Artykuł metodologiczny

Techniki fenotypowania w skali mikronowej wiązek naczyniowych kukurydzy w oparciu o rentgenowską tomografię mikrokomputerową

DOI:

10.3791/58501

⸱

9 października 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oferujemy nowatorską metodę poprawy kontrastu absorpcji promieniowania rentgenowskiego tkanki kukurydzy, odpowiednią do zwykłego skanowania metodą tomografii mikrokomputerowej. Na podstawie obrazów CT wprowadzamy zestaw procesów przetwarzania obrazów dla różnych materiałów kukurydzianych, aby skutecznie wyodrębnić mikroskopijne fenotypy wiązek naczyniowych kukurydzy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konieczne jest dokładne ilościowe określenie struktur anatomicznych materiałów kukurydzianych w oparciu o techniki wysokoprzepustowej analizy obrazu. W tym miejscu udostępniamy "protokół przygotowania próbki" dla materiałów kukurydzianych (tj. łodygi, liści i korzeni) nadających się do zwykłego skanowania za pomocą mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Opierając się na obrazach CT łodygi, liścia i korzenia kukurydzy o wysokiej rozdzielczości, opisujemy dwa protokoły analizy fenotypowej wiązek naczyniowych: (1) na podstawie obrazu CT łodygi i liścia kukurydzy opracowaliśmy specjalny potok analizy obrazu, aby automatycznie wyodrębnić 31 i 33 cechy fenotypowe wiązków naczyniowych; (2) w oparciu o serię obrazów CT korzenia kukurydzy, ustaliliśmy schemat przetwarzania obrazu dla trójwymiarowej (3-D) segmentacji naczyń metaksylemu i wyodrębniliśmy dwuwymiarowe (2-D) i 3-D cechy fenotypowe, takie jak objętość, powierzchnia naczyń metaksylemu itp. W porównaniu z tradycyjnym ręcznym pomiarem wiązek naczyniowych materiałów kukurydzianych, Proponowane protokoły znacznie poprawiają wydajność i dokładność kwantyfikacji fenotypowej w skali mikronowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System naczyniowy kukurydzy przebiega przez całą roślinę, od korzenia i łodygi do liści, co stanowi kluczowe ścieżki transportu do dostarczania wody, mineralnych składników odżywczych i substancji organicznych1. Kolejną ważną funkcją układu naczyniowego jest zapewnienie mechanicznego wsparcia dla rośliny kukurydzy. Na przykład morfologia, liczba i rozmieszczenie wiązek naczyniowych w korzeniach i łodygach są ściśle związane z odpornością roślin kukurydzy na wyleganie2,3. Obecnie badania nad budową anatomiczną wiązek naczyniowych wykorzystują głównie techniki mikroskopowe i ultramikroskopowe do przedstawienia struktur anatomicznych określonej części łodygi, liścia lub korzenia, a następnie zmierzenia i policzenia tych interesujących struktur za pomocą badań ręcznych. Niewątpliwie ręczny pomiar różnych struktur mikroskopowych w wielkoskalowych mikroobrazach jest pracą bardzo żmudną i nieefektywną oraz poważnie ogranicza precyzję cech mikrofenotypowych, ze względu na swoją subiektywność i niespójność4,5.

