Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58478

⸱

21 października 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.

Streszczenie

Opisujemy proces analizy ekspresji genów z komórek śródbłonka poddanych stałemu przepływowi laminarnemu przy użyciu wielu monitorowanych komór przepływu na równoległych płytkach. Komórki śródbłonka tworzą wewnętrzną wyściółkę komórkową naczyń krwionośnych i są przewlekle narażone na siłę tarcia przepływu krwi zwaną naprężeniem ścinającym. W warunkach fizjologicznych komórki śródbłonka funkcjonują w różnych warunkach naprężenia ścinającego. W związku z tym zastosowanie warunków naprężeń ścinających w modelach in vitro może zapewnić lepszy wgląd w reakcje śródbłonka in vivo. Komora przepływowa z płytką równoległą opublikowana wcześniej przez Lane'a i wsp.9 jest przystosowany do badania regulacji genów śródbłonka w obecności i bez stałego (niepullarnego) przepływu laminarnego. Kluczowe adaptacje w konfiguracji przepływu laminarnego, jak przedstawiono tutaj, obejmują duże, dedykowane środowisko do przechowywania równoległych obwodów przepływu, monitorowanie natężeń przepływu w czasie rzeczywistym oraz włączenie egzogennego referencyjnego RNA do normalizacji ilościowych danych PCR w czasie rzeczywistym. Aby ocenić wiele zabiegów/warunków z zastosowaniem naprężeń ścinających, w tym samym ogrzewanym i nawilżanym inkubatorze stosuje się jednocześnie wiele obwodów przepływowych i pomp. Natężenie przepływu każdego obwodu przepływu jest mierzone w sposób ciągły w czasie rzeczywistym w celu standaryzacji warunków naprężeń ścinających podczas eksperymentów. Ponieważ eksperymenty te mają wiele warunków, używamy również egzogennego referencyjnego RNA, który jest wzbogacany w czasie ekstrakcji RNA w celu normalizacji ekstrakcji RNA i wydajności syntezy pierwszej nici cDNA. Te kroki minimalizują zmienność między próbkami. Strategia ta jest stosowana w naszym rurociągu do analizy ekspresji genów z eksperymentami z naprężeniem ścinającym przy użyciu komory przepływowej z równoległą płytką, ale części tej strategii, takie jak egzogenny referencyjny skok RNA, można łatwo i tanio wykorzystać do innych zastosowań.

Wprowadzenie

Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych tworzą wewnętrzną wyściółkę naczyń krwionośnych w zamkniętym układzie sercowo-naczyniowym wyższych gatunków. Tworzą one granicę między krwią a tkankami i charakteryzują się powierzchniami świetlnymi i abluminalnymi. Śródbłonek jest zróżnicowanym, aktywnym i adaptacyjnym systemem, który reguluje przepływ krwi, transport składników odżywczych, odporność i wzrost nowych naczyń krwionośnych1. W organizmie komórki śródbłonka normalnie istnieją w środowisku, w którym są narażone na siłę tarcia krążenia, naprężenie ścinające2. Naprężenie ścinające jest ważnym regulatorem ekspresji genów komórek śródbłonka3, a komórki śródbłonka próbują utrzymać naprężenie ścinające w danym zakresie2,4. Komórki śródbłonka wykazują wzorce angiogenne przy braku naprężeń ścinających5, które mogą poprawić perfuzję tkanek. Regionalne wzorce zaburzonego przepływu i zmienionego stresu ścinającego są związane z ekspresją genów zapalnych6 i rozwojem miażdżycy7,8. Tak więc modele, które obejmują naprężenie ścinające, są głównym elementem zrozumienia regulacji genów śródbłonka.

Opisujemy metodę badania regulacji genów w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych pod wpływem stresu ścinającego. System ten wykorzystuje przepływ niepulsacyjny i naśladuje poziomy naprężeń ścinających płynu oraz stężenie tlenu, które modelują warunki dla komórek śródbłonka tętnic. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat metod knockdownu genu za pomocą interferencji RNA (RNAi), ustawień do zastosowania naprężeń ścinających przy użyciu aparatu przepływu z równoległą płytką oraz metod zwiększania egzogennego referencyjnego RNA przed analizą za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR). Rurociąg ten służy do badania regulacji genów w komórkach śródbłonka w obecności i bez laminarnego naprężenia ścinającego i obejmuje adaptację aparatu przepływu z równoległą płytką opisaną przez Lane'a i wsp.9. Ten konkretny układ został zaprojektowany, aby ułatwić jednoczesną ocenę wielu warunków eksperymentalnych, co pozwala na bezpośrednie porównanie warunków naprężeń ścinających, jak również normalizację analizy RNA. Duża jednostka grzewcza o kontrolowanej wilgotności jest wykorzystywana, aby umożliwić jednoczesną pracę wielu oddzielnych komór przepływowych i pomp z natężeniem przepływu monitorowanym dla każdego zespołu komory przepływowej w czasie rzeczywistym. Zastosowanie tej konfiguracji jest wykorzystywane do knockdownu genów przy użyciu RNAi w ustawieniu przepływu laminarnego/naprężenia ścinającego, ale aspekty tego protokołu można zastosować do dowolnej oceny ekspresji RNA.

