Artykuł metodologiczny

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/58475

⸱

30 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Patricia and John Rosenwald Laboratory of Neurobiology and Genetics, Rockefeller University, 2Electron Microscopy Resource Center, Rockefeller University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia metody generowania skrzepów fibrynowych in vitro i analizy wpływu białka beta-amyloidu (Aβ) na tworzenie i strukturę skrzepów za pomocą spektrometrii i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Wykazano, że Aβ, który tworzy neurotoksyczne agregaty amyloidu w chorobie Alzheimera (AD), wchodzi w interakcje z fibrynogenem. Ta interakcja Aβ-fibrynogen sprawia, że skrzep fibryny jest strukturalnie nieprawidłowy i odporny na fibrynolizę. Nieprawidłowości w krzepnięciu fibryny wywołane przez Aβ mogą również przyczyniać się do mózgowo-naczyniowych aspektów patologii AD, takich jak mikrozawały, stany zapalne, a także mózgowa angiopatia amyloidowa (CAA). Biorąc pod uwagę potencjalnie krytyczną rolę deficytów nerwowo-naczyniowych w patologii choroby Alzheimera, opracowanie związków, które mogą hamować lub zmniejszać interakcję Aβ-fibrynogen, ma obiecującą wartość terapeutyczną. Metody in vitro, za pomocą których można łatwo i systematycznie oceniać powstawanie skrzepów fibrynowych, są potencjalnie użytecznymi narzędziami do opracowywania związków terapeutycznych. Przedstawiono zoptymalizowany protokół wytwarzania skrzepu fibryny in vitro, a także analizę wpływu inhibitorów interakcji Aβ i Aβ-fibrynogenu. Test zmętnienia skrzepu jest szybki, wysoce powtarzalny i może być stosowany do jednoczesnego testowania wielu warunków, co pozwala na badanie przesiewowe dużej liczby inhibitorów Aβ-fibrynogenu. Związki trafione z tego badania przesiewowego mogą być dalej oceniane pod kątem ich zdolności do łagodzenia indukowanych przez Aβ nieprawidłowości strukturalnych architektury skrzepu fibryny za pomocą SEM. Skuteczność tych zoptymalizowanych protokołów została zademonstrowana przy użyciu TDI-2760, niedawno zidentyfikowanego inhibitora interakcji Aβ-fibrynogenu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera (AD), choroba neurodegeneracyjna prowadząca do pogorszenia funkcji poznawczych u starszych pacjentów, głównie wynika z nieprawidłowej ekspresji beta-amyloidu (Aβ), agregacji i upośledzonego klirensu, co prowadzi do neurotoksyczności1,2. Pomimo dobrze scharakteryzowanego związku między agregatami Aβ a AD3, dokładne mechanizmy leżące u podstaw patologii choroby nie są dobrze poznane4. Coraz więcej dowodów sugeruje, że deficyty nerwowo-naczyniowe odgrywają rolę w postępie i nasileniu AD5, ponieważ Aβ bezpośrednio oddziałuje ze składnikami układu krążenia6. Aβ ma wysoką interakcję powinowactwa z fibrynogenem7,8, który również lokalizuje się w złogach Aβ zarówno u pacjentów z AD, jak i w modelach mysich9,10,11. Ponadto oddziaływanie Aβ-fibrynogen indukuje nieprawidłowe tworzenie i strukturę fibryny-skrzepu, a także odporność na fibrynolizę9,12. Jedną z możliwości terapeutycznych w leczeniu AD jest łagodzenie deficytów krążenia poprzez hamowanie interakcji między Aβ a fibrynogenem13,14. W związku z tym zidentyfikowaliśmy kilka małych związków hamujących interakcję Aβ-fibrynogen przy użyciu wysokoprzepustowych badań przesiewowych i podejść chemii medycznej13,14. Aby przetestować skuteczność inhibitorów interakcji Aβ-fibrynogenu, zoptymalizowaliśmy dwie metody analizy tworzenia się skrzepów fibryny in vitro: test zmętnienia skrzepu i skaningową mikroskopię elektronową (SEM)14.

