Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Homeostaza chrząstki stawowej zależy od żywotności rezydujących komórek (chondrocytów). Niestety, uraz mechaniczny może wywołać rozległą śmierć chondrocytów, potencjalnie prowadząc do nieodwracalnego rozpadu stawu i wystąpienia choroby zwyrodnieniowej stawów. Ponadto utrzymanie żywotności chondrocytów jest ważne w zabiegach przeszczepów chrzęstnoszkieletowych w celu uzyskania optymalnych wyników chirurgicznych. Przedstawiono metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/obumarcia komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych mysich stawów maziowych po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być stosowana w badaniach porównawczych w celu zbadania wpływu różnych schematów obciążenia mechanicznego, różnych warunków środowiskowych lub manipulacji genetycznych, a także różnych etapów degeneracji chrząstki na krótko- i/lub długoterminową podatność chondrocytów stawowych in situ. Celem protokołu przedstawionego w pracy jest ocena przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej mysich stawów maziowych. Co ważne, metoda ta umożliwia badanie na całkowicie nienaruszonej chrząstce bez naruszania natywnych warunków brzegowych. Co więcej, pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym żywotnie zabarwionych chondrocytów stawowych oraz analizę uszkodzeń komórek wywołanych przez zastosowanie kontrolowanych schematów obciążenia statycznego i udarowego, opartego na pojedynczym obrazie. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że w zdrowych eksplantatach chrząstki przestrzenny zakres uszkodzenia komórek zależy w dużej mierze od wielkości obciążenia i intensywności uderzenia. Nasza metoda może być łatwo dostosowana do badania wpływu różnych schematów obciążenia mechanicznego, różnych warunków środowiskowych lub różnych manipulacji genetycznych na mechaniczną podatność chondrocytów stawowych in situ.
Wprowadzenie
Chrząstka stawowa (AC) to nośna tkanka, która pokrywa i chroni kości w stawach maziowych, zapewniając płynną artykulację stawów. Homeostaza tkanek zależy od żywotności chondrocytów, jedynego typu komórek znajdujących się w AC. Jednak narażenie chrząstki na ekstremalne siły spowodowane urazem (np. upadki, wypadek samochodowy lub urazy sportowe) lub z powodu pourazowej niestabilności stawu może wywołać śmierć chondrocytów, prowadząc do nieodwracalnego rozpadu stawu (choroba zwyrodnieniowa stawów)1. Ponadto w procedurach przeszczepu kostno-chrzęstnego, które mają na celu naprawę miejscowych ubytków w uszkodzonej chrząstce, uraz mechaniczn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie prace nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester.
1. Rozwiązania
- Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka (1X HBSS) zawierający wapń, magnez i bez czerwieni fenolowej. Dostosuj pH do 7,4, dodając niewielkie ilości HCl lub NaOH.
- Dostosuj osmolarność do 303 mOsm, dodając NaCl lub wodę dejonizowaną. Używaj bufora podczas preparacji, przygotowania próbki i badań mechanicznych.
2. Rozwarstwienie dystalnej kości udowej i bliższej kości ramiennej z całkowicie nienaruszoną chrząstką stawową
- Poddać mysz eutanazji z....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Sześć różnych protokołów obciążenia (obciążenie statyczne: 0,1 N, 0,5 N i 1 N przez 5 min; oraz obciążenie dynamiczne: 1 mJ, 2 mJ i 4 mJ) w sposób powtarzalny wywołało mierzalne, zlokalizowane obszary uszkodzeń komórek w chrząstce udowej i ramiennej uzyskanej od 8–10-tygodniowych myszy BALB/c (Rysunek 2). Co istotne, zakres przestrzenny uszkodzeń chondrocytów na powierzchni stawowej został zmierzony szybko i łatwo w programie ImageJ. Reprezentatywne wyniki wy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane powyżej metody zostały z powodzeniem zastosowane do wizualizacji żywotnych i uszkodzonych/martwych chondrocytów stawowych in situ ze stawów myszy po przepisanych obciążeniach mechanicznych lub uderzeniach. W szczególności udało nam się przeanalizować mechaniczną podatność chondrocytów w całkowicie nienaruszonej chrząstce stawowej z dwóch różnych stawów maziowych: stawu kolanowego (dystalne kości udowe) i barku (kość ramienna). Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że przestrzenny zasięg uszkodzenia komó.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Dr. Richardowi Waughowi i Luisowi Delgadillo za hojne wykorzystanie ich pH-metru i osmometru. Ponadto autorzy chcieliby podziękować Andrei Lee za wkład we wstępny rozwój systemu testowania mechanicznego. To badanie zostało sfinansowane przez NIH P30 AR069655.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Calcein, AM | Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Jodek propidium | Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/ml roztwór w wodzie, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, bezwodny, ≥ 99,9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Ostrze chirurgiczne z piór (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Osmometr ciśnienia pary, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, Francja |
| pH-metr | Beckman | Model Phi 32 | Brea, Kalifornia, Stany Zjednoczone |
| Termomikser Eppendorf | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Niemcy |
| Zmotoryzowany odwrócony mikroskop badawczy | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Drewniany aplikator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Szkiełka nakrywkowe | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, grubość 0,17 mm, średnica 40 mm, Hamden, CT, USA |
Bibliografia
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211(2010).
- Pallante, A. L., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
