Ilościowa metoda autoradiograficzna do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo

Podsumowanie

Synteza białek jest krytycznym procesem biologicznym dla komórek. W mózgu jest niezbędna do zmian adaptacyjnych. Pomiar tempa syntezy białek w nienaruszonym mózgu wymaga starannych rozważań metodologicznych. W tym artykule przedstawiono ilościową metodę autoradiograficzną L-[^1-14C]-leucyny do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo.

Streszczenie

Synteza białek jest niezbędna do rozwoju i utrzymania funkcji neuronów oraz bierze udział w zmianach adaptacyjnych w układzie nerwowym. Co więcej, uważa się, że rozregulowanie syntezy białek w układzie nerwowym może być podstawowym fenotypem w niektórych zaburzeniach rozwojowych. Dokładny pomiar tempa syntezy białek mózgowych w modelach zwierzęcych jest ważny dla zrozumienia tych zaburzeń. Metoda, którą opracowaliśmy, została zaprojektowana z myślą o zastosowaniu jej do badania obudzonych, zachowujących się zwierząt. Jest to ilościowa metoda autoradiograficzna, dzięki czemu może dawać wskaźniki we wszystkich obszarach mózgu jednocześnie. Metoda opiera się na wykorzystaniu aminokwasu znacznikowego L-[^1-14C]-leucyny oraz kinetycznego modelu zachowania L-leucyny w mózgu. Wybraliśmy L-[^1-14C]-leucynę jako znacznik, ponieważ nie prowadzi ona do powstania obcych znakowanych produktów przemiany materii. Jest albo wbudowywany w białko, albo szybko metabolizowany, aby uzyskać ¹⁴CO_{2 ,} który jest rozcieńczany w dużej puli nieznakowanego CO₂ w mózgu. Metoda i model pozwalają również na udział nieznakowanej leucyny pochodzącej z proteolizy tkanek w puli prekursorów tkankowych do syntezy białek. Metoda posiada rozdzielczość przestrzenną pozwalającą na określenie tempa syntezy białek w warstwach komórkowych i neuropilowych, a także w jądrach podwzgórza i nerwów czaszkowych. Aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne dane ilościowe, ważne jest przestrzeganie szczegółów proceduralnych. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowe procedury ilościowej autoradiograficznej metody L-[^1-14C]-leucyny do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek in vivo.

Wprowadzenie

Synteza białek jest ważnym procesem biologicznym niezbędnym do długotrwałych zmian adaptacyjnych w układzie nerwowym¹. Hamowanie syntezy białek blokuje przechowywanie pamięci długotrwałej zarówno u bezkręgowców, jak i kręgowców². Synteza białek jest niezbędna do utrzymania późnych faz niektórych form długotrwałego wzmocnienia (LTP) i długotrwałej depresji (LTD)³, przeżycia neuronów podczas rozwoju⁴, oraz do ogólnego utrzymania neuronu i jego połączeń synaptycznych⁵. Pomiar tempa syntezy białek mózgowych może być ważnym narzędziem do badania zmian adaptacyjnych, a także zaburzeń neurorozwojowych i zaburzeń związanych z uczeniem się i pamięcią.

Opracowaliśmy metodę ilościowego określania szybkości syntezy białek mózgowych in vivo u przytomnego zwierzęcia, która oferuje nieodłączną przewagę nad innymi technikami, które szacują tempo in ex vivo lub in vitro preparatów tkanki mózgowej⁶. Przede wszystkim można je zastosować do pomiarów w nienaruszonym mózgu u przytomnego zwierzęcia. Jest to kluczowa kwestia, ponieważ umożliwia pomiary z ustaloną strukturą i funkcją synaps oraz bez obaw o efekty pośmiertne. Co więcej, stosowane przez nas ilościowe podejście autoradiograficzne osiąga wysoki stopień lokalizacji przestrzennej. Podczas gdy energia ¹⁴C jest taka, że nie możemy zlokalizować znacznika na poziomie subkomórkowym lub komórkowym, możemy mierzyć wskaźniki w warstwach komórkowych i małych obszarach mózgu, takich jak jądra podwzgórza, z rozdzielczością około 25 μm⁷.