Typowe podejścia do stosowania naprężeń ścinających dla komórek śródbłonka obejmują systemy mikroprzepływowe10, lepkościomierz stożkowo-płytkowy11, oraz komorę przepływu z płytką równoległą12. Systemy mikroprzepływowe różnych producentów okazały się przydatne w badaniu mechanobiologii i mechanotransdukcji w wielu typach komórek i tkanek oraz różnych bodźcach biofizycznych. W przypadku komórek śródbłonka zostały one wykorzystane do badania komórek śródbłonka w izolacji, a także interakcji komórek śródbłonka i transportu komórek immunologicznych lub nowotworowych10. Jednak systemy te są mniej odpowiednie do odzyskiwania dużej liczby komórek9. Zarówno lepkościomierz stożkowo-płytkowy, jak i komory przepływowe z płytką równoległą umożliwiają odzyskiwanie dużej liczby komórek w konfluentnych monowarstwach12. Systemy te mogą generować szereg sił tnących i wzorców12. Komora przepływu równoległego z płytą assembly9 ma tę zaletę, że obrazowanie w czasie rzeczywistym może być wykonywane przez szklane okno w celu oceny morfologii komórki w dowolnym punkcie czasowym. Ponadto perfuzat może być zbierany w sterylnych warunkach. W przypadku prezentowanego tutaj systemu przepływ może być również monitorowany w czasie rzeczywistym i w konfiguracji wielokomorowej, co ułatwia utrzymanie warunków ścinania między komorami.

Dla reprezentatywnych eksperymentów, używane są ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które reprezentują typ komórek śródbłonka makronaczyniowego, a warunki naprężenia ścinającego, których używamy (1 Pa), odzwierciedlają warunki tętnicze (0,1 - 0,7 Pa). Jednak protokół ten może być stosowany z innymi typami komórek śródbłonka, a warunki naprężeń ścinających można dostosować zgodnie z pytaniem eksperymentalnym. Na przykład ocena ludzkich komórek śródbłonka w warunkach, które modelują krążenie żylne, wymagałaby niższych poziomów naprężeń ścinających (1 - 6 Pa), a badania modelujące krążenie mikronaczyniowe wykorzystały poziomy naprężeń ścinających 0,4 - 1,2 Pa13,14. Ponadto naprężenie ścinające może się różnić nawet między komórkami śródbłonka w tym samym naczyniu krwionośnym6. W obecnej konfiguracji stosowany jest pojedynczy system monitorowania, który może jednocześnie monitorować cztery oddzielne pętle przepływu. W przypadku laboratoriów, które potrzebują więcej pętli przepływu, w dedykowanym środowisku jest miejsce na dodatkowy system monitorowania.

RT-qPCR służy do bezwzględnego oznaczania ilościowego ekspresji genów w warunkach naprężenia ścinającego. Względna ekspresja genów docelowych jest często wykorzystywana do porównywania ekspresji RNA w różnych warunkach. Niektóre gatunki RNA mogą występować w bardzo małych ilościach lub być nieobecne, co komplikuje względne pomiary. Na przykład, długie niekodujące RNA w komórkach śródbłonka mogą wywierać silne efekty przy stosunkowo niskiej liczbie kopii na komórkę5. Ponadto różnice w wydajności startera mogą prowadzić do niedokładnej interpretacji wynikającej z zastosowania metody progu cyklu delta-delta (Ct) do analizy danych. Aby rozwiązać ten problem, przeprowadzamy bezwzględną ocenę ilościową, generując krzywą wzorcową przy użyciu znanej ilości plazmidowego DNA. Co więcej, komplementarna synteza DNA (cDNA) jest procesem nieefektywnym, a różnice w wydajności cDNA mogą odpowiadać za różnice w ekspresji RNA między warunkami i między próbkami15. Zastosowanie odczynników do naprężeń ścinających i/lub transfekcji może wpływać na proliferację, apoptozę i żywotność komórek lub dodawać składniki, które mogą zakłócać izolację RNA i/lub syntezę cDNA. Aby uwzględnić możliwość błędu systematycznego wynikającego z izolacji RNA i syntezy cDNA, używamy kontroli impulsowego RNA zsyntetyzowanego w laboratorium, dodanego w czasie ekstrakcji RNA i mierzonego przy każdej syntezie cDNA za pomocą RT-qPCR. Pozwala to nie tylko na dostosowanie się do różnic technicznych w ekstrakcji RNA i syntezie cDNA, ale także na obliczenie bezwzględnych ilości na komórkę, gdy znana jest liczba komórek.

Ten system wykorzystuje dodatkowe kroki, aby zachować podobieństwo lub uwzględnić techniczne różnice między warunkami. Kładziemy szczególny nacisk na te etapy ze względu na złożony charakter tych eksperymentów, które obejmują wiele układów fizycznych i warunków eksperymentalnych, które mogą prowadzić do zmienności eksperymentalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie egzogennego RNA referencyjnego

UWAGA: Należy wybrać egzogenne referencyjne RNA, które nie występuje u badanego gatunku lub modelu. W przypadku systemów ssaków można zastosować RNA lucyferazy świetlika.