Test zmętnienia skrzepów to prosta i szybka metoda monitorowania powstawania skrzepów fibryny za pomocą spektroskopii widzialnej w promieniowaniu UV. W miarę tworzenia się skrzepu fibrynowego światło jest coraz bardziej rozpraszane, a zmętnienie roztworu wzrasta. I odwrotnie, gdy Aβ jest obecny, struktura skrzepu fibryny ulega zmianie, a zmętnienie mieszaniny ulega zmniejszeniu (ryc. 1). Wpływ związków hamujących można ocenić pod kątem potencjału przywrócenia zmętnienia skrzepu z powodu nieprawidłowości wywołanych przez Aβ. Chociaż test zmętnienia pozwala na szybką analizę wielu warunków, dostarcza ograniczonych informacji na temat kształtu i struktury skrzepu. SEM, w którym topografia ciał stałych jest ujawniana przez sondę elektronową, pozwala na analizę architektury 3D krzepu < klasy sup = 'xref'>15,< sup class='xref'>16,17,18 oraz ocenę, w jaki sposób obecność Aβ i/lub związków hamujących zmienia tę strukturę9,14. Zarówno spektrometria, jak i SEM są klasycznymi technikami laboratoryjnymi, które były wykorzystywane do różnych celów, na przykład spektrofotometria służy do monitorowania agregacji amyloidu19,20. Podobnie, SEM jest również używany do analizy skrzepu fibryny utworzonego z osocza pacjentów z chorobą Alzheimera, Parkinsona i udarem zakrzepowo-zatorowym21,22,23. Przedstawione tutaj protokoły są zoptymalizowane pod kątem oceny tworzenia się fibryny w powtarzalny i szybki sposób.

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące przygotowania fibryny in vitro zarówno z Aβ, jak i bez niego. Szczegółowo opisano również metody analizy wpływu Aβ na tworzenie i strukturę skrzepów fibryny. Skuteczność tych dwóch metod pomiaru hamowania interakcji Aβ-fibrynogen wykazano przy użyciu TDI-2760, małego związku hamującego14. Metody te, zarówno pojedynczo, jak i łącznie, pozwalają na szybką i prostą analizę powstawania skrzepów fibryny in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie Aβ42 i Fibrynogenu do analizy

  1. Przygotuj monomeryczny Aβ42 z liofilizowanego proszku
    1. Podgrzej proszek Aβ42 do temperatury pokojowej i wiruj w tempie 1,500 x g przez 30 s.
    2. Dodać 100 μl lodowatego heksafluoroizopropanolu (HFIP) na 0,5 mg proszku Aβ42 i inkubować przez 30 minut na lodzie.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z HFIP i wykonaj wszystkie czynności w okapie chemicznym.
    3. Przygotować 20 μl porcji i pozostawić folie do wyschnięcia na powietrzu w kapturze chemicznym przez 2-3 godziny. Folie można przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Rozpuść monomeryczną warstwę Aβ42 w 10 μl świeżego dimetylosulfotlenku (DMSO) przez mieszanie w sonikatorze kąpielowym przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 190 μl 50 mM buforu tris(hydroksymetylo)aminometanowego (Tris) (pH 7,4) i delikatnie pipetować w górę i w dół.
    6. Usunąć agregaty białkowe przez odwirowanie w temperaturze 20,817 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    7. Inkubować supernatant w temperaturze 4 °C przez noc, a następnego dnia odwirowywać roztwór w temperaturze 20,817 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby usunąć dalsze agregaty białkowe.
    8. Zmierzyć stężenie Aβ42 za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA). Seryjnie rozcieńczoną albuminę surowicy bydlęcej (BSA) od 1 mg/ml do 0,0625 mg/ml w celu wytworzenia wzorca białkowego, dodać 10 μl każdego wzorca do dołków płytki wielodołkowej w trzech powtórzeniach. Rozcieńczyć próbki Aβ w stosunku 1:4 i dodać 10 μl do studzienek w trzech egzemplarzach. Wymieszaj roztwory BCA A i B i dodaj 200 μl do każdego dołka. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i czytać na płytce czytnika przy długości fali 562 nm. Pozostały roztwór Aβ należy przechowywać na lodzie i stosować ten preparat do oznaczania zmętnienia i SEM.
  2. Przygotuj roztwór fibrynogenu
    1. Odmierzyć 20 mg liofilizowanego proszku fibrynogenu do probówki o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić we wstępnie podgrzanym 2 ml 20 mM buforu kwasu hydroksyetylopiperazyno-etanosulfonowego (HEPES) (pH 7,4).
    2. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    3. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Wyjąć roztwór z 4 °C i ponownie przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,1 μm w celu usunięcia agregatów fibrynogenu lub istniejącej wcześniej fibryny.
    4. Zmierz stężenie fibrynogenu za pomocą testu BCA. Postępuj zgodnie z instrukcjami z kroku 1.1.8. Pozostałą zawartość roztworu fibrynogenu należy przechowywać w temperaturze 4 °C i stosować ten preparat do oznaczania zmętnienia i SEM.