Jednym z wyzwań pomiarów in vivo za pomocą radioznaczników jest zapewnienie, że mierzony radioznacznik jest w produkcie interesującej nas reakcji, a nie w nieprzereagowanym znakowanym prekursorze lub innych obcych znakowanych produktach przemiany materii⁶. Wybraliśmy L-[^1-14C]-leucynę jako aminokwas znacznikowy, ponieważ jest ona albo włączona do białka, albo szybko metabolizowana do ¹⁴CO_{2 ,} która jest rozcieńczana w dużej puli nieznakowanego CO₂ w mózgu, co wynika z wysokiego tempa metabolizmu energetycznego⁸. Co więcej, każde ¹⁴C nie włączone do białka istnieje głównie jako wolna [¹⁴C]-leucyna, która w ciągu 60-minutowego okresu eksperymentalnego jest prawie całkowicie usuwana z klasy tissue6. Białka są następnie mocowane do tkanki za pomocą formaliny, a następnie płukane wodą w celu usunięcia wolnej [¹⁴C]-leucyny przed autoradiografią.

Innym ważnym czynnikiem jest kwestia rozcieńczenia specyficznej aktywności puli aminokwasów prekursorowych przez nieznakowane aminokwasy pochodzące z proteolizy tkanek. Wykazaliśmy, że u dorosłych szczurów i myszy około 40% puli prekursorów leucyny do syntezy białek w mózgu pochodzi z aminokwasów pochodzących z rozpadu białek⁶. Musi to zostać uwzględnione w obliczeniach regionalnych wskaźników syntezy białek mózgowych (rCPS) i musi zostać potwierdzone w badaniach, w których zależność ta może ulec zmianie. Podstawy teoretyczne oraz założenia metody zostały szczegółowo przedstawione w innym miejscu⁶. W niniejszym artykule skupiono się na problematyce proceduralnej związanej ze stosowaniem tej metodyki.

Ta metoda została zastosowana do określenia rCPS u wiewiórek ziemnych⁹, sheep^{10, rhesus} monkeys¹¹, rats^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}, mysi model kompleksu stwardnienia guzowatego²², mysi model zespołu łamliwego chromosomu X^23,24,25,26, myszy premutacji fragile X^27, oraz mysi model fenyloketonurii²⁸. W pracy przedstawiono procedury pomiaru rCPS metodą autoradiologiczną L-[^1-14C]-leucyny in vivo. Przedstawiamy rCPS w obszarach mózgu wybudzonej myszy kontrolnej. Wykazaliśmy również, że podawanie in vivo anizomycyny, inhibitora translacji, znosi syntezę białek w mózgu.

Protokół

Uwaga: Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.

Przegląd protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1.

1. Chirurgicznie wszczepić cewniki do żyły udowej i tętnicy w celu podania znacznika i pobrania próbek krwi tętniczej w czasie. Zabieg chirurgiczny należy wykonać co najmniej 22 godziny przed podaniem znacznika. Zabieg trwa około 1 godziny.