  1. Linearyzacja plazmidu z egzogennym RNA referencyjnym
    1. Przygotuj egzogenne RNA referencyjne co najmniej 48 h przed planowaną ekstrakcją RNA. Pozyskaj lub wytwórz klon cDNA wybranego egzogennego RNA referencyjnego, np. klon cDNA lucyferazy świetlika w wektorze plazmidowym odpowiednim dla in vitro transkrypcja (patrz Tabela materiałów).
    2. przeprowadź trawienie enzymem restrykcyjnym (RE) 1 µg pełnego plazmidu (plazmidem lucyferazy świetlikowej jest pSP-luc+, który ma 4100 bp) przy użyciu enzymu RE tnącego w jednym miejscu (XhoI) w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Należy wybrać enzym restrykcyjny (RE), który jest pojedynczym przeciącie (przecina plazmid tylko raz) na końcu 3’ egzogennej referencyjnej sekwencji RNA i pozostawia nawis 5’ lub koniec tępy. W typowym przygotowaniu należy przeprowadzić siedem reakcji linearyzacji plazmidu (kroki 1.1.4–1.1.7) równolegle, aby uzyskać odpowiednie stężenie i ilość RNA niezbędne do przeprowadzenia jednego zestawu eksperymentów lub jednego projektu.
      1. Zmierz stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometrii lub spektrofluorometrii.
      2. Przygotować mieszaninę RE w każdej probówce: dodać 4 µL z XhoI (20 000 j/ml), 8 µL buforu RE, x µL plazmidu (1 µg), oraz wystarczającą ilość H2Aby uzyskać całkowity roztwór o stężeniu 80 µL.
      3. Inkubować mieszaninę RE przez 2 h w temperaturze 37 °CNależy stosować enzym restrykcyjny zgodnie z protokołem producenta, ponieważ jakiekolwiek modyfikacje mogą prowadzić do zwiększenia aktywności star lub niespecyficznego cięcia docelowego DNA. Mieszaninę reakcyjną należy inaktywować termicznie przez 20 min w temperaturze 65 °C.
      4. Przerwij trawienie RE poprzez wytrącanie etanolem w każdej probówce. Do mieszaniny RE dodaj bezpośrednio 4 µL 0,5 M EDTA o pH 8,0, 8 µL 3 M octanu sodu o pH 5,2 oraz 184 µL 100% etanolu. Dobrze wymieszać i zamrozić mieszaninę w temperaturze -20 °C przez 30 min.
      5. Odwirować mieszaninę przy 4 °C przez 20 min przy względnej sile odśrodkowej (RCF) wynoszącej 16 100 x g g.
      6. Usunąć nadkład z użyciem końcówki o małej średnicy, nie dotykając osadu. Suszyć osad na powietrzu przez 5 min, a następnie resuspender go w 6 µL z H2O (podgrzane do 37 °C) poprzez 5–10-krotne pipetowanie w górę i w dół.
      7. Potwierdź linearyzację plazmidu lucyferazy, przeprowadzając elektroforezę produktu trawienia na 2% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny (EtBr), wraz z markerem 1 kb+, markerem superzwiniętym oraz plazmidem ciętym i nieciętym. Przeanalizuj żel i przejdź do in vitro transkrypcji, jeśli w ścieżce dla przeciętego plazmidu widoczny jest pojedynczy prążek o wielkości ~4 kb (plazmid nieprzecięty będzie posiadał trzy prążki; Rysunek 1).
        OSTRZEŻENIE: EtBr jest rakotwórczy. Pracować w dygestorium chemicznym.
  2. W in vitro transkrypcja egzogennego plazmidu referencyjnego RNA
    1. Dla każdej probówki z produktami trawienia plazmidu należy wykonać in vitro transkrypcja przy użyciu an in vitro metoda transkrypcji (patrz Tabela materiałów). Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta i użyć odpowiedniej polimerazy RNA faga. Jeśli metoda syntezy cDNA wymaga ogona poly(A) lub jeśli inne zastosowania wymagają ogona poly(A), należy wybrać metodę in vitro transkrypcja obejmująca dodanie ogona poli(A)) (patrz Tabela materiałów).
    2. Połącz wszystko in vitro produkty transkrypcji przeniesiono do jednej probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml przed przeprowadzeniem oczyszczania.
  3. Oczyszczanieizolacja RNA z in vitro reakcja transkrypcji
    1. Oczyścić in vitro produkty transkrypcji z in vitro zestaw do oczyszczania transkrypcji (patrz Tabela materiałów). Należy postępować zgodnie z protokołem producenta.
    2. Oceń stężenie RNA, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometrii.
      UWAGA: Stężenie RNA oblicza się zgodnie z prawem Beera-Lamberta. Zgodnie z nim absorbancja kwasów nukleinowych (które silnie absorbują światło przy 260 nm) jest proporcjonalna do ich stężenia. Absorbancja równa 1,0 odpowiada 40 µg/mL jednoniciowego RNA.
  4. Podział zapasu RNA na alikwoty w probówkach do PCR do celów eksperymentalnych
    1. Upewnij się, że stężenie RNA wynosi 1 µg/µL.
      1. Jeśli stężenie RNA wynosi > 1 µg/µLrozcieńczyć roztwór zapasowy do 1 µg/µLAliquotowanie 1 µL do probówek do PCR i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      2. Jeśli stężenie RNA wynosi < 1 µg/µLmożna przeprowadzić dodatkowe wytrącanie z użyciem 5 M octanu amonu (zawartego w zestawie) zgodnie z protokołem producenta. Jeśli stężenie RNA nadal jest < 1 µg/µLnastępnie przystąp do rozdzielania na alikwoty 1 µL do probówek PCR.