Kukurydza nie ma wtórnego wzrostu, a zawartość komórek składa się głównie z wody w pierwotnym merystymie. Bez żadnej obróbki wstępnej, świeże próbki tkanek kukurydzy mogą być bezpośrednio skanowane za pomocą urządzenia do mikrotomografii komputerowej; Jednak wyniki skanowania są prawdopodobnie słabe i szorstkie. Główne przyczyny podsumowano w następujący sposób: (1) niska gęstość tłumienia tkanek roślinnych, skutkująca niskim kontrastem liczby atomowej i wysokim szumem na obrazach; (2) świeże materiały roślinne są podatne na odwodnienie i kurczenie się podczas normalnego środowiska skanowania, jak donosi Du6. Wyżej wymienione problemy stały się głównymi ograniczeniami w rozwoju i zastosowaniu technologii mikrofenotypowania kukurydzy, pszenicy, ryżu i innych roślin jednoliściennych. W tym miejscu wprowadzamy "protokół przygotowania próbki" do wstępnej obróbki próbek łodygi, liści i korzeni kukurydzy. Protokół ten pozwala uniknąć odwodnienia i deformacji materiałów roślinnych podczas tomografii komputerowej; W związku z tym korzystne jest wydłużenie czasu konserwacji próbek roślinnych przy zachowaniu niedeformacji. Co więcej, etap barwienia na bazie stałego jodu zwiększa również kontrast materiałów roślinnych; w ten sposób znacznie poprawia jakość obrazowania mikro-CT. Ponadto opracowaliśmy oprogramowanie do przetwarzania obrazów o nazwie VesselParser do przetwarzania obrazów CT łodyg i liści kukurydzy. Oprogramowanie to integruje zestaw potoków przetwarzania obrazu w celu wykonywania wysokowydajnej i automatycznej analizy fenotypowania dla obrazów 2D CT różnych tkanek roślinnych. Pęczki naczyniowe w całym przekroju łodygi i liścia kukurydzy są wykrywane, ekstrahowane i identyfikowane za pomocą metody automatycznego przetwarzania obrazu. W efekcie otrzymujemy 31 mikroskopijnych fenotypów łodygi kukurydzy i 33 mikroskopijne fenotypy liścia kukurydzy. Na potrzeby serii obrazów CT korzenia kukurydzy opracowaliśmy schemat przetwarzania obrazu w celu uzyskania cech fenotypowych 3D naczyń metaksylemu. Schemat ten jest lepszy pod względem skuteczności akwizycji i rekonstrukcji obrazu w porównaniu z tradycyjnymi metodami.

Te wyniki wskazują, że procesy przetwarzania obrazu, uwzględniające charakterystykę obrazowania zwykłego mikrotomografii rentgenowskiej, stanowią skuteczną metodę mikroskopowego fenotypowania wiązek naczyniowych; to niezwykle rozszerza zastosowania technik CT w nauce o roślinach i poprawia automatyczne fenotypowanie materiałów roślinnych w rozdzielczości komórkowej6,7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protokół przygotowania próbki

  1. W celu pobrania próbek należy pobrać łodygę, liście i korzeń świeżych roślin kukurydzy i podzielić je na trzy rodzaje grup próbek (każda grupa z czterema powtórzeniami). Następnie pokrój je na małe segmenty za pomocą ostrza chirurgicznego w następujący sposób: (1) wytnij segment środkowego międzywęźla łodygi o długości 1 - 1,5 cm; (2) wyciąć odcinek o maksymalnej szerokości liścia o długości 0,5 - 3 cm wzdłuż kierunku pionowego z główną żyłą; (3) Wytnij segment korzenia korony o długości 0,5 cm.
  2. W celu utrwalenia FAA należy zanurzyć segmenty próbki w roztworze FAA (90:5:5 v/v/v, 70% etanol:100% formaldehyd:100% kwas octowy) przez co najmniej 3 dni.
  3. Wykonaj procedurę odwadniania w sześciu sekwencyjnych gradientach etanolu (tj. 30%, 50%, 70%, 85%, 95% i 100%) i ustaw czas przetwarzania każdego gradientu etanolu na 30 minut.
  4. Umieść materiały roślinne w odpowiednich koszach na próbki wyprodukowanych za pomocą drukarki 3D, a następnie szybko przenieś kosze na próbki do celi próbki systemu suszenia w punkcie krytycznym CO2 . Ustaw parametry suszenia w następujący sposób:
    (1) CO2 cale: duża prędkość. Wypełniacze uchwytów: 100%,
    (2) Ładowanie: opóźnienie ładowania CO2 120 s w cyklu. Szybkość wymiany: 5. Numer cyklu: 12,
    (3) Wyjście gazu: ciepło, szybko. Prędkość: wolna, 50%.
    1. Zgodnie z różnicami morfologicznymi korzenia, łodygi i liścia kukurydzy, zaprojektuj i wydrukuj kosze na próbki za pomocą drukarki 3D (np. Rysunek 1).
  5. Umieść wysuszone materiały roślinne (korzeń kukurydzy, łodygę lub liść) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 2 g stałego jodu, aby zabarwić materiały roślinne lotnymi oparami jodu, a następnie umieść probówki w pomieszczeniu odpornym na światło na 4-5 godzin.