1. Zgromadź niezbędne materiały: sterylne narzędzia chirurgiczne (nożyczki chirurgiczne, mikronożyczki, kleszcze, trzy haczyki chirurgiczne do skóry), sprzęt do znieczulenia izofluranem (parownik izofluranu, zmiatacz gazów aktywnych, szczelna komora anestezjologiczna, stożek do znieczulenia), sterylny etap operacji, maszynki do strzyżenia futra, 70% etanol, betadyna, sterylna gaza, taśma chirurgiczna, komercyjne ogrzewacze do rąk, mikroskop chirurgiczny, sterylny 0,9% chlorek sodu (sól fizjologiczna), sterylna heparyna 100 jednostek USP/ml w 0,9% chlorku sodu (sól fizjologiczna heparynizowana), sterylne pięć 20-centymetrowych pasków wchłanialnego szwu 6-0, sterylne 25-centymetrowe nici cewników polietylenowych PE-8 i PE-10 z jednym końcem ciętym pod kątem 45^o, sterylne strzykawki 1 cm³, sterylne igły o rozmiarze 32, sprzęt do kauteryzacji, sterylny pręt ze stali nierdzewnej o długości 15-20 cm (średnica wewnętrzna 2,5 mm, średnica zewnętrzna 3 mm), środki znieczulające miejscowo (maść z bupiwakainy i lidokainy), oraz wybieg dla zwierząt z obrotowym mocowaniem (30 cm sprężynowa linka mocująca z przyciskiem, krętlik, uchwyt obrotowy i ramię, przezroczysty pojemnik cylindryczny 20 x 13 cm).
2. Przygotuj zwierzę do operacji.
3. Upewnij się, że stosowane są odpowiednie techniki aseptyczne i sterylne, zgodnie z wymaganiami Twojej instytucji.
   1. Zważ zwierzę. Zwierzę musi ważyć co najmniej 25 g, aby operacja zakończyła się sukcesem.
   2. Umieść zwierzę w szczelnie zamkniętej komorze z pleksi i podłącz komorę do aparatu do znieczulenia izofluranem. Ustawić natężenie przepływu 1,5% izofluranu w O₂ dla samców na 2,5 l/min dla samic. Po około 2 minutach upewnij się, że mysz jest odpowiednio uspokojona przez brak odruchu wycofania z uszczypnięciem palca
   .
   3. Po podaniu środków uspokajających wyjmij mysz z komory i połóż ją w pozycji leżącej z twarzą wewnątrz stożka nosowego do znieczulenia. Ustaw stożek nosowy, aby odbierać gaz z parownika i wracać gaz do pochłaniacza gazu. Zbieracz wychwyci izofluran w filtrze węglowym.
   4. Użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić sierść między łopatkami. Upewnij się, że odpowiednio wysterylizowałeś ogolony obszar, trzykrotnie naprzemiennie stosując peelingi betadynowe i etanolowe.
   5. Przesuń mysz do pozycji leżącej, trzymając twarz w stożku nosowym. Przyklej lewą nogę do etapu operacji i użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić sierść od lewej wewnętrznej strony uda do lewej górnej części brzucha. Upewnij się, że odpowiednio wysterylizowałeś ogolony obszar, trzykrotnie naprzemiennie stosując peelingi betadynowe i etanolowe.
   6. Wsuń aktywowany dostępny w handlu ogrzewacz do rąk, zawinięty w gazę, pod mysz. Przyklej prawą nogę do etapu operacji.
4. Wprowadzić cewnik do lewej żyły udowej.
   1. Za pomocą mikroskopu chirurgicznego za pomocą nożyczek chirurgicznych należy wykonać 1 cm nacięcie od górnej przyśrodkowej części lewego uda w kierunku linii środkowej, odsłaniając tętnicę i żyłę udową.
   2. Cofnij luźną skórę za pomocą chirurgicznych haczyków do skóry, aby jeszcze bardziej odsłonić pęcherzyki.
   3. Nałóż sterylny 0,9% chlorek sodu na odsłonięty obszar, aby utrzymać odpowiednią wilgotność.
   4. Użyj kleszczy, aby stępić preparację, oddzielając tkankę łączną wokół niewielkiego odcinka tętnicy udowej i żyły. Ostrożnie oddziel tętnicę od żyły (Rysunek 2).