2. Powlekanie szkiełek

UWAGA: Kroki od 2.1 do 2.10 należy wykonać 24 – 48 h przed planowanym wysiewem komórek.

  1. Rozgrzej piekarnik do 250 °C.
  2. Używając sterylnych rękawiczek, owiń każde szkiełko przedmiotowe dwukrotnie folią aluminiową. Unikaj bezpośredniego dotykania powierzchni szkiełka.
  3. Wypalaj szkiełka w piekarniku przez 1 h w temperaturze 250 °C, a następnie pozostaw je do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    UWAGA: Krok ten jest istotny dla usunięcia wszelkich zanieczyszczeń endotoksynami.
  4. Podczas stygnięcia szkiełek przygotuj roztwór zapasowy fibronektyny o stężeniu 1 mg/mL w wodzie destylowanej i inkubuj go przez 30 min w 37 °C do całkowitego rozpuszczenia. Przygotuj alikwoty po 100 µL. Odstaw alikwoty do natychmiastowego użycia, a pozostałe zamroź do późniejszego wykorzystania.
  5. Zdejmij zewnętrzną warstwę folii aluminiowej przed umieszczeniem szkiełka przedmiotowego w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Kroki 2.6 - 2.7 oraz 2.9 wykonaj w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  6. Umieść szkiełko przedmiotowe w sterylnej prostokątnej 4-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.
  7. Rozcieńcz roztwór zapasowy fibronektyny w stosunku 1:100 wodą destylowaną. Pokryj każde szkiełko 1 mL rozcieńczonej fibronektyny, nakraplając ją powoli za pomocą pipety. Upewnij się, że całe szkiełko jest pokryte.
  8. Inkubuj szkiełka w inkubatorze do hodowli tkanek w 37 °C przez 24 - 48 h.
  9. Po inkubacji odessaj fibronektynę, przechylając 4-dołkową płytkę do hodowli komórkowej. Unikaj bezpośredniego dotykania szkiełka końcówką aspiratora.

3. Wysiewanie komórek na szkiełka przedmiotowe

  1. Należy policzyć ludzkie komórki śródbłonka na wczesnych pasażach (pasaż 2–5) i wysiać ok. 1,0 x 106 komórek na każdy szkiełko pokrywne pokryte fibronektyną w 1 mL pożywki (1,0 x 106 komórek/mL pożywki). Jeśli nie planuje się żadnych innych zabiegów, komórki należy wysiać 24 h przed planowanym zastosowaniem przepływu laminarnego.
    UWAGA: Wartości te służą jako wytyczne dla eksperymentów z 24-godzinnym przepływem.
    1. Należy dostosować gęstość siewu tak, aby w momencie zbioru komórek i ekstrakcji RNA uzyskać zlewne monowarstwy komórkowe.
  2. Pozostawić komórki do przywarcia do szkiełka przez 15 min w temperaturze 37 °C.
  3. Do każdego dołka naczynia hodowlanego dodać 3 mL pożywki, aby pokryć szkiełko, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 24 h w atmosferze 5% CO2.

4. Transfekcja małymi interferującymi RNA (siRNA)

  1. Przygotowanie komórek na szkiełkach przedmiotowych do transfekcji siRNA i eksperymentów z przepływową cytometrią
    1. Należy postępować zgodnie z protokołem w krokach 2 (powlekanie szkiełek) i 3 (wysiewanie komórek na szkiełka szklane) w celu przygotowania i powlekania szkiełek szklanych do eksperymentów przepływowych.
    2. Wysiać komórki 24 h przed traktowaniem siRNA (48 h przed zastosowaniem przepływu laminarnego).
    3. Wysiać ludzkie komórki śródbłonka w pożywce bez antybiotyków w zagęszczeniu od 750 000 do 1 x 106 liczba komórek na preparas w celu uzyskania 85% – 95% konfluencji następnego dnia.
      UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano komórki HUVEC.
  2. Przygotowanie kompleksów odczynnika do transfekcji na bazie lipidów z siRNA (na jeden preparat)
    1. Zaprojektuj własne siRNA lub zamów gotowe siRNA dla wybranego genu docelowego.
      UWAGA: Poniższe etapy należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Dodaj 6 µL siRNA (20 µM roztwór zapasowy) w 414 µL z pożywki z obniżoną zawartością surowicy (patrz Tabela materiałów) i delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie.
    3. Rozcieńczyć 49.5 µL delikatnie wymieszanego odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (patrz Tabela materiałóww 130.5 µL z pożywki z obniżoną zawartością surowicy.
    4. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    5. Połączyć rozcieńczone siRNAs z reagentem do transfekcji na bazie lipidów, delikatnie wymieszać i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej. Mieszać delikatnie, aby uniknąć rozbicia kompleksów reagentu do transfekcji na bazie lipidów.
      UWAGA: Roztwór może stać się mętny w miarę tworzenia się kompleksów.
    6. Podczas formowania się kompleksów usunąć pożywkę wzrostową i wypłukać komórki jednokrotnie pożywką z obniżoną zawartością surowicy.
    7. Do każdego preparatu dodaj 2,4 ml medium z redukcją surowicy.
    8. Dodaj 600 µL do każdej płytki delikatnie wymieszane kompleksy odczynnika do transfekcji na bazie lipidów z siRNA, a następnie kołysz płytką w przód i w tył, aby wymieszać zawartość. Należy upewnić się, że końcowe stężenie siRNA wynosi 40 nM. Należy upewnić się, że szkiełko jest całkowicie pokryte.
    9. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 4 h.
    10. Dodać 1 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka bez antybiotyków, zawierającej trzykrotną normalną koncentrację płodowej surowicy bydlęcej (FBS), nie usuwając mieszaniny do transfekcji.
    11. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C do momentu użycia.