2. Protokół skanowania mikro-tomografią

komputerową
  1. Aby zeskanować do surowych danych TK, ustaw parametry skanowania TK w następujący sposób: 40 kV/250 μA (dla łodygi i liścia) lub 34 kV/210 μA (dla korzenia). Ustaw odpowiednie zakresy skanowania dla różnych rozmiarów i objętości użytych materiałów roślinnych i dostosuj rozmiary pikseli obrazowania w następujący sposób: 2,0 μm (dla korzenia kukurydzy), 6,77 μm (dla łodygi kukurydzy) i 10,0 μm (dla liścia kukurydzy).
  2. Aby zrekonstruować obrazy przekrojów, przekształć surowe dane CT na obrazy wycinków CT o rozdzielczości 2K (2,000 x 2,000 pikseli) za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji obrazu. Więcej szczegółów znajduje się w instrukcji obsługi NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3. Protokół analizy obrazu dla pojedynczego obrazu CT łodygi lub liścia kukurydzy

UWAGA: Użyj oprogramowania do automatycznego obrazowania wiązek naczyniowych, aby przeprowadzić analizę fenotypowania wiązek naczyniowych w obrazach CT łodygi i liścia kukurydzy (Rysunek 2). Kroki korzystania z oprogramowania są opisane w następujący sposób.

  1. Wyznacz typ narządu, aby zainicjować różne potoki algorytmów. Kliknij przycisk Parametry metody i wybierz łodygę kukurydzy lub liść kukurydzy z pierwszego pola rozwijanego.
  2. Aby zaimportować obrazy, kliknij przycisk Zarządzanie danymi, ustaw katalog roboczy i automatycznie zaimportuj wszystkie obrazy plasterków w tym katalogu. Zaznaczanie obrazów jedno- lub wieloplasterkowych w potokach obrazów.
  3. Określ rzeczywisty rozmiar obrazu w pikselach. Kliknij przycisk Parametry metody i wprowadź rzeczywisty rozmiar obrazu w pikselach w elemencie edycji rozmiaru piksela.
  4. Aby obliczyć fenotypowanie, kliknij przycisk Obliczenia fenotypowania, aby automatycznie wyodrębnić cechy fenotypowe wiązek naczyniowych dla wszystkich wybranych obrazów plasterków.
  5. Kliknij przycisk Analiza statystyczna, aby wyświetlić wyniki w formacie TXT lub CSV.

4. Protokół analizy obrazu dla serii obrazów CT korzenia kukurydzy

UWAGA: Seria obrazów CT korzeni kukurydzy jest wykorzystywana do ekstrakcji trójwymiarowych struktur naczyń metaksylemu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów. Główne kroki są następujące.