   5. Użyj kleszczy, aby nawlec jedno pasmo wchłanialnego szwu (pasmo A) zarówno pod żyłą udową, jak i tętnicą w najbardziej bocznym punkcie nacięcia. Przeciągnij szew do połowy, aby końce były równe.
   6. W bardziej bliższym punkcie pachwiny użyj kleszczy, aby nawlec drugi szew (pasmo B) tylko pod żyłą udową. Delikatnie zawiąż pół węzła, który będzie używany do ograniczania przepływu krwi.
   7. W punkcie między pasmem A a pasmem B użyj kleszczy, aby nawlec trzeci szew (pasmo C) tylko pod żyłą udową. Delikatnie zawiąż pełny węzeł, który będzie służył do ograniczania przepływu krwi. Uważaj, aby nie rozerwać żyły.
   8. Delikatnie pociągnij za pasmo B, aby ograniczyć przepływ krwi. Użyj hemostatu, aby delikatnie pociągnąć pasmo B, aby utrzymać ograniczony przepływ krwi.
   9. Wytnij mały otwór w ograniczonym obszarze żyły udowej za pomocą mikronożyczek i ostrożnie włóż kątowy koniec rurki PE-8 (wcześniej przepłukanej solą fizjologiczną heparyny) w kierunku pasma B. Po włożeniu zwolnij napięcie nici B i poprowadź cewnik dalej w górę żyły. Zaciśnij pasmo B wokół żyły zawierającej cewnik.
   10. Używając nici C, zawiąż dodatkowy węzeł wokół cewnika. Upewnij się, że ten węzeł nie chwyta tętnicy udowej.
   11. Delikatnie pociągnij do tyłu cylinder strzykawki, aby częściowo napełnić rurkę krwią, aby upewnić się, że cewnik został prawidłowo wszczepiony.
5. Postępując zgodnie z tą samą procedurą, wprowadź cewnik PE-10 do lewej tętnicy udowej.
6. Pełna procedura chirurgiczna.
   1. Po zabezpieczeniu cewników do żyły udowej i tętnicy zawiąż pasmo A w węzeł wokół obu cewników.
   2. Odetnij wszystkie nadmiarowe szwy i usuń haczyki skórne. Przepłukać cewnik tętniczy heparynizowaną solą fizjologiczną, aby zapobiec zakrzepom. Kauteryzuj końce obu cewników, aby utworzyć uszczelnienie.
   3. Umieść mysz w pozycji leżącej i wykonaj małe nacięcie u podstawy szyi i nałóż sól fizjologiczną na odsłonięty obszar.
   4. Wprowadzić pusty metalowy pręt podskórnie od nacięcia szyi do nacięcia kości udowej. Przeprowadź cewniki przez pusty pręt i wyjdź z nacięcia szyi. Usuń pusty pręt. Wszczepianie cewników podskórnie zapobiegnie uszkodzeniu cewników przez myszy.
   5. Nałożyć bupiwakainę na boki rany. Zamknij nacięcie kości udowej szwem. Na zamkniętą, zszytą ranę nałożyć maść lidokainową.
   6. Przełóż cewniki przez 30-centymetrową elastyczną pustą rurkę (linka sprężynowa) i zszyj guzik sprężynowej linki pod skórą. Nałożyć bupiwakainę na boki rany. Zszyj guzik sprężynowej linki pod skórą. Na zamkniętą, zszytą ranę nałożyć maść lidokainową.
   7. Przenieś mysz do przezroczystego cylindrycznego pojemnika (20 cm wysokości, 13 cm średnicy) z obrotowym uchwytem i ramieniem, aby pomieścić zwierzę w okresie rekonwalescencji. Umieść ogrzewacz do rąk pod pojemnikiem, aby zwierzę było ciepłe.
   8. Przykręć górną część linki sprężynowej do krętlika i przymocuj krętlik do ramienia obrotowego przymocowanego do cylindrycznego pojemnika. Upewnij się, że mysz ma pełny zakres ruchu i że można uzyskać dostęp do cewników.
   9. Umieść szczelinową pokrywę, która nie koliduje z mechanizmem obrotowym, nad wybiegiem dla zwierząt. Zapoznaj się z Rysunek 3, aby zapoznać się z pełną konfiguracją.
   10. Pozwól myszy na odzyskanie sprawności. Zalecane jest co najmniej 22 godziny.