5. Obliczanie natężenia przepływu na podstawie pożądanego naprężenia ścinającego9

  1. Oblicz szybkość przepływu na podstawie pożądanych naprężeń ścinających zgodnie z poniższym równaniem:
    Wzór dynamiki płynów Q=τwh²/6μ do obliczania szybkości przepływu, reprezentacja równania.
    Gdzie:
    Q to szybkość przepływu w mL/min;
    τ to pożądane naprężenie ścinające w dynes/cm2 (1 Pa = 10 dynes/cm2);
    w to szerokość komory przepływowej z równoległymi płytkami w cm;
    h to wysokość komory przepływowej z równoległymi płytkami w cm;
    µ to lepkość medium w cP (g/cm·s).
    UWAGA: Typowe eksperymenty z laminarnym naprężeniem ścinającym (niepulsacyjne) w tym protokole są prowadzone przy τ = 1 Pa (10 dynes/cm2). Wartość µ można zmierzyć za pomocą wiskozymetru, np. wiskozymetru stożkowo-płaskiego; może ona różnić się w zależności od składu medium, w tym zawartości surowicy i dodatkowego dekstranu9.
  2. Aby uzyskać konkretną wartość τ (naprężenia ścinającego), dostosuj szybkość przepływu i/lub lepkość. Przy wyższych szybkościach przepływu komórki adherentne mogą odkleić się od szkiełka. Przykładowe szybkości przepływu dla typowych komór przepływowych przedstawiono w Tabeli 1.

6. Przygotowanie dedykowanego środowiska dla systemu monitorującego i wielu równoległych komór przepływowych (Rysunek 2)

  1. Użyj dużej jednostki grzewczej/inkubatora z wieloma półkami, wewnętrznym dostępem do energii elektrycznej oraz szklanymi drzwiami — zwanego BEACH (Built-in Environment with Adjustable CO2 and Heat) — aby jednocześnie pomieścić wiele komór przepływowych w eksperymentach wymagających zarówno naprężenia ścinającego, jak i bezpośredniego porównania między dwiema lub więcej próbami lub wynikami (t.j. DNA, RNA i białkiem).
    UWAGA: BEACH umożliwia częste monitorowanie obwodu przepływowego, w tym szybkości przepływu, bez częstego zakłócania warunków środowiskowych.
  2. Upewnij się, że do eksperymentu dostępna jest odpowiednia ilość CO2 i że monitor CO2 jest sprawny. Upewnij się, że tacka z wodą jest odpowiednio napełniona, aby zapewnić wilgotne powietrze.

7. Konfiguracja aparatury do przepływu między równoległymi płytkami

UWAGA: W celu wykonania równoległych płytek należy zapoznać się z publikacją Lane et al.9.

  1. Zautoklawować płytki komory przepływowej, zbiornik, tłumik, rurki oraz końcówki Luera dla każdego zestawu komory przepływowej z płytami równoległymi, zgodnie z instrukcjami w Tabela 2.
  2. Konfiguracja zestawu pętli przepływowej (rycina 3).
    1. Umieść sterylne ręczniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Złóż układ pętli przepływowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, początkowo bez komory przepływowej z równoległymi płytkami.
    2. Podłącz zestaw przewodów do zbiornika:
      1. Wprowadź sztywną rurkę nr 14 do jednego otworu oraz dwie miękkie rurki nr 14 do dwóch pozostałych otworów w zakrętce zbiornika przepływowego. Upewnij się, że jedna z miękkich rurek dotyka dna zbiornika, gdy odpływ przewody.
      2. Na końcu twardej rurki nr 14 należy umieścić męski konektor Luer 1/16” i podłączyć sterylny filtr pełniący funkcję odpowietrznika.
      3. Umieść żeński konektor Luer o średnicy 1/16" na końcu miękkiego przewodu nr 14 przepływ dopływowy rurkę wychodzącą z rezerwuaru i podłączyć 4-drożny kurek.
        UWAGA: W przypadku analizy ekspresji genów lub innych badań, w których nie ma potrzeby zbierania perfuzatów, w niniejszym protokole zamiast kurków trójdrożnych można zastosować kurki dwudrożne.
      4. Na końcu miękkiego przewodu odpływowego nr 14, prowadzącego z zbiornika, należy umieścić męski konektor Luer o średnicy 1/16”.
    3. Połącz rurkę odpływową zbiornika z rurką pompy: na obu końcach sztywnej rurki nr 13 (rurki pompy) umieść złącze Luer żeńskie 1/16”. Połącz miękką rurkę odpływową nr 14 ze zbiornika z sztywną rurką nr 13, łącząc ze sobą złącza Luer męskie i żeńskie 1/16”.
    4. Połącz przewód pompy z przewodem „mostka tłumiącego”: na obu końcach miękkiej rurki nr 16 umieść męski łącznik Luer 1/8” oraz żeński łącznik Luer 1/8”. Połącz żeński łącznik Luer 1/16” twardej rurki nr 13 (znajdującej się na wylocie przewodu pompy) z męskim łącznikiem Luer 1/8” miękkiej rurki nr 16.
    5. Zmontuj przewody do tłumika przepływu: umieść męski konektor Luer 3/16” na jednym końcu miękkiego przewodu nr 25 i powtórz tę czynność dla drugiej strony tłumika przepływu. Podłącz wolne końce miękkich przewodów nr 25 do każdej z obu stron tłumika przepływu.
    6. Połącz przewody „mostka tłumiącego” z przewodami tłumika przepływu: podłącz miękki przewód nr 25 z tłumika przepływu do miękkiego przewodu nr 16 „mostka tłumiącego”, używając żeńskiego złącza Luer 1/8” po stronie „mostka tłumiącego” nr 16 oraz wcześniej umieszczonego męskiego złącza Luer 3/16” po stronie miękkiego przewodu tłumika nr 25.
    7. Zmontuj rurki „mostka komory”:
      1. Zamocuj złączkę Luer żeńską 1/8” oraz złączkę Luer męską 1/8” na każdym końcu miękkiej rurki nr 16 (rurka stanowiąca „mostek komory”).
      2. Połącz żeński złącz Luer 1/8” „mostka komory” (chamber bridge) z męskim złączem Luer 3/16” w miękkim przewodzie nr 25 znajdującym się na wolnym końcu tłumika przepływu.
      3. Na końcówce 1/8” z męskim złączem Luer (wolny koniec) przewodu „mostka komory” (chamber bridge) zamontuj 4-drożny kranik.
    8. Połącz 4-drogowy kurek z wolnego końca „mostka komory” z 4-drogiem kurkiem z miękkiego przewodu dopływowego zbiornika (z kroku 7.2.2.3). Zamknij kurki.
    9. Napełnić zbiornik i tłumik pożywką. Dla 48-godzinnej ekspozycji na naprężenia ścinające należy dodać 35 ml pożywki do zbiornika i 25 ml do tłumika. Objętość pożywki należy dostosować do czasu trwania eksperymentu przepływowego oraz liczby wysianych komórek.
    10. Przenieś zmontowany układ obiegu do pompy w sekcji BEACH. Umieść sztywną rurkę nr 13 (przewód pompy) w głowicy pompy i zabezpiecz ją. Otwórz kurki.
    11. Włącz pompę i powoli zwiększaj jej prędkość. Pozostaw medium do cyrkulacji w układzie zamkniętym. Sprawdź, czy nie występują żadne wycieki lub zatory (np., wzrost ciśnienia). Upewnij się, że medium przepływa z powrotem do zbiornika.
  3. Konfiguracja zestawu komory przepływowej
    1. Umieść żeński złącz Luer 1/8” na jednym końcu miękkiej rurki nr 16 i podłącz kurek trójdrożny (4-drożny). Wolny koniec rurki podłącz do prawidłowo bok górnej płyty (przepływ dopływowy strona).
    2. Na jednym końcu miękkiego wężyka nr 16 umieść męski konektor Luer 1/8” i podłącz 4-drożny kurek. Wolny koniec wężyka podłącz do lewo bok górnej płyty (odpływ stronę).
    3. Na końcach miękkiego wężyka o rozmiarze #16 (przewodu do pułapki pęcherzykowej) zamocuj męski konektor Luer 1/8” oraz żeński konektor Luer 1/8”. Podłącz wężyk do pułapki pęcherzykowej. poprzez męski konektor Luer 1/8”. Do drugiego końca rurki należy przymocować 4-drogowy kurek. poprzez żeński łącznik Luer 1/8”.
    4. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś szkiełko przedmiotowe z zasianymi komórkami z 4-dołkowej płytki hodowlanej do wgłębienia w płycie dolnej. Upewnij się, że strona szkiełka z zasianymi komórkami jest skierowana do góry.
    5. Za pomocą strzykawki 10 ml należy dodać 10 ml ciepłej pożywki do dolnej płytki, w obrębie czerwonej linii uszczelki wokół płytki. Pozostawić pożywkę, aby przepłynęła przez szkiełko i pokryła komórki. Należy unikać dodawania pożywki bezpośrednio na szkiełko.
    6. Ostrożnie nałóż górną płytkę na dolną, dopasowując je od jednej do drugiej strony. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Mocno skręć obie płytki.
    7. Usuń pęcherzyki powietrza z pułapki pęcherzykowej, otwierając kranik po prawej stronie (wlot) płytki i delikatnie przepłukując układ 20 ml ciepłego medium za pomocą strzykawki 30 ml. Upewnij się, że kranik po lewej stronie (wylot) płytki jest zamknięty, a medium przepływa przez otwarty kranik pułapki pęcherzykowej. Odrzuć użyte do przepłukania medium.
    8. Zamknij kran w pułapce pęcherzykowej i otwórz kran po lewej stronie (odpływ) komory. Podnieś lewą stronę (odpływ) komory do 45° pod kątem i delikatnie przepłucz komorę, wprowadzając 20 mL ciepłego medium za pomocą strzykawki 30-ml z prawej strony (wlotu), aby usunąć pęcherzyki powietrza z komory. Pęcherzyki można obserwować przez okno. Odrzuć użyte medium.
    9. Zamknij kurki po obu stronach komory oraz korek. Poddaj komórki inspekcji mikroskopowej.
    10. Przenieś komorę do urządzenia BEACH wraz z wcześniej zmontowanym systemem pętli.
    11. Powoli zmniejsz prędkość pompy, a następnie ją zatrzymaj. Zamknij kurki w układzie przepływowym, aby zapobiec wyciekom.
    12. Połącz komorę z systemem pętli poprzez kurki. Otwórz wszystkie kurki.
    13. Powoli zwiększaj prędkość pompy i sprawdź, czy w układzie nie ma wycieków ani zatorów. Upewnij się, że pożywka krąży w jednym kierunku i wraca do zbiornika.
    14. Umieść czujnik przepływu na przewodzie „mostka komory” (chamber bridge) znajdującym się po stronie dopływu do komory. Upewnij się, że czujnik jest odpowiednio zorientowany zgodnie z kierunkiem przepływu.
    15. Należy dostosować prędkość pompy, aby uzyskać przepływ obliczony wcześniej na podstawie pożądanych naprężeń ścinających.
      UWAGA: Prędkość przepływu może się różnić w zależności od wysokości i szerokości każdej komory, a także od lepkości pożywki.
    16. Włącz CO22 zbiornik w celu uzyskania 5% CO22 i umieść tackę z wodą wewnątrz urządzenia BEACH.

