Separacja kompleksów białek tylakoidów szpinaku za pomocą natywnej elektroforezy zielonego żelu i charakterystyki pasma przy użyciu skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół rozdzielania rozpuszczonych kompleksów tylakoidów za pomocą natywnej elektroforezy Zielonego Żelu. Zielone pasma żelowe są następnie charakteryzowane za pomocą skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) i dostarczane są podstawowe kroki do analizy danych.

Streszczenie

Reakcje świetlne fotosyntezy są przeprowadzane przez szereg pigmentowanych kompleksów białkowych w błonach tylakoidów. Stechiometria i organizacja tych kompleksów jest wysoce dynamiczna zarówno w długiej, jak i krótkiej skali czasowej ze względu na procesy, które dostosowują fotosyntezę do zmieniających się warunków środowiskowych (tj. Wygaszanie niefotochemiczne, przejścia stanów i odpowiedź długoterminowa). Historycznie procesy te były opisywane spektroskopowo pod kątem zmian fluorescencji chlorofilu, a spektroskopia pozostaje istotną metodą monitorowania parametrów fotosyntezy. Istnieje ograniczona liczba sposobów, w jakie można zobrazować podstawową dynamikę kompleksu białkowego. Tutaj opisujemy szybką i prostą metodę separacji i wizualizacji kompleksów tylakoidów w wysokiej rozdzielczości, natywną elektroforezę w zielonym żelu. Metoda ta jest sprzężona ze skorelowanym w czasie zliczaniem pojedynczych fotonów w celu szczegółowej charakterystyki właściwości fluorescencji chlorofilu prążków oddzielonych na zielonym żelu.

Wprowadzenie

Organizmy fotosyntetyzujące muszą stale dostosowywać swoją fizjologię do zmieniających się warunków środowiskowych, aby maksymalizować swoją produktywność i skutecznie konkurować z sąsiadami¹. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku maszyn odpowiedzialnych za reakcje świetlne w procesie fotosyntezy, ponieważ warunki oświetlenia otoczenia mogą wahać się o trzy rzędy wielkości między cieniem a pełnym światłem słonecznym. Ponadto czynniki środowiskowe, takie jak susza, zimno lub stres cieplny, mogą zmniejszać dostępność dwutlenku węgla do wiązania węgla, który jest naturalnym pochłaniaczem elektronów dla produktów reakcji świetlnych. Rośliny muszą zatem zbierać i wykorzystywać promieniowanie słoneczne tak efektywnie, jak to możliwe, zachowując jednocześnie zdolność do rozpraszania nadmiaru energii świetlnej w razie potrzeby. Podczas gdy uszkodzenia fotooksydacyjne nadal występują rutynowo w każdych warunkach oświetleniowych^2,3, brak skutecznego zarządzania pochłoniętą energią wzbudzenia może prowadzić do katastrofalnego uszkodzenia i śmierci komórki. Istnieje kilka mechanizmów adaptacyjnych, które pozwalają na dostrojenie aparatu fotosyntetycznego zarówno do zmian panujących warunków środowiskowych, jak i do przejściowych fluktuacji (tj. zarówno w długich, jak i krótkich skalach czasowych)⁴. Należą do nich odpowiedź długoterminowa (LTR) i hartowanie niefotochemiczne (NPQ). Uważa się, że NPQ samo w sobie obejmuje co najmniej trzy inne zjawiska składowe, w tym przejścia stanów (qT), szybko indukowane wygaszanie energii (qE) i fotoinhibicję (qI)⁵.

Te procesy były pierwotnie obserwowane i definiowane głównie w kategoriach zjawisk spektroskopowych [np. NPQ odnosi się do spadku obserwowanej fluorescencji chlorofilu (wygaszanie fluorescencji chlorofilu), który nie jest spowodowany wzrostem tempa fotochemii]⁶. Termin "przejścia stanów" podobnie odnosi się do obserwowanej zmiany względnej ilości fluorescencji z PSI i PSII⁷. Podczas gdy techniki spektroskopowe, które umożliwiły wyliczenie tych zjawisk [w szczególności spektroskopia fluorescencyjna z modulacją amplitudy impulsów (PAM)] i nadal są istotnym środkiem do obserwacji i analizy procesów fotosyntezy in vivo, potrzeba dużo biochemii, aby wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw tych obserwacji spektroskopowych. Na przykład przejścia stanów obejmują cykl fosforylacji/defosforylacji białek LHCII przez odpowiednio kinazę STN7 i fosfatazę TAP38/PPH1^8,9,10. Cykl ten dostosowuje fizyczną dystrybucję anteny LHCII między dwoma fotosystemami poprzez przesunięcie części trimerów LHCII z PSII do PSI, zmieniając w ten sposób przekrój absorpcyjny fotosystemów^11,12. Składnik qE NPQ szybko przekształca nadmiar energii wzbudzenia w ciepło poprzez działanie cyklu epoksydacji/deepoksydacji wiolaksantyny/zeaksantyny oraz białka PsbS. Dokładna rola PsbS w tym procesie nie jest jeszcze w pełni zrozumiała¹³. Składnik qI NPQ, hamowanie fotoinhibicji, jest ogólnie przypisywany uszkodzeniu białka D1 PSII. Przywrócenie pełnej zdolności fotosyntetycznej wymaga skomplikowanego procesu naprawy w celu naprawy uszkodzonych fotocentrów PSII. Cykl naprawczy PSII obejmuje migrację kompleksów PSII ze stosów granalnych, demontaż kompleksów, wymianę uszkodzonych białek D1, ponowne złożenie kompleksów PSII i przemieszczenie kompleksów PSII z powrotem do stosów granalnych¹⁴. Dokładna natura fotoinhibicji i fotouszkodzeń PSII pozostaje przedmiotem intensywnych badań¹⁵.

Trudność w badaniu zjawisk takich jak przejścia stanów czy naprawa PSII wynika częściowo z faktu, że nie ma jednego prostego sposobu na wizualizację mechaniki złożonych systemów biochemicznych. Klasyczne biochemiczne podejście do zrozumienia procesu polega na tym, aby najpierw oddzielić jego składniki, tak aby można je było scharakteryzować w izolacji. Natywna elektroforeza żelowa powstała w wyniku udanych prób oddzielenia i scharakteryzowania kompleksów fotosystemów z błon tylakoidów za pomocą bardziej preparatywnych metod (mianowicie wirowania w gradieniu sacharozy i chromatografii)¹⁶. Systemy detergentowe opracowane w celu delikatnego rozpuszczania natywnych kompleksów z błon tylakoidowych zostały wkrótce przystosowane do metod separacji elektroforetycznej, w szczególności przez Allena i Staehelin¹⁷ oraz Petera i Thornbera¹⁸, dając początek natywnej elektroforezie w zielonym żelu. Chociaż reprezentuje tylko jedną z wielu technik w arsenale eksperymentalnym, natywna PAGE ma szereg atrakcyjnych cech, które sprawiły, że jest szeroko stosowaną metodą w badaniach nad fotosyntezą. Natywna PAGE jest stosunkowo szybka i prosta, wymaga niewielkiego specjalistycznego sprzętu, a jednocześnie zapewnia separację dużej liczby kompleksów tylakoidów w wysokiej rozdzielczości. To sprawia, że natywny PAGE jest wygodnym narzędziem do badania dynamiki tylakoidów, a w połączeniu ze standardowym PAGE w drugim wymiarze, a także różnymi systemami detergentów i, wszechstronnym systemem do wyszukiwania i charakteryzowania nowych kompleksów tylakoidów.

To powiedziawszy, rodzime zielone żele mają reputację zawodnej techniki, szczególnie w niedoświadczonych rękach, ponieważ łatwo jest uzyskać słabe wyniki składające się z rozmytych, rozmazanych żeli z kilkoma pasmami. Problem ten został częściowo rozwiązany dzięki wprowadzeniu niebieskiego natywnego PAGE¹⁹. Zastosowanie barwnika Coommassie w systemie buforowym BN sprawia, że separacja białek jest bardziej wytrzymała. Dlatego BN-PAGE jest często łatwiejszą i bardziej niezawodną techniką do skonfigurowania dla względnego nowicjusza i może zapewnić separację kompleksów tylakoidów w wysokiej rozdzielczości. Z tych powodów BN-PAGE stał się metodą z wyboru dla większości prac w tej dziedzinie. Chociaż BN-PAGE działa na ogół wolniej niż elektroforeza w zielonym żelu, jego główną wadą jest to, że barwienie barwnikiem Coommassie zakłóca identyfikację słabych prążków zawierających chlorofil, jednocześnie utrudniając dalszą charakterystykę spektroskopową.

Informacje biochemiczne dostarczane przez natywne żele i 2D SDS-PAGE mogą być znacznie wzmocnione w połączeniu z danymi z technik spektroskopowych. Niezależnie od zastosowanego systemu, głównym problemem związanym z używaniem natywnych żeli do identyfikacji kompleksów jest to, że identyfikacja zawsze może zostać zakwestionowana (tj. białka znajdujące się w prążku mogą zawsze reprezentować komigrujące kompleksy lub składniki, a nie pojedynczy fizjologicznie autentyczny kompleks). Charakterystyka spektroskopowa dostarcza informacji biofizycznych na temat pigmentów w zielonych pasmach żelowych i może być wykorzystana do określenia, jakie rodzaje kompleksów mogą zawierać. Fluorescencja chlorofilu jest szczególnie przydatna w tym zakresie ze względu na często dramatycznie różne widma i czasy życia fluorescencji, które są charakterystyczne dla różnych fotosyntetycznych kompleksów pigmentowo-białkowych. Podczas gdy proste widma fluorescencji 77K w stanie ustalonym były historycznie przydatne w potwierdzaniu tożsamości natywnych kompleksów żelowych, nowoczesne zliczanie pojedynczych fotonów skorelowane w czasie (TCSPC) może dostarczyć znacznie więcej informacji. TCSPC pozwala nie tylko na charakterystykę kompleksów na podstawie czasów życia fluorescencji, ale także umożliwia szczegółowy opis transferu energii między składowymi widmowymi w obrębie kompleksu. Tego rodzaju charakterystyka staje się coraz bardziej potrzebna, ponieważ rozprzestrzenia się stosowanie różnych natywnych systemów żelowych i odkrywane są nowe domniemane kompleksy, co pozwala na lepszą identyfikację kompleksów białkowych i dostarcza nowych informacji biofizycznych na temat działania tych kompleksów.

W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala osobom mającym niewielkie lub żadne doświadczenie z natywną elektroforezą żelową osiągnąć wysoką jakość rozdzielczości natywnych kompleksów tylakoidów w celu zbadania mechaniki reakcji świetlnych fotosyntezy. Ta podstawowa technika może być następnie rozszerzona według uznania eksperymentatora w celu poprawy wyników lub rozszerzenia możliwości zastosowania na inne gatunki. Następnie opisujemy proces poddawania natywnych zielonych opasek żelowych TCSPC, a także kilka kroków do podstawowej analizy i prezentacji danych dostarczonych przez tę technikę. Sprzężenie natywnej elektroforezy żelowej z analizą TCSPC rozszerza użyteczność tych systemów żelowych, zapewniając uwierzytelnianie i biofizyczną charakterystykę kompleksów białkowych w prążkach. Opisany tutaj system zielonego żelu jest oparty na systemie opracowanym przez Allena i Staehelin¹⁷ z pewnymi modyfikacjami i jest taki sam jak ten używany w Schwarz et al. ²⁰. Ten system jest jednym z wielu, ale ma specyficzne funkcje, które są przydatne dla tej metodologii. Jest na tyle szybki, że izolację tylakoidów, elektroforezę żelową i wygodną analizę TCSPC można wykonać w ciągu jednego dnia, eliminując potencjalne problemy z przechowywaniem i degradacją próbki. Uważamy również, że ta metoda jest solidna w rękach niedoświadczonych użytkowników, a jednocześnie zapewnia wyniki, które wahają się od dobrych do lepszych, w zależności od stopnia optymalizacji.

Ważne jest, aby pamiętać, że kompleksy wizualizowane na natywnym żelu zależą zarówno od użytego detergentu i systemów buforowych, jak również od biologii badanego organizmu. Różne systemy detergentów i preferencyjnie oddzielają różne rodzaje kompleksów, a dany organizm fotosyntetyzujący będzie miał różne kompleksy od innych organizmów, z których nie wszystkie będą obecne w danych okolicznościach. Opisany tutaj system jest szczególnie przydatny do badania megakompleksów PSI, jak opisano w Schwarz i wsp. ²⁰, ale wypada na bardziej destabilizującym końcu spektrum dla osób studiujących megakompleksy PSII. W celu kompleksowego zbadania różnych systemów detergentów i stosowanych w natywnej elektroforezie żelowej białek tylakoidów, zaleca się zapoznanie się z Järvi i wsp. ²¹ oraz Rantala et al.²².

Protokół

1. Przygotowanie roztworów podstawowych do nalewania rodzimych zielonych żeli

1. Przygotować 4x stężony roztwór buforowy do rozpuszczania żeli składających się z 40% glicerolu, 200 mM glicyny i 100 mM Tris buforowanych do pH 8,3.
2. Przygotuj 4x stężony roztwór buforowy do układania żeli składających się z 40% glicerolu, 200 mM glicyny i 100 mM Tris buforowanych do pH 6,3.
3. te należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec rozwojowi pleśni.
   Uwaga: są stabilne przez miesiące w temperaturze 4 °C, dlatego zaleca się przygotowanie 100-200 ml każdego buforu do dalszego stosowania.
4. Przygotuj 1 l 10x działającego buforu zawierającego 250 mM Tris HCl pH 8,3, 1,92 M glicyny i 1% SDS. Przechowuj bufor 10x do biegania na blacie.

2. Przygotowanie roztworu podstawowego do izolacji i solubilizacji tylakoidów

1. Przygotować 100 ml buforu homogenizacyjnego TMK zawierającego 50 mM buforu Tris (pH 7), 10 mM MgCl₂ i 10 mM KCl i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Jest to główny bufor do homogenizacji i manipulowania próbkami tylakoidów. Alternatywnie można przygotować i w razie potrzeby rozcieńczyć skoncentrowane roztwory podstawowe (bufor Tris, MgCl₂ i KCl można łatwo przechowywać na stole jako koncentraty 1 M).
2. Przygotować roztwory podstawowe detergentów do rozpuszczania tylakoidów, maltozydu B-decylu (DM) i b-oktylu B-d-glukozydu (OG), rozpuszczając każdy detergent w buforze TMK o stężeniu 20% w/v. Zamrażać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.
3. Przygotować bufor do rozpuszczania tylakoidów (SB), który jest również buforem ładującym próbkę.
   1. Najpierw przygotuj bufor TMK-glicerolu, łącząc 7 ml buforu TMK i 3 ml glicerolu.
   2. Do 800 μl buforu TMK-glicerolu dodać 100 μl roztworu podstawowego DM i 100 μl roztworu podstawowego OG. Roztwór roboczy SB, zawierający 2% s.m. i 2% OG, zamrożony w temperaturze -20°C należy przechowywać w 1 ml podwielokrotności.
      Uwaga: Każda porcja może być rozmrożona i ponownie zamrożona w razie potrzeby.

3. Nalewanie zielonych mini żeli do późniejszego wykorzystania

1. Przygotuj oddzielne roztwory żelu do układania w stosy i rozpuszczania w jednorazowych probówkach o pojemności 15 ml.
   Uwaga: Podane objętości są wystarczające dla pojedynczego mini żelu przy użyciu przekładek płytkowych 1,5 mm.
   1. Aby przygotować roztwór żelu do układania, połącz 1,25 ml 4x buforu żelu do układania w stosie, 0,5 ml 40% roztworu podstawowego akrylamidu (39:1 C) i 3,25 ml wody, aby uzyskać 5 ml 4% akrylamidu w 1x buforze do układania. Aby przygotować roztwór żelu rozdzielczego, połącz 1,875 ml 4-krotnego buforu rozdzielczego, 0,94 ml 40% roztworu podstawowego akrylamidu (39:1 C) i 4,7 ml wody, aby uzyskać 7,5 ml 5% akrylamidu w buforze o 1-krotnej rozdzielczości.
2. Wlej żel rozdzielczy.
   1. Dodać 50 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS) do roztworu żelu rozdzielczego, następnie dodać 10 μl TEMED, zakryć probówkę i delikatnie odwrócić kilka razy, aby wymieszać. Natychmiast wlej roztwór żelu między płytki żelowe, pozostawiając około 1 cm między górną częścią żelu rozdzielczego a dolną częścią zębów grzebienia na żel do układania.
   2. Delikatnie naniec pipetą 100% etanolu na wierzch żelu rozdzielczego, aby wyrównać żel.
      Uwaga: Jeśli żel nie stwardnieje w ciągu 15 minut, należy przygotować świeży roztwór APS i/lub użyć nowego TEMED.
   3. Po polimeryzacji żelu (granica faz między żelem a etanolem będzie łatwo widoczna i nie będzie się poruszać, gdy żel zostanie przechylony), odlej etanol i osusz chłonnym papierem.
3. Wlej żel do układania.
   1. Dodać 25 μl 10% APS do roztworu żelu do układania, dodać 5 μl TEMED, następnie zakryć i odwrócić, aby wymieszać w taki sam sposób, jak żel rozdzielczy. Wlej roztwór żelu na wierzch żelu rozdzielczego, aż przestrzeń między płytkami zostanie całkowicie wypełniona i włóż 10-dołkowy grzebień.
      Uwaga: Gdy będzie gotowy do użycia, wyjmij grzebień z żelu i spłucz studzienki wodą, upewniając się, że studzienki są proste i niezatkane żelem. Żel można przechowywać z założonym grzebieniem w temperaturze 4 °C przez co najmniej kilka dni.

4. Izolacja surowych błon tylakoidowych z liści szpinaku

Uwaga: Wszystkie kroki powinny być wykonywane na lodzie przy użyciu wstępnie schłodzonego sprzętu i. Zalecane jest również przyciemnione oświetlenie. W zależności od uznania eksperymentatora i badanych procesów biologicznych, inhibitory proteazy i/lub fosfatazy powinny być dodawane świeże do TMK przed homogenizacją.

1. Całkowicie zhomogenizować liście szpinaku w buforze TMK za pomocą szklanego homogenizatora Dounce.
   Uwaga: Około 1 do 2 ml buforu jest zwykle wystarczające dla małego liścia młodego szpinaku. Pojedynczy liść młodego szpinaku może na ogół dostarczyć wystarczającą ilość materiału, aby załadować kilka studzienek na mini żel o średnicy 1,5 mm.
2. Przefiltruj surowy homogenat liści, aby usunąć nierozpuszczalne zanieczyszczenia.
   1. Aby zrobić proste urządzenie filtrujące, przetnij delikatną chusteczkę zadaniową na pół i złóż ją na ćwiartki. Zapakuj delikatną chusteczkę zadaniową na dno jednorazowej strzykawki o pojemności 5 ml i wstępnie zwilż chusteczkę buforem TMK.
   2. Użyć tłoka strzykawki, aby wycisnąć nadmiar buforu z delikatnej ściereczki roboczej i upewnić się, że filtr wycierania jest mocno dociśnięty do dna strzykawki po wyjęciu tłoka.
   3. Odpipetować homogenat liściowy na środek filtra wycierającego i użyć tłoka, aby przepuścić homogenat przez filtr. Przefiltrowany homogenat zebrać w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
3. Odwirować homogenat o stężeniu 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 ° C w celu osadzenia nierozpuszczalnego materiału, w tym błon tylakoidowych. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu TMK.
4. Znormalizuj ilość chlorofilu w każdej próbce, dostosowując objętość każdej zawieszonej próbki tylakoidów tak, aby każda próbka zawierała taką samą całkowitą ilość chlorofilu, jak opisano poniżej.
   Uwaga: Umożliwi to rozpuszczenie każdej próbki w tej samej objętości detergentu i zminimalizuje zmienność solubilizacji spowodowaną różnicami w objętości granulek.
   1. Aby wyekstrahować chlorofil z każdej próbki zawieszonych błon tylakoidowych, należy pobrać 50 μl podwielokrotności do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać do niej 950 μl metanolu. Zakryj rurkę i wymieszaj, odwracając kilka razy.
   2. Odwirować ekstrakt metanolu/chlorofilu o sile 10 000 x g przez 10 minut, aby osadzać wytrącone białka.
   3. Określić stężenie chlorofilu w supernatance pigmentu zgodnie z Porra i wsp. ²³. Wykonaj odczyty absorbancji przy 652 i 665 nm za pomocą spektrofotometru i kuwety o średnicy 1 cm. Określ całkowite stężenie chlorofilu, korzystając z poniższego równania:
      Chls a + b (μg/ml) = 22,12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm)
   4. Używając pomiarów stężenia chlorofilu jako wskazówki, w razie potrzeby usuń i wyrzuć pewną objętość z każdej próbki, tak aby każda probówka zawierała taką samą całkowitą ilość chlorofilu.
5. Błony tylakoidowe należy ponownie obrabiać przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 10 min. Usunąć i wyrzucić supernatant. Należy uważać, aby usunąć cały supernatant bez zasysania jakiejkolwiek cząstki osadu.

5. Solubilizacja błon tylakoidów do ładowania na natywne żele

1. Rozmrozić podwielokrotność 30% roztworu detergentu (SB) glicerolu TMK i kilkakrotnie odwrócić w celu wymieszania. Trzymaj go na lodzie.
2. Rozpuścić osad tylakoidu, dodając odpowiednią objętość SB, aby uzyskać stężenie chlorofilu 1 mg/ml.
   Uwaga: Stężenie to jest punktem wyjścia do znalezienia optymalnych warunków rozpuszczania, które należy określić empirycznie. Stężenie chlorofilu musi być takie samo we wszystkich próbkach, aby umożliwić dokonanie prawidłowych porównań.
3. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, uważając, aby nie spienić próbki. Przechowywać na lodzie, aby próbki tylakoidów mogły się rozpuścić.
   Uwaga: Rozpuszczaj przez co najmniej 10 minut. Czas solubilizacji powinien być na tyle długi, aby różnica w czasie rozpuszczania między próbkami była zminimalizowana.
   Przykład: Jeśli do rozpuszczenia wszystkich próbek wymagane są 3 minuty, należy przeznaczyć około 30 minut na rozpuszczanie.
4. Odwirować rozpuszczone tylakoidy w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia materiału nierozpuszczalnego.
   Uwaga: Rozpuszczone próbki tylakoidów są stabilne na lodzie przez wiele godzin, ale należy unikać przechowywania w temperaturze -70 °C, ponieważ cykle zamrażania i rozmrażania mogą powodować utratę pasm megazłożonych.