2. Przygotuj roztwór L-[^1-14C]leucyny do wstrzykiwań i 16% (w/v) dwuwodny roztwór kwasu 5-sulfosalicylowego (SSA) do deproteinizacji próbek osocza. W roztworze SSA należy również uwzględnić 0,04 mM norleucyny i 1 μCi/ml [^H3]leucynę jako wzorce wewnętrzne do analizy aminokwasów i analizy stężenia znacznika we frakcjach osocza rozpuszczalnych w kwasach. Przechowywać SSA do dwóch miesięcy w temperaturze 4 °C.

1. Kup dostępną w handlu L-[^1-14C]leucynę (50-60 mCi/mmol), która jest sprzedawana jako roztwór w 2% etanolu lub 0,1 N HCl. Wysuszyć suszarką znaną aktywność znacznika pod delikatnym strumieniem azotu i rozpuść w roztworze sterylnej soli fizjologicznej uzupełnionej do stężenia 100 μCi/ml.

3. Podaj dożylnie L-[^1-14C]leucynę i pobierz próbki krwi tętniczej.

1. Zbierz niezbędne materiały: 18 mikroprobówek o pojemności 1,5 ml do odbiałczania próbek osocza (dodaj 70 ml wody dejonizowanej do każdej probówki), 17 szklanych wkładek do fiolek o pojemności 250 ml (15 wkładek do pobierania próbek krwi tętniczej i 2 wkładki do pobierania krwi z martwych przestrzeni do ponownego wstrzyknięcia. Aby ograniczyć gromadzenie się dodatkowej i niepotrzebnej krwi, zaleca się małe, cienkie szklane wkładki do fiolek ze zwężającymi się dnami, które umożliwiają dostępne pipetowanie osocza sklarowanego nad osadem), 2 probówki mikrokapilarne (32 X 0,8 mm, do pomiaru hematokrytu), 1 probówkę do mikrowirówki pokrytą heparyną i fluorkiem litu (odpowiednio w celu zapobiegania krzepnięciu i glikolizie), hemostatyki (przykryj końcówki rurką tygonową, aby zaciski nie uszkodziły rurki PE), monitor stężenia glukozy we krwi, przetwornik ciśnienia krwi, sterylne strzykawki o pojemności 1 ml (do płukania solą fizjologiczną) i dostępny w handlu roztwór do eutanazji (rozcieńczony w stosunku 1:1 w wodzie dejonizowanej (dla myszy)).
2. Upewnij się, że zwierzę jest w normalnym stanie fizjologicznym na początku eksperymentu.
   1. Zacisnąć rurkę tętniczą około 2 cm od końca i odciąć końcówkę, tworząc otwór do przepływu krwi. Następnie odblokuj rurkę i zbierz krew z martwych przestrzeni (ok. 30 ml), aby zebrać resztki soli fizjologicznej i/lub krwi z poprzednich pobrań), a w osobnej probówce pobrać próbkę kontrolną (ok. 30 μl), próbki hematokrytu (około połowa objętości rurki kapilarnej) i próbkę glukozy (ok. 20 μl).
   2. Zmierz hematokryt, zatykając jeden koniec szpachlą uszczelniającą i wirować przez 1 minutę przy 4500 x g. Zmierz stosunek objętości krwinek czerwonych do całkowitej objętości krwi. Jeśli zwierzę ma hematokryt poniżej 30%, nie należy kontynuować badania.
   3. Użyj dostępnego w handlu monitora stężenia glukozy we krwi, aby zmierzyć poziom glukozy w kropli krwi.
   4. Odwirować próbkę kontrolną przez 2 minuty przy 18 000 x g w celu oddzielenia osocza. Odbiałczić próbki osocza w następujący sposób: dodać 5 μl osocza do 70 μl wody dejonizowanej w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, dodać 25 μl 16% roztworu SSA i odwirować. Umieść na lodzie na 30 minut przed zamrożeniem na suchym lodzie.
   5. Zwróć zwierzęciu krew z martwych przestrzeni przez linię żylną, a następnie przepłucz solą fizjologiczną heparynizowaną, aby zapobiec nadmiernej utracie krwi.
   6. Podłącz linię tętniczą do przetwornika ciśnienia krwi, aby zmierzyć średnie ciśnienie tętnicze krwi.
   7. Po pobraniu próbek należy ponownie zacisnąć linię tętniczą i przepłukać linię niewielką (50 ml) objętością heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej.
3. Podaj znacznik dożylnie i pobierz próbki krwi tętniczej w określonym czasie.
   1. Za pomocą łącznika Y podłączyć jedną strzykawkę ze znacznikiem (100 μCi/kg) i jedną strzykawkę z 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej w celu przepłukania przewodu żylnego po wstrzyknięciu znacznika. Podłącz łącznik Y do przewodu żylnego.
   2. Rozpocznij badanie, uruchamiając jednocześnie stoper i wstrzykując znacznik. Przepłukać linię żylną solą fizjologiczną (ok. 100 ml) natychmiast po wstrzyknięciu.
   3. Pobieraj próbki krwi od 1 do 7 w sposób ciągły przez pierwsze 2 minuty eksperymentu w ten sam sposób. Po pobraniu 7. próbki należy pobrać 30 μl krwi z martwych przestrzeni przed każdą pozostałą próbką. Próbki 8-14 pobiera się odpowiednio po 3, 5, 10, 15, 30, 45 i 60 minutach.
   4. Próbki krwi należy przetwarzać natychmiast po pobraniu, jak opisano dla próbki kontrolnej. W przypadku opóźnienia należy umieścić próbki na lodzie. Ostrożnie ponownie wstrzyknąć krew z martwych przestrzeni do tętnicy przez cewnik tętniczy i przepłukać solą fizjologiczną heparyny.
   5. W pewnym momencie eksperymentu przetrzyj trzy wzorce wewnętrzne, dodając 25 μl 16% SSA, 0,04 mM norleucyny i 1 mCi/ml [³H]leucyny do 75 μl wody, odwiruj i umieść na lodzie.
   6. Po pobraniu 14. próbki po 60 minutach wstrzyknąć około 0,2 ml B-eutanazji-D do linii żylnej w celu eutanazji zwierzęcia. Zapisz czas śmierci.
   7. Odkręć zwierzę od uchwytu obrotowego i wyjmij je z pomieszczenia dla zwierząt. Ostrożnie wyjmij mózg, umieść na folii aluminiowej i zamroź na suchym lodzie. Nie zamrażaj mózgów ciekłym azotem, ponieważ mózgi mogą pękać. Mózg, próbki i wzorce wewnętrzne należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, aż będą gotowe do przetworzenia. Przetwarzanie można przeprowadzić w dowolnym momencie po jego zakończeniu.