8. Zbiór komórek i ekstrakcja RNA z komory przepływowej

  1. Po upływie pożądanego czasu przepływu powoli zmniejszyć prędkość pompy perystaltycznej do 0 i wyłączyć zasilanie. Szybko zamknąć wszystkie otwarte kurki i wyjąć komorę wraz z dołączonymi przewodami zakończonymi kurkami z obu stron.
  2. Przenieść komorę na czysty blat laboratoryjny i ostrożnie wykręcić wszystkie śruby, aby zdjąć górną płytkę. Za pomocą pęsety typu needle-nose wyjąć szkiełko z dolnej płytki i umieścić je w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm.
  3. Przemyć szkiełko 10 mL zimnego roztworu soli fosforanowo-buforowej (PBS) -/- i sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich przyleganie oraz orientację w kierunku przepływu.
  4. Odssać PBS z naczynia i przenieść szkiełko do czystego naczynia o średnicy 100 mm. Na szkiełko nanieść 350 µL buforu lizującego z zestawu do ekstrakcji RNA (patrz Tabela materiałów), zawierającego 1/100 beta-merkaptoetanolu.
    OSTROŻNIE: Beta-merkaptoetanol należy dodawać w dygestorium chemicznym.
  5. Zeskrobać komórki ze szkiełka za pomocą skrobaka do komórek z polietylenowym ostrzem. Przechylić naczynie do hodowli tkankowej, aby ciecz zebrała się na dnie, i wyjąć szkiełko pęsetą. Przenieść lizat komórkowy pipetą do probówki 1,5-mL i przechowywać w lodzie.
  6. Przed dodaniem do próbki rozcieńczyć zapasowy egzogenny RNA referencyjny (RNA lucyferazy) do stężenia 0,0025 ng/µL poprzez rozcieńczenia seryjne. Na przykład, jeśli stężenie zapasowe wynosi 1 µg/µL, wymagane jest rozcieńczenie 1/400 000, aby uzyskać 0,0025 ng/µL. Do każdej próbki lizatu komórkowego dodać 10 µL rozcieńczonego RNA lucyferazy w celu późniejszej izolacji i analizy RNA.
  7. Przeprowadzić protokół ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta lub zamrozić lizat w temperaturze -80 °C do czasu przystąpienia do ekstrakcji.

9. Obliczenie wydajności ekstrakcji RNA i syntezy cDNA

UWAGA: Oblicz wydajność lucyferazy po RT-qPCR, porównując wydajność teoretyczną z wydajnością eksperymentalną.

  1. Wyznacz teoretyczną wydajność dla RNA lucyferazy.
    1. Wyznacz całkowitą liczbę kopii lucyferazy dodanych do każdej próbki. (Dodanie 0,025 ng/próbkę = 2,73 x 107 kopii RNA lucyferazy na próbkę przed ekstrakcją RNA.)
    2. Oblicz masę cząsteczkową RNA lucyferazy, przyjmując średnią masę cząsteczkową jednego nukleotydu równą 330 g/mol i mnożąc ją przez długość RNA lucyferazy świetlika, która wynosi 1652 nukleotydów.
    3. Podziel ilość dodanego RNA lucyferazy (0,025 ng) dla każdej próbki przed ekstrakcją RNA przez masę cząsteczkową, aby otrzymać ilość molową. Następnie pomnóż wynik przez liczbę Avogadra, aby wyznaczyć liczbę kopii dodanych do próbki.
    4. Oblicz teoretyczną wydajność dla kopii lucyferazy dla każdej reakcji RT-qPCR, korzystając z równania:
      Wzór na kwantyfikację RNA dla syntezy cDNA, równanie stosowane w analizie ekspresji genów.
  2. Oblicz wydajność eksperymentalną dla kopii lucyferazy dla każdej reakcji RT-qPCR, wykorzystując plazmid lucyferazy do wygenerowania krzywej standardowej dla RT-qPCR.
  3. Oblicz wydajność lucyferazy (%) korzystając z równania:
    Wzór na wydajność lucyferazy, równanie do obliczania procentowej wydajności eksperymentalnej w badaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłową linearyzację plazmidu lucyferazy za pomocą enzymów restrykcyjnych potwierdzono, przeprowadzając elektroforezę produktów trawienia na żelu agarozowym (Rysunek 1). Wielkość zlinearyzowanego produktu potwierdzono przy użyciu markerów DNA oraz poprzez porównanie z nieprzeciętym plazmidem.