6. Rozdzielanie rozpuszczonych białek tylakoidów za pomocą natywnej elektroforezy żelowej

1. Rozpuszczony supernatant tylakoidowy przygotowany w kroku 5.4 należy załadować bezpośrednio na przygotowany wcześniej natywny żel. W przypadku żelu o średnicy 1,5 mm załaduj 15 μl rozpuszczonego tylakoidu na dołek.
2. Uruchom natywny zielony żel w zasadzie w taki sam sposób, jak żele SDS-PAGE, używając 1x bufora biegowego. Uruchom żel pod napięciem 100 V i umieść cały zbiornik żelu na mokrym lodzie na czas cyklu, aby złagodzić rezystancyjne nagrzewanie się żelu.
   Uwaga: Żel powinien potrzebować około 2 godzin, aby wolny pigment na froncie migracji dotarł do dna żelu (Rysunek 1).

7. Wycięcie pasm kompleksu tylakoidów z natywnych zielonych żeli

Uwaga: Usunięcie konkretnego pasma zainteresowania z żelu jest konieczne, aby umożliwić umieszczenie pasma na ścieżce wiązki i zapobiec zbieraniu rozproszonej fluorescencji z pobliskich kompleksów.

1. Usunąć żel z komory elektroforetycznej i spłukać spływający bufor z płytek żelowych wodą destylowaną. Zdejmij górną płytkę z żelu i spłucz żel wodą destylowaną.
2. Trzymaj żel na dolnej szklanej płytce i umieść żel i płytkę na lodzie. Gdy nie jest używany, trzymaj żel w ciemności i przykryj folią, aby zapobiec jego wyschnięciu.
3. Pozostawiając żel na szklanej płytce, wytnij każde pasmo zainteresowania, gdy będzie gotowe do analizy TCSPC. Banderole należy czyście oczyścić ostrym skalpelem lub żyletką i należy uważać, aby wycięta banderola nie zawierała zanieczyszczającego materiału taśmy.

8. Zbiór widm fluorescencji w stanie ustalonym w temperaturze pokojowej

1. Dla każdego kompleksu, który będzie analizowany przez TCSPC, pobiera się widmo fluorescencji w temperaturze pokojowej w zakresie od 600 do 800 nm za pomocą spektrometru fluorescencji.
   Uwaga: Długość fali wzbudzenia używana do zbierania tego widma musi być zgodna z długością fali używaną dla TCSPC.

9. TCSPC zielonych opasek żelowych

Uwaga: Patrz Rysunek 2, aby zobaczyć konfigurację TCSPC.

1. Umieść plasterek żelu między dwoma szklanymi szkiełkami mikroskopowymi. Użyj taśmy maskującej, umieszczonej na każdym końcu jednego z szkiełek mikroskopowych i kilkakrotnie złożonej, aby utworzyć przekładki, aby szkiełka mogły być mocno trzymane razem bez ściskania plastra żelu.
   Uwaga: Spowoduje to utworzenie ścieżki, którą wiązka laserowa będzie przechodzić między szkiełkami mikroskopu i przez plasterek żelu.
2. Dodaj niewielką ilość wody do plastra żelu na krawędzi szkiełek, aby stworzyć gładki interfejs, który zmniejszy rozpraszanie sygnału.
3. Zacisnąć warstwę żel/szkiełko na ścieżce wiązki tak, aby wiązka uderzała w plasterek żelu przez otwartą krawędź płytek, umożliwiając emisję fluorescencji przez stronę szkiełek szkiełkowych, w której żel jest umieszczony, prostopadle do ścieżki wiązki.
   Uwaga: Zastosowana długość fali wzbudzenia będzie zależeć od eksperymentu. Długość fali 435 nm wzbudzi zarówno chlorofil a, jak i chlorofil b, podczas gdy 465 nm preferencyjnie wzbudzi chlorofil b. W tym przypadku jako długość fali wzbudzenia użyto 435 nm.
4. Zbierz łącznie 10 000 punktów danych w regularnych odstępach czasu w całym widmie emisji fluorescencji dla każdego kompleksu. Na przykład zbieraj dane co 10 nm, zaczynając od 680 nm, a kończąc na 750 nm.
   Uwaga: Przygotuj wiele pasm żelowych dla każdego kompleksu, który ma być badany, tak aby świeża próbka była dostępna w przypadku, gdy fotowybielanie uniemożliwia odpowiednie zbieranie sygnału.

10. TCSPC (Analiza danych)

1. Dla danego kompleksu najpierw znormalizuj wysokość piku każdej krzywej rozpadu dla wszystkich zebranych długości fal.
   Uwaga: Ten krok nie jest konieczny do budowy DAS, ale pozwala na nałożenie krzywych zaniku i wizualne porównanie ich ze sobą podczas pierwszej kontroli danych.
2. Dopasuj ogon każdej krzywej rozpadu do widma fluorescencji kompleksu w stanie ustalonym, jak opisano poniżej.
   1. Wybierz punkt czasowy, po przekroczeniu którego sygnał zaniku uległ spłaszczeniu, zwykle po kilku nanosekundach.
   2. Dla każdej długości fali znormalizuj krzywą zaniku tak, aby intensywność sygnału w wybranym punkcie czasowym była równa wartości widma fluorescencji w stanie ustalonym na tej długości fali (tj. wartości wszystkich długości fal razem w wybranym punkcie czasowym odtworzą widmo fluorescencji w stanie ustalonym).
3. Zbuduj widma związane z rozpadem (DAS) na podstawie krzywych rozpadu dopasowanych do ogona, jak opisano poniżej.
   1. Korzystając z punktów danych z krzywych rozpadu dopasowanych do ogona, skonstruuj serię wykresów przedstawiających intensywność fluorescencji w funkcji długości fali w regularnych odstępach czasu (np. co 10 ps). Na przykład DAS przy 50 ps jest konstruowany przez wykreślenie wartości każdej krzywej rozpadu przy 50 ps w funkcji długości fali.
   2. Nałóż na siebie wszystkie widma związane z zanikiem, aby utworzyć wykres w stylu kaskadowym, który pokazuje zanik widma fluorescencji w czasie.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki dla elektroforezy zielonym żelem są przedstawione w Rysunek 1. Tor 1 stanowi przykład idealnych wyników dla elektroforezy tylakoidów szpinaku w zielonym żelu, w której widoczna jest maksymalna liczba wyraźnych, ostrych zielonych pasków. Wyniki te są nieco nietypowe, częściowo dlatego, że nie wszystkie pasma widoczne na pasie 1 są zwykle obecne w danej próbce. Dodatkowe oczyszczanie próbki w postaci izolacji chloroplastów przed rozpuszcz...

Dyskusja

Udana solubilizacja tylakoidów i natywny przebieg żelu spowodują rozwiązanie wielu wyraźnych widocznych zielonych pasm na żelu bez znacznego zniekształcenia lub rozmazania pasm. Przeciążenie żelu, wysokie stężenie detergentu, nieprawidłowe pH próbki, nierozpuszczony materiał, zbyt szybkie uruchamianie żelu lub w zbyt wysokiej temperaturze oraz niewłaściwie nalany żel to czynniki, które mogą przyczyniać się do słabo rozwiązywanych kompleksów tylakoidowych. Optymalizując warunki samego żelu (np. stężenia gradientu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranozyd, nie maltozyd dodecylowy lub maltozyd alfa decylu
Glukozyd oktylowy	Sigma	O8001
Akrylamid	BioRad	161-0148	37,5/1 C 40% roztwór
TEMED	BioRad	161-0800
Nadsiarczan amonu	BioRad	161-0700
Chlorek magnezu	Sigma	M2670
Chlorek potasu	Sigma	P9333