  1. Zaimportuj zrekonstruowane obrazy korzeni kukurydzy (w formacie pliku BMP) i określ dokładne parametry odstępów (rozmiar woksela [tj. x, y, z]). Użyj rekurencyjnego narzędzia Gaussa, aby wygładzić te obrazy w celu poprawy jakości obrazu.
  2. Przeprowadzić segmentację 3D naczyń metaksylemowych, dostosowując parametry progowe; spowoduje to wygenerowanie jednolitej kolorowej etykiety dla każdego połączonego naczynia metaksylemu.
  3. Ulepszaj i identyfikuj naczynia metaksylemu interaktywnie, korzystając z morfologii, bitów i operacji wypełniania powodziowego.
  4. Przeprowadzenie wizualizacji objętości i rekonstrukcji powierzchni naczyń. Użyj narzędzia do statystyk masek, aby policzyć i zmierzyć cechy fenotypowe naczynia na poziomach 2D i 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przygotowania próbki odpowiedni do zwykłego skanowania mikro-tomografią nie tylko zapobiega deformacji tkanek roślinnych, ale także zwiększa kontrast absorpcji promieniowania rentgenowskiego. Wstępnie poddane obróbce materiały roślinne są skanowane za pomocą systemu mikro-CT w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów plastrów, a najwyższa rozdzielczość może osiągnąć 2 μm/piksel. Rysunek 4 pokazuje zeskanowane obrazy mikro-CT łodygi, liścia i korzenia,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki udanemu zastosowaniu technologii CT w dziedzinie biomedycyny i materiałoznawstwa, technologia ta została stopniowo wprowadzona do dziedzin botaniki i rolnictwa, promując badania w dziedzinie nauk o życiu roślin jako obiecujące narzędzie techniczne. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych XX wieku po raz pierwszy zastosowano technologię CT do badania struktur morfologicznych i rozwoju systemów korzeniowych roślin. W ciągu ostatniej dekady synchrotron HRCT stał się potężnym, nieniszczącym narzędziem dla biologów roślin i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez Narodową Fundację Nauk o Przyrodzie Chin (No.31671577), Science and Technology Innovation Special Construction Funding Program of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences(KJCX20180423), Chiński Program Rozwoju Badań (2016YFD0300605-01), Beijing Natural Science Foundation (5174033), Beijing Postdoctoral Research Foundation (2016 ZZ-66) oraz Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences Dotacja (KJCX20170404), (JNKYT201604).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System rentgenowskiej tomografii komputerowej Skyscan 1172Bruker Corporation, BelgiaNADo tomografii komputerowej
System suszenia punktu krytycznego CO2 (Leica CPD300)Leica Corporation, NiemcyNADo suszenia próbek
Etanol dowolnyBRAK NADo utrwalania FAA
FormaldehydDowolnyBRAK NADo utrwalania FAA
Acetic kwasDowolnyBRAK NIE dotyczyDo mocowania FAA
Ostrze chirurgiczneDowolnaBRAK DANYCHDo cięcia próbek
Drukarka 3DMakerbot replicator 2, MakerBot Industries, USANADo drukowania koszy na próbki korzenia, łodygi i liścia kukurydzy
Probówka wirówkowaCorning, USANAUmieść materiał korzeniowy, łodygowy lub liściowy
Jod stałyDowolnyBRAK DANYCHDo barwienia próbek
Oprogramowanie SkyScan NreconSkyScan NRecon, wersja: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BelgiaNADo rekonstrukcji obrazu
Oprogramowanie VesselParserVesselParser, wersja: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Pekin, ChinyNAProtokół analizy obrazu dla pojedynczego obrazu CT łodygi lub liścia kukurydzy
ScanIPScanIP, wersja: 7.0; Simpleware, Exeter, Wielka BrytaniaAmerykaPółnocna Oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D
Rękawiczki lateksoweDowolnapęseta NA
DowolnaNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
  2. Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
  3. Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
  4. Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
  5. Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
  6. Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
  7. Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
  8. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).
  9. Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
  10. Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
  11. Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
  12. Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
  13. Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
  14. Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
  15. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295(2013).
  16. Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
  17. Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673(2014).
  18. Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26(2015).
  19. Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
  20. Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655(2015).
  21. Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok przygotowania pr bekproces analizy fenotypowejsegmentacja 3Dnaczynia metaksylemowerekonstrukcja obrazu CTautomatyczne oprogramowanie do obrazowaniawizualizacja obj to ciowarekonstrukcja powierzchni

Powiązane artykuły