2. Test zmętnienia skrzepów

  1. Do każdej studzienki doświadczalnej z płytki 96-dołkowej dodać 20 μl 30 μM roztworu Aβ42 z etapu 1.1.8, tak aby jego końcowe stężenie wynosiło 3,0 μM w 200 μl buforu. Dodać tę samą objętość 5% DMSO w 50 mM buforze Tris (pH 7,4) do studzienek kontrolnych buforu w płytce 96-dołkowej.
    UWAGA: Dokładna objętość Aβ42 na tym etapie nie jest ważna. W przypadku preparatów o niskim stężeniu można zastosować większą objętość i dostosować objętość buforu do tworzenia skrzepów. Ostateczna objętość powinna pozostać 200 μl.
  2. W przypadku badania związków hamujących, należy rozcieńczyć związek do stężenia roboczego jako DMSO. Dodaj sam związek lub DMSO do kontroli do studzienek za pomocą Aβ42 i dobrze wymieszaj.
    UWAGA: Roztwór Aβ42 powinien tworzyć dyskretną kroplę na dnie studzienki, związek lub DMSO należy pipetować bezpośrednio do środka kropli.
  3. Rozcieńczyć podstawowy roztwór fibrynogenu z kroku 1.2.4 w buforze do tworzenia skrzepów (20 mM bufor HEPES (pH 7,4), 5 mM CaCl2 i 137 mM NaCl) i dodać go do Aβ42 zawierających i kontrolnych studzienek 96-dołkowej. Dostosuj objętość roztworu fibrynogenu tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 1,5 μM w sumie 200 μl objętości reakcyjnej. Powoli pipetować roztwór i unikać tworzenia się pęcherzyków. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wstrząsając na obrotowej platformie.
    UWAGA: Objętość roztworu fibrynogenu może się różnić w zależności od jego stężenia podstawowego, ale całkowita objętość w każdym dołku powinna wynosić 170 μl podczas inkubacji.
  4. Przygotować roztwór trombiny, rozpuszczając komercyjnie oczyszczony proszek trombiny w ddH2O, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 U/ml. Rozcieńczyć do 5 m/ml roztworu roboczego w 20 mM buforze HEPES (pH 7,4) bezpośrednio przed użyciem.
  5. Po 30 minutach inkubacji jednocześnie dodać 30 μl roztworu trombiny (5 U/ml) do roztworów fibrynogenu w 96-dołkowej płytce z kroku 2.3 za pomocą pipety wielokanałowej. Dodanie trombiny natychmiast zainicjuje tworzenie się skrzepu. Dlatego należy dodać trombinę bezpośrednio do środka roztworu fibrynogenu, ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
    UWAGA: Aktywność trombiny może się różnić w zależności od warunków eksperymentalnych, a także partii trombiny. Konieczne może być empiryczne określenie prawidłowego stężenia wymaganego do wytworzenia skrzepów.
  6. Odczytać absorbancję skrzepu in vitro na czytniku płytkowym bezpośrednio po dodaniu trombiny. Mierzyć absorbancję przy 350 nm w ciągu 10 minut, co 30-60 s. Wykonaj cały test w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Niektóre związki inhibitorowe mogą zmieniać absorbancję roztworu przy 350 nm, w którym to przypadku zmętnienie można zmierzyć przy 405 nm.

3. Skaningowa mikroskopia elektronowa

  1. Przygotowanie skrzepu, utrwalenie i mycie
    1. Umieść czyste szkiełka pokrywowe ze szkła silikonowanego (12 mm) na płytce 12-dołkowej lub 24-dołkowej za pomocą kleszczy.
    2. Przygotować fibrynogen w buforze do tworzenia skrzepów. Szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 1.2 protokołu.
    3. Aby ocenić wpływ inhibitorów interakcji Aβ-fibrynogenu na strukturę skrzepu fibryny, postępuj zgodnie z instrukcjami inkubacji opisanymi dla testu zmętnienia (krok 2). Zawsze dołączaj studzienki kontrolne, które zawierają fibrynogen pod nieobecność zarówno Aβ, jak i inhibitorów.
    4. Odpipetować 80 μl mieszaniny fibrynogenu z kroku 3.1.3 na szkiełkach podstawowych. Delikatnie rozprowadzić roztwór, tak aby był równomiernie rozprowadzony na szkiełku podstawowym.
    5. Rozcieńczyć trombinę (50 U/ml) w 20 mM buforowanej soli fizjologicznej HEPES do końcowego stężenia 2,5 U/ml i dodać 20 μl bezpośrednio do środka roztworu fibrynogenu bez mieszania.
      UWAGA: W razie potrzeby można zastosować wyższe stężenie robocze trombiny (5 U/ml).
    6. Przykryj 12-dołkową płytkę plastikową pokrywką i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30-60 minut.
    7. Podczas trwania reakcji krzepnięcia przygotuj roztwory odwadniające i utrwalające. Przygotować bufor kakodylanu sodu (0,1 M, pH 7,4). Rozcieńczyć 10% roztwór podstawowy aldehydu glutarowego w buforze kakodylanu sodu (0,1 M, pH 7,4), aby uzyskać 2% roztwór roboczy aldehydu glutarowego. Trzymaj wszystkie te roztwory na lodzie. Świeżo rozcieńczony aldehyd glutarowy (2%) należy zużyć w ciągu 1 tygodnia, jeśli jest prawidłowo przechowywany w lodówce w temperaturze 4 °C.
    8. Rozcieńczyć absolutny etanol (100%) w podwójnie destylowanej wodzie (80%, 50% i 20% etanolu). Roztwory etanolu i etanol absolutny (100%) należy przechowywać na lodzie.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z kakodylanem sodu i aldehydem glutarowym, wykonaj te czynności w kapturze chemicznym.
    9. Po 30 minutach delikatnie przemyć skrzepy dwukrotnie lodowatym buforem kakodylanu sodu (0,1 M). Dodać 2 ml buforu do każdej studzienki, tak aby skrzep był całkowicie zanurzony. Przykryj płytkę dołka pokrywką i pozostaw na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Po 2 minutach delikatnie usunąć bufor za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub pipety z wąskim trzpieniem. Powtórz raz.
    10. Napraw skrzepy lodowatym aldehydem glutarowym (2%). Trzymając płytkę studzienki na lodzie, dodaj około 2-3 ml 2% aldehydu glutarowego do każdej studzienki. Upewnij się, że skrzepy są całkowicie zanurzone. Przykryj i pozostaw talerz na lodzie na 30 minut.
    11. Po 30 minutach delikatnie usunąć aldehyd glutarowy z każdej studzienki i przemyć skrzepy za pomocą buforu kakodylanu sodu (0,1 M), jak opisano powyżej (2 min, dwukrotnie). Utrzymuj płytkę studzienki na lodzie.
  2. Seryjne odwadnianie skrzepów i suszenie w punkcie krytycznym
    1. Odwodnić skrzepy w stopniowanej serii lodowatych płukań etanolem przygotowanych w kroku 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% i ponownie 100%) przez 5 minut każde. Do każdej serii etanolu dodaj 2-3 ml, upewniając się, że skrzepy są zanurzone. Przykryj i inkubuj na lodzie.
    2. Po każdym etapie etanolu usuń roztwór etanolu za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub jednorazowego zakraplacza do pipet. Nie usuwaj całkowicie etanolu. Upewnij się, że powierzchnia skrzepu nie jest wystawiona na działanie powietrza.
      UWAGA: Odwodnienie w absolutnym etanolu (100%) należy wykonać dwukrotnie.
    3. Trzymając próbkę zanurzoną w końcowym 100% etanolu, przenieś ją do suszarki punktu krytycznego (CPD). Do przenoszenia szkiełek do komory CPD należy użyć uchwytu na próbkę CPD lub uchwytu szkiełka nakrywkowego z podkładką. Umieść co najmniej jedną podkładkę między każdym zjeżdżalnią.
    4. Wyjmij prowadnicę pokrywy z komory CPD i zamontuj ją na króćcu SEM za pomocą taśmy węglowej.
  3. Napylanie i obrazowanie
    1. Przenieść wszystkie próbki za pomocą króćca SEM do komory napylania.
    2. Napylanie warstwowe o grubości mniejszej niż 20 nm ze złota/palladu lub innych materiałów przewodzących, takich jak węgiel, za pomocą napylarki próżniowej.
      UWAGA: Zastosowaliśmy powłokę złoto-palladową o długości 18 nm. Napylanie trwało 45 s, a prędkość powlekania wynosiła 4 Μ/s. Próbki pokryte napylaniem są stabilne, gdy są przechowywane w suchym środowisku w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni. Analizę SEM można przeprowadzić w dowolnym momencie.
    3. Pozyskiwanie obrazów na skaningowym mikroskopie elektronowym wyposażonym w detektor SE2 przy napięciu 4 kV.
      nuta: Rozmiar piksela obrazu w tym zestawie obrazów mieści się w zakresie od 13 nm do 31 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W teście krzepnięcia in vitro (zmętnienia) enzym trombina rozszczepia fibrynogen, powodując powstanie sieci fibryny24. To tworzenie skrzepów fibryny powoduje rozproszenie światła przechodzącego przez roztwór, co skutkuje zwiększonym zmętnieniem (Rysunek 1), plateau, przed końcem okresu odczytu (Rysunek 2, zielony). Gdy fibrynogen inkubowano w obecności Aβ42, zmętnienie roztworu zmniejszyło się, a krzywa osiągnęła mak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj metody zapewniają powtarzalny i szybki sposób oceny tworzenia się skrzepów fibryny in vitro. Co więcej, prostota systemu sprawia, że interpretacja wpływu Aβ na tworzenie i strukturę skrzepów fibryny jest stosunkowo prosta. W poprzedniej publikacji tego laboratorium wykazano, że testy te mogą być wykorzystywane do testowania związków pod kątem ich zdolności do hamowania interakcji Aβ-fibrynogen13,14. Za pomocą tych dwóch testów przeanalizowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso i Michaelowi Foleyowi z Tri-Institutional Therapeutics Discovery Institute (TDI) w Nowym Jorku za syntezę inhibitorów interakcji Aβ-fibrynogen i ich cenne sugestie. Autorzy dziękują również członkom laboratorium Stricklanda za pomocną dyskusję. Praca ta była wspierana przez NS104386 grantów NIH, Alzheimer's Drug Discovery Foundation i Robertson Therapeutic Development Fund for H.A., NIH grant NS50537, Tri-Institutional Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer's Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation i John A. Herrmann for S.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fibriogen, zubożony w plazminogen, PlasmaEMD Millipore341578utrzymać parafilm pokrywy owinięty, aby uniknąć narażenia na wilgoć
Beta-amyloid (1-42), ludzkaAnaspecAS-20276
Trombina z ludzkiego osoczaSigma-AldrichT7009
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol, większy lub równy 99%Sigma-Aldrich105228
DIMETYLOSULFOTLENEK (DMSO), STERYLNIE FILTROWANYSigma-AldrichD2438
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białekThermo Scientific23225
Tris BaseFischer ScientificBP152
HEPESFischer ScientificBP310
NaClFischer ScientificS271
CaCl2Fischer ScientificC70
Strzykawka z filtrem, 0,2&mikro; M, 25mmPall4612
Millex Sterylne filtry strzykawkowe, 0.1 um, PVDF, Ø 33 mmMilliporeSLVV033RS
Solid 96-dołkowe płytki o wysokim poziomie wiązania Certyfikowany płaski dnoFischer Scientific21377203
Spectramax Plus384Urządzenia molekularne89212-396
Wirówka, 5417REppendorf5417R
Branson 200Fischer Scientific15-337-22
Rotator laboratoryjnyThermo Scientific2314-1CEQ
Zapasowe podkładki do uchwytu szkiełka nakrywkowegoTousimis8766-01
Pipety z wąskim trzpieniem - Sedi-PetElectron Microscopy Sciences (EMS)70967-13
Uchwyt na próbkę do CPD (uchwyt szkiełka nakrywkowego)Tousimis8766
Skrzynka uchwytu montażowego, typ pinowyMikroskopia elektronowa Sciences (EMS)76610
Okrągłe szkiełka podstawowe (12 mm)Hampton ResearchHR3-277
10% aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Nauki (EMS)16120
EtanolDecon Labs11652
Płytka 24-dołkowaFalcon3047
Na CacodylateElectron Microscopy Sciences (EMS)11652
SEM Stubs, Stożkowy koniec szpilka.Mikroskopia elektronowa Nauki (EMS)75192
Zakładki PELCO, Wypustki przewodzące węgiel, 12mm ODTed Pella16084-1
Autosamdri-815 Suszarka do punktów krytycznychTousimis
Denton Desk IV Coater z tarczą złoto/palladowąDenton Vacuum
Leo 1550 FE-SEMCarl Zeiss
Smart SEMCarl Zeiss
Myjka ultradźwiękowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
  2. Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
  3. Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
  4. Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
  5. Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
  6. Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
  7. Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
  8. Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
  9. Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
  10. Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
  11. Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
  12. Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
  13. Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
  14. Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
  15. Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
  16. Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
  17. Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
  18. Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879(2012).
  19. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
  20. Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
  21. Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
  22. Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121(2018).
  23. Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
  24. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
  25. Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddzia ywanie beta amyloidu z fibrynogenempomiar m tno cianaliza tworzenia skrzepubia ko A beta 42test fibrynogenu i trombinyprotok obrazowania SEMsuszenie w punkcie krytycznymnapylanie z oto palladem

Powiązane artykuły