Zaadaptowaliśmy układ komory przepływowej z równoległymi płytkami opracowany przez Lane et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Naprężenie ścinające jest stanem fizjologicznym, który moduluje funkcję śródbłonka, częściowo wpływając na ekspresję genów w stanie ustalonym 2,5. Modele regulacji genów w różnych warunkach naprężeń ścinających przyczynią się do lepszego zrozumienia funkcji śródbłonka. Ten pragmatyczny przepływ pracy obejmuje obwód przepływu wykorzystujący komorę przepływową z równoległą płytą, zaadaptowaną z Lane i wsp.9 i reprezentuje laminarny,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez CIHR MOP 142307 P.A.M. H.S.J.M. jest laureatem Programu Szkoleniowego Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem w zakresie Medycyny Regeneracyjnej. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. i M.K.D. są laureatami stypendiów dla absolwentów Queen Elizabeth II w dziedzinie nauki i technologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsin-EDTAgibco25300-062
10 ml StrzykawkaBD302995
10 mm2 Naczynie hodowlaneSarstedt83.3902
30 mL StrzykawkaBD302832
4-drogowe kurkiDiscofixD500
Folia aluminiowa
PLAŻADarwin Chambers CompanyMN: HO85, SN:
Miernik
MN: P120, SN: 0342
Czujnik CO2BioSphenix, Ltd.MN: C700, SN: 52852
Woda destylowanagibco15230-170
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) -/-gibco14190-144
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2Promo CellC-22011
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2 Mieszanka suplementówPromo CellC-39216
Fibronektyna (czysta)Filtr11051407001
(0,20 um)Sarstedt83.1826.001
Tłumik przepływu i nasadkaU z T, dmuchalnia
Przepływomierz: Konsola serii 400Transonic Scisense Inc.T402
: Rurki serii 400Transonic Scisense Inc.TS410
Zbiornik przepływu i nasadkaU dmuchalni
T Czujnik przepływuTransonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F PiekarnikFisher ScientificFI-737F
J ŚciereczkaJ Szkiełko
mikroskopowe (25 x 75 x 1 mm)Fisherfinest12-544-4
Papierowa torba do sterylizacjiCardinal Health92713
Pompa (Masterflex L/S Economy Drive)Cole-Parmer7554-90
Głowica pompy (Masterflex L/S Easy Load)Cole-Parmer7518-00
Prostokątna 4-dołkowa
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>Rurki
Masterflex C-Flex L/S 25 Miękki przewódCole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Miękki przewódCole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Miękki przewódCole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 TwardyCole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Twarde dętkiCole-Parmer06508-14
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Luer
3/16" Męski LuerCole-Parmer45518-08Do węży #25
1/8" męski LuerCole-Parmer30800-24Do rurki #16
1/8" żeński LuerCole-Parmer30800-08Do rurki #16
1/16" męski LuerCole-Parmer45518-00Do rurki #14
/16" żeński LuerCole-Parmer45508-00Do rurki #14
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Knockdown odczynniki
OligofectaminaInvitrogen12252-011
Opti-MEM I Zredukowana surowicaśrednia gibco31985-070
Nazwa< strong>CompanyNumer katalogowyUwagi
>In vitro transkrypcja
Generuler 1kb+ drabinka DNAThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiAmbionAM1340
pSP-luc+PromegaE4471
Supercoiled DNA LadderNew England BioLabs Inc.N0472S
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500
UltraPure Ethidium BromekInvitrogen15585011
XhoI enzym restrykcyjnyNew England BioLabs Inc.R0146S
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RNA ekstrakcja
Beta-merkaptoetanolSigmaM3148-100mL
RNeasy Mini KitQiagen74104
Skrobaki do komórek 4947549 CO BioSphenix, Ltd.Sigma-AldrichszkłaPrzepływomierz szkła pęseta do 267061 Thermo Scientific przewód 1

Bibliografia

  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  3. Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  4. Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
  5. Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
  6. Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  7. Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645(2015).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  9. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349(2012).
  10. Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
  11. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
  12. Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
  13. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  14. DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20(2017).
  15. Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
  16. Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
  17. Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
  18. Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984(2014).
  19. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
  20. Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komora przep ywowa z r wnoleg ymi p ytkamiprzep yw laminarnyegzogenne RNA referencyjneekstrakcja RNAilo ciowa PCR w czasie rzeczywistymmonitorowanie szybko ci przep ywuadhezja kom rkowa
Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.