4. Analizuj stężenia leucyny i L-[^1-14C]leucyny w próbkach osocza.

1. Rozmrażać próbki i wzorce wewnętrzne na lodzie, wirować i odwirować 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze 2 °C. Frakcja supernatantu będzie zawierała wolną znakowaną i nieznakowaną leucynę.
2. Przenieść 40 μl supernatantu do płynnej fiolki scyntylacyjnej i dodać koktajl scyntylacyjny. Określić ilościowo rozpady na minutę (DPM) wynoszące ³H i ¹⁴C za pomocą zliczania scyntylacyjnego cieczy i krzywej tłumienia zaprojektowanej do jednoczesnego zliczania metodą podwójnej próby (³H i ¹⁴C).
3. Aby określić ilościowo stężenia leucyny w osoczu, należy użyć systemu HPLC z kolumną kationowymienną sodu i derywatyzacją po kolumnie z o-ftaldehydem i detekcją fluorometryczną.
   1. Ustaw HPLC zgodnie z następującymi specyfikacjami: wzbudzenie fluorometrem 330 nm i emisja 465 nm. Faza ruchoma składa się z eluantu sodu o pH 7,40 i eluantu sodu + 5% sulfolianu o pH 3,15. Ustaw natężenie przepływu bufora na 0,400 ml/min, a natężenie przepływu przyrządu do derywatyzacji na 0,300 ml/min. Ustaw temperaturę kolumny na 48 °C, a temperaturę reaktora na 45 °C.
   2. Skalibruj system z zakresem stężeń aminokwasów (w tym norleucyny) od 30 do 500 pmol/10 ml. Krzywa kalibracyjna jest liniowa. Stężenia aminokwasów w badanych próbkach iniekcyjnych o pojemