Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58487

⸱

7 stycznia 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Streszczenie

Homeostaza chrząstki stawowej zależy od żywotności rezydujących komórek (chondrocytów). Niestety, uraz mechaniczny może wywołać rozległą śmierć chondrocytów, potencjalnie prowadząc do nieodwracalnego rozpadu stawu i wystąpienia choroby zwyrodnieniowej stawów. Ponadto utrzymanie żywotności chondrocytów jest ważne w zabiegach przeszczepów chrzęstnoszkieletowych w celu uzyskania optymalnych wyników chirurgicznych. Przedstawiono metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/obumarcia komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych mysich stawów maziowych po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być stosowana w badaniach porównawczych w celu zbadania wpływu różnych schematów obciążenia mechanicznego, różnych warunków środowiskowych lub manipulacji genetycznych, a także różnych etapów degeneracji chrząstki na krótko- i/lub długoterminową podatność chondrocytów stawowych in situ. Celem protokołu przedstawionego w pracy jest ocena przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej mysich stawów maziowych. Co ważne, metoda ta umożliwia badanie na całkowicie nienaruszonej chrząstce bez naruszania natywnych warunków brzegowych. Co więcej, pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym żywotnie zabarwionych chondrocytów stawowych oraz analizę uszkodzeń komórek wywołanych przez zastosowanie kontrolowanych schematów obciążenia statycznego i udarowego, opartego na pojedynczym obrazie. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że w zdrowych eksplantatach chrząstki przestrzenny zakres uszkodzenia komórek zależy w dużej mierze od wielkości obciążenia i intensywności uderzenia. Nasza metoda może być łatwo dostosowana do badania wpływu różnych schematów obciążenia mechanicznego, różnych warunków środowiskowych lub różnych manipulacji genetycznych na mechaniczną podatność chondrocytów stawowych in situ.

Wprowadzenie

Chrząstka stawowa (AC) to nośna tkanka, która pokrywa i chroni kości w stawach maziowych, zapewniając płynną artykulację stawów. Homeostaza tkanek zależy od żywotności chondrocytów, jedynego typu komórek znajdujących się w AC. Jednak narażenie chrząstki na ekstremalne siły spowodowane urazem (np. upadki, wypadek samochodowy lub urazy sportowe) lub z powodu pourazowej niestabilności stawu może wywołać śmierć chondrocytów, prowadząc do nieodwracalnego rozpadu stawu (choroba zwyrodnieniowa stawów)1. Ponadto w procedurach przeszczepu kostno-chrzęstnego, które mają na celu naprawę miejscowych ubytków w uszkodzonej chrząstce, uraz mechaniczny związany z wprowadzeniem przeszczepu zmniejsza żywotność chondrocytów i ma szkodliwy wpływ na wyniki chirurgiczne2.

Modele eksplantatów chrząstek są powszechnie używane do badania podatności chondrocytów stawowych na mechanicznie wywołaną śmierć komórki. Modele te zazwyczaj wykorzystują eksplantaty od dużych zwierząt do badania wpływu warunków obciążenia, warunków środowiskowych i innych czynników na podatność komórek3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Jednak ze względu na duży rozmiar połączeń natywnych, modele te na ogół wymagają usunięcia czopa z powierzchni stawowej nienaruszonego złącza, co narusza natywne warunki brzegowe. Co więcej, na ogół wymagają zastosowania dużych obciążeń mechanicznych w celu wywołania uszkodzenia komórek. Alternatywnie, modele eksplantatów chrząstki mysiej mają kilka zalet w porównaniu z większymi modelami zwierzęcymi w badaniu mechanicznej wrażliwości chondrocytów in situ. W szczególności, ze względu na mniejsze wymiary, modele te ułatwiają badanie w pełni nienaruszonej chrząstki stawowej bez zmiany natywnej integralności tkanki. Ponadto obciążenie chrząstki mysiej następuje na małych obszarach kontaktowych, tak że śmierć/uszkodzenie chondrocytów może być wywołane małymi obciążeniami (<1 N). Wreszcie, genomem myszy można łatwo manipulować, co umożliwia badanie, w jaki sposób określone geny wpływają na podatność chondrocytów in situ na uszkodzenia mechaniczne.

Ogólnym celem metody przedstawionej w tym manuskrypcie jest ilościowe określenie i wizualizacja - w czasie rzeczywistym - przestrzennego zasięgu śmierci/uszkodzenia komórek in situ z powodu zastosowanych obciążeń mechanicznych na całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki na kości myszy in vitro. Metoda ta wymaga starannego wypreparowania stawów maziowych myszy bez uszczerbku dla żywotności chondrocytów, a następnie przeprowadzenia testów mechanicznych żywotnie barwionych eksplantatów za pomocą urządzenia zamontowanego pod mikroskopem, podobnego do platformy testowej, którą niedawno opracowaliśmy w celu ilościowego określenia właściwości mechanicznych chrząstki myszy16. Podczas badań mechanicznych duża część (nienaruszonej) powierzchni stawowej wypreparowanej kości jest widoczna na pojedynczym mikrozdjęciu fluorescencyjnym, co umożliwia szybką analizę żywotności komórek po przyłożeniu obciążenia. Podobna analiza żywotności komórek powierzchniowych w eksplantatach chrząstki myszy została przeprowadzona wcześniej, ale bez jednoczesnego zastosowania load17. Potencjalne zastosowania naszej metody obejmują badania porównawcze mające na celu zbadanie podatności chondrocytów stawowych na różne kontrolowane warunki środowiskowe i mechaniczne, a także badania przesiewowe terapii mających na celu zmniejszenie wrażliwości chondrocytów na obciążenia mechaniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester.

1. Rozwiązania

  1. Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka (1X HBSS) zawierający wapń, magnez i bez czerwieni fenolowej. Dostosuj pH do 7,4, dodając niewielkie ilości HCl lub NaOH.
  2. Dostosuj osmolarność do 303 mOsm, dodając NaCl lub wodę dejonizowaną. Używaj bufora podczas preparacji, przygotowania próbki i badań mechanicznych.

2. Rozwarstwienie dystalnej kości udowej i bliższej kości ramiennej z całkowicie nienaruszoną chrząstką stawową

  1. Poddać mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi za pomocą komory inhalacyjnej CO2 , a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Przestrzegaj zasad aseptyki przez cały czas.
    UWAGA: Można używać myszy w wieku od 8 do 81 tygodni dowolnego szczepu i płci.
  2. Do sekcji należy używać następujących narzędzi chirurgicznych: mikronożyczki (używane do wykonywania nacięć), standardowe nożyczki preparacyjne (używane do cięcia kości), skalpel z ostrzem skalpela #11 (używany do cięcia tkanek miękkich), kleszczyki jubilerskie (używane do usuwania tkanek miękkich) i standardowe kleszczyki (używane do obierania tkanek miękkich i skóry).
  3. W przypadku rozwarstwienia dystalnej części kości udowej postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami.
    1. Ustaw mysz w pozycji leżącej.
    2. Wykonaj małe (~5 mm) nacięcie w skórze w przedniej części kolana.
    3. Przedłuż nacięcie dookoła kolana i odciągnij skórę, aby odsłonić staw kolanowy i mięśnie nóg.
    4. Zaczynając od bliższego końca kości udowej, użyj ostrza skalpela (#11), aby ciąć wzdłuż kierunku dystalnej. Umieść ostrze między jednostką mięśnia czworogłowego i ścięgna a przednią stroną trzonu kości udowej. Przedłuż cięcie w kierunku i obok rzepki, a zakończ przecinając środek ścięgna rzepki, usuwając w ten sposób jednostkę mięsień czworogłowy-ścięgno.
    5. Zaczynając od bliższego końca kości udowej, użyj ostrza skalpela (#11), aby ciąć wzdłuż kierunku dystalnej. Umieść ostrze między jednostką mięśniowo-ścięgnistą ścięgna ścięgna podkolanowego a tylną stroną trzonu kości udowej. Gdy nacięcie zbliży się do stawu kolanowego, zacznij przecinać tkankę miękką, unikając kontaktu skalpela z powierzchnią stawową na dystalnych kłykciach kości udowej. Zakończ cięcie za stawem kolanowym.
    6. Odciągnij mięśnie czworogłowe i ścięgna podkolanowe, aby odsłonić kość udową. Odetnij nadmiar mięśni po bocznej i przyśrodkowej stronie kości udowej.
    7. Przetnij mięsień łydki po tylnej stronie bliższej części kości piszczelowej i odwróć nogę, aby uwidocznić tylną stronę kości udowej.
    8. Odsłoń dystalne kłykcie kości udowej i tylną powierzchnię bliższej kości piszczelowej, usuwając nadmiar tkanki wokół stawu kolanowego.
    9. Przeciąć więzadła krzyżowe przednie i tylne za pomocą skalpela, odcinając od kłykci kości udowej. Odciągnij kość piszczelową od kości udowej i odetnij wszystkie więzadła, aby oddzielić dolną część nogi od kości udowej.
    10. Za pomocą standardowych nożyczek preparacyjnych przeciąć kość udową na bliższym końcu kości (8 mm powyżej stawu piszczelowo-udowego) od strony bocznej. Po przecięciu kości należy zetrzeć widoczny szpik na zewnątrz kości, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia komórkami szpiku kostnego.
      UWAGA: Cięcie od strony bocznej zmniejsza ryzyko rozprzestrzeniania się pęknięć wzdłuż kości.
    11. Usuń otaczające tkanki miękkie (tj. więzadła i nadmiar mięśni) z kości udowej za pomocą kleszczy jubilerskich i odsłoń chrząstkę na obu kłykciach na dystalnym końcu kości udowej. Unikaj kontaktu chrząstki z kleszczami.
  4. W przypadku sekcji kości ramiennej postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami.
    1. Ustaw mysz w pozycji leżącej.
    2. Wykonaj nacięcie (~5 mm) w skórze po tylnej stronie łokcia za pomocą mikronożyczek, przedłuż nacięcie wokół łokcia i odciągnij skórę, aby odsłonić mięśnie ramienia i barku.
    3. Zaczynając od bliższego końca kości ramiennej, użyj ostrza skalpela (#11), aby ciąć wzdłuż kierunku dystalnej. Umieść ostrze między jednostką mięśnia trójgłowego i ścięgna a tylną stroną kości ramiennej. Przedłuż cięcie w kierunku dystalnego końca kości ramiennej i zakończ przecinając ścięgno tricepsa.
    4. Następnie odciągnij triceps w kierunku bliższego końca kości ramiennej, aż głowa kości ramiennej zostanie odsłonięta.
    5. Przeciąć tkankę łączną wokół głowy kości ramiennej za pomocą ostrza skalpela (#11) bez dotykania powierzchni stawowej i usunąć kończynę (ramię i ramię) z ciała. Okresowo nawilżaj powierzchnię stawową głowy kości ramiennej za pomocą HBSS.
    6. Odłącz kość ramienną od ramienia, najpierw odrywając bliższy koniec kości łokciowej po tylnej stronie ramienia za pomocą kleszczy, a następnie przecinając tkankę łączną wokół dystalnego końca kości ramiennej. Usuń nadmiar tkanki z kości ramiennej.
    7. Odetnij guzowatość naramienną na tylnej stronie kości ramiennej za pomocą standardowych nożyczek preparacyjnych.
  5. Umieścić wypreparowaną próbkę (próbki) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej bufor HBSS.

3. Protokół barwienia na żywo (Calcein AM) / Martwy (jodek propidyny)

  1. Plamić za pomocą kalceiny AM w następujący sposób.
    1. Przygotować roztwór podstawowy kalceiny AM, dodając 12,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do fiolki z 50 μg kalceiny AM, co daje stężenie podstawowe 4 mg/ml (4,02 mM).
    2. Rozcieńczyć podstawowy roztwór kalceiny w stosunku 1:400 w HBSS, aby osiągnąć stężenie 10 μg/ml (10,05 μM) wapnia AM (na przykład dodać 1,25 μl roztworu podstawowego do 500 μl HBSS).
    3. Wirować rozcieńczony roztwór barwiący przez 5 s przy 2,000 x g, aby upewnić się, że cały barwnik, który może czasami przyklejać się do ścianek probówki, zmiesza się z buforem. Nie usuwać supernatantu. Odwiruj roztwór, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
    4. Wypreparowaną próbkę umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl rozcieńczonego roztworu barwiącego. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut w termomikserze, mieszając z prędkością 800 obr./min. Upewnij się, że rurki są pokryte folią aluminiową, aby chronić przed wystawieniem na działanie światła.
    5. Przenieść próbkę do buforu HBSS wolnego od kalceiny AM. W tym momencie próbka jest gotowa do badań mechanicznych.
  2. Przygotuj roztwór barwiący jodku propidyny (PI) w następujący sposób.
    1. Przygotuj roztwór do barwienia PI, rozcieńczając zakupiony roztwór podstawowy (1 mg/ml, 1,5 mM) w stosunku 1:25 w HBSS, aby osiągnąć 40 μg/ml (60 μM) PI. Na przykład dodać 40 μl roztworu podstawowego do 1000 μl HBSS.
    2. Roztwór do barwienia PI należy przechowywać w folii aluminiowej, aby chronić go przed działaniem światła. Natychmiast po przeprowadzeniu testu mechanicznego należy użyć roztworu barwiącego w celu wykrycia uszkodzonych komórek (patrz punkt 4).
      UWAGA: Można również wykonać barwienie PI przed załadowaniem, aby bardziej rygorystycznie ocenić jakość sekcji.

4. Protokół testów mechanicznych

  1. Umieść próbkę (kość udową lub ramienną) na szkiełku podstawowym mechanicznym urządzeniu testowym zamontowanym pod mikroskopem w taki sposób, aby powierzchnia stawowa na tylnych kłykciach kości udowej lub głowie kości ramiennej znajdowała się na szkle (Rysunek 1).
    UWAGA: Przymocuj drewniany aplikator o długości 10 mm (średnica = 2 mm) do dystalnej strony kości ramiennej za pomocą kleju cyjanoakrylowego przed umieszczeniem go na urządzeniu w celu ustabilizowania próbki na płaskiej powierzchni. Szczegółowy opis platformy do badań mechanicznych znajduje się w pliku uzupełniającym 1: sekcja 1.
  2. Uwodnić próbkę za pomocą HBSS i umieścić urządzenie z próbką pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  3. Wyobraź sobie chondrocyty stawowe barwione kalceiną AM (długości fal wzbudzenia/emisji = 495/515 nm) przed (wyjściowym) zastosowaniem obciążenia pod mikroskopem fluorescencyjnym z suchą soczewką 4X (NA = 0,13). Dostosuj ustawienia akwizycji, aby zoptymalizować jakość obrazu.
  4. Obciążyć próbkę mechanicznie w taki sposób, aby chrząstka stawowa została dociśnięta do szkła nakrywkowego.
    1. W przypadku obciążenia statycznego należy przyłożyć zalecane obciążenie statyczne (np. 0,5 N) na wierzch próbki (kość udową lub ramienną). Przytrzymaj ładunek przez 5 minut, a następnie usuń go.
    2. W przypadku uderzenia należy zastosować zalecaną energię uderzenia (np. 1 mJ) na próbkę, upuszczając cylindryczny impaktor o znanej masie (np. 0,1 N) z określonej wysokości (np. 1 cm). Zwolnij ładunek 5 s po uderzeniu.
      UWAGA: Masę impaktora (mg) i zalecaną wysokość (h) można przeliczyć na energię uderzenia (E) za pomocą następującego równania: E = mgh.
  5. Inkubować próbkę w roztworze barwiącym PI przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Wyobraź sobie chondrocyty stawowe barwione kalceiną AM i PI (długości fal wzbudzenia/emisji = 535/617 nm) pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 2).

5. Analiza danych

  1. Określ ilościowo obszar uszkodzonych/martwych komórek ze względu na zastosowany schemat obciążenia mechanicznego.
    1. Otwórz mikrofotografie powierzchni stawowej uzyskane przed i po przyłożeniu obciążenia mechanicznego w ImageJ18.
    2. Połącz obrazy w stos.
    3. Ustaw skalę obrazów na podstawie rozdzielczości obrazu.
    4. Użyj narzędzia Wielokąt, aby zdefiniować obszar, w którym komórki stały się kalceinowo-ujemne (utrata zielonej fluorescencji) i PI-dodatnie (wzmocnienie czerwonej fluorescencji). Komórki te uważa się za uszkodzone lub martwe.
    5. Określ obszar uszkodzonych/martwych komórek za pomocą narzędzia Pomiar.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sześć różnych protokołów obciążenia (obciążenie statyczne: 0,1 N, 0,5 N i 1 N przez 5 min; oraz obciążenie dynamiczne: 1 mJ, 2 mJ i 4 mJ) w sposób powtarzalny wywołało mierzalne, zlokalizowane obszary uszkodzeń komórek w chrząstce udowej i ramiennej uzyskanej od 8–10-tygodniowych myszy BALB/c (Rysunek 2). Co istotne, zakres przestrzenny uszkodzeń chondrocytów na powierzchni stawowej został zmierzony szybko i łatwo w programie ImageJ. Reprezentatywne wyniki wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane powyżej metody zostały z powodzeniem zastosowane do wizualizacji żywotnych i uszkodzonych/martwych chondrocytów stawowych in situ ze stawów myszy po przepisanych obciążeniach mechanicznych lub uderzeniach. W szczególności udało nam się przeanalizować mechaniczną podatność chondrocytów w całkowicie nienaruszonej chrząstce stawowej z dwóch różnych stawów maziowych: stawu kolanowego (dystalne kości udowe) i barku (kość ramienna). Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że przestrzenny zasięg uszkodzenia komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Richardowi Waughowi i Luisowi Delgadillo za hojne wykorzystanie ich pH-metru i osmometru. Ponadto autorzy chcieliby podziękować Andrei Lee za wkład we wstępny rozwój systemu testowania mechanicznego. To badanie zostało sfinansowane przez NIH P30 AR069655.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Calcein, AM Invitrogen firmy Thermo Fisher ScientificC3100MP20x50mg , Eugene, OR, USA
Jodek propidiumInvitrogen firmy Thermo Fisher ScientificP35661 mg/ml roztwór w wodzie, 10mL, Eugene, OR, USA
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich2768551L DMSO, bezwodny, ≥ 99,9%, St. Louis, MO, USA
HBSS (wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej) Gibco by Thermo Fisher Scientific14025-0921X, 500mL, Grand Island, NY, USA
Ostrze chirurgiczne z piór (#11)VWR102097-822Hatfield, PA, USA
Osmometr ciśnienia pary, VAPROELITechGroupModel 5520Puteaux, Francja
pH-metr BeckmanModel Phi 32 Brea, Kalifornia, Stany Zjednoczone
Termomikser Eppendorf Eppendorf AG Model 5350Hamburg, Niemcy
Zmotoryzowany odwrócony mikroskop badawczyOlypmusModel IX-81Center Valley, PA, USA
Drewniany aplikatorPuritan Medical Products Company, LLC8076"x100, Guilford, ME, USA
1.5 Szkiełka nakrywkoweWarner Instruments, LLC64-1696#1.5, grubość 0,17 mm, średnica 40 mm, Hamden, CT, USA

Bibliografia

  1. Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211(2010).
  2. Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
  3. Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
  4. Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
  5. Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
  6. Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
  7. Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
  8. Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
  9. Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
  10. Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
  11. Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
  12. Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
  13. Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
  14. Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
  15. Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
  16. Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
  17. Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  19. Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
  20. Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028(2017).
  21. Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
  22. Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
  23. Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198(2011).
  24. Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
  25. Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
  26. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  27. Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294(2017).
  28. Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
  29. Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
  30. Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
  31. McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
  32. Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
  33. Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie Calcein AMjodeczek propidynymikroskopia fluorescencyjnaanaliza w programie ImageJobci enie statyczne

Powiązane artykuły