Hunan, Chiny (Grant nr 15K054).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BAC CLONECentrum zasobów BACPAC (BPRC)bMQ-330E21
Zestaw do dużych konstrukcji QIAGENQIAGEN12462
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQIAGEN28704
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCRQIAGEN28104
QIAprep Spin Zestaw miniprzygotowawczyQIAGEN27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi KitQIAGEN12963
PfuUltra High-Fidelity DNA PolymeraseAgilent600382
wektor T-easyPromegaA1360
Roztwór do lizy jąderPromegaA7941
Roztwór do wytrącania białekPromegaA7951
Roztwór do denaturacji DNAVWR351-013-131
Roztwór neutralizujący DNAVWR351-014-131
Gotowe do użycia kulki do etykietowania DNA (-dCTP)VWR27-9240-01
UltraPure SSC, 20xThermo Fisher15557036
UltraPur Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v)Thermo Fisher15593031
G418Thermo Fisher10131035
Roztwór DNA plemników łososiaThermo Fisher15632011
Platinu Taq Polimeraza DNA High FidelityThermo Fisher11304029
Not IThermo ScientificER0592
Dra IThermo ScientificER0221
EcoR IThermo ScientificER0271
GanciclovirSigmaG2536
Whatman  System przenoszenia TurboBlotter, duże zestawyFisher Scientific09-301-188
[α 32P]dCTPPerkinElmerNEG013H100UC
ProbeQuan G-50 MikrokolumnyGE Healthcare28-9034-08
Roztwór hybrydyzacyjny Hybrisol IMilliporeS4040
Kodak X-Ray FilmZ& Z Medical844 5702

Bibliografia

  1. Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
  2. Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
  3. Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
  4. Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
  5. Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
  6. Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
  7. Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187(2005).
  8. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
  9. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
  10. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
  11. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337(2011).
  12. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  13. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  14. Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
  15. Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260(2012).
  16. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
  17. Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365(1992).
  18. Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
  19. Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188(2005).
  20. Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117(2008).
  21. Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
  22. Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
  23. Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
  24. Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
  25. Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
  26. Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
  27. Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
  28. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238(2012).
  29. Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641(2018).
  30. Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
  31. Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188(2005).
  32. Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
  33. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173(2005).
  34. Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
  35. Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74(2010).
  36. Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trawienie genomowego DNAhybrydyzacja sondyautoradiografiascreening PCRmiejsca ci cia enzym w restrykcyjnychznakowanie sond DNA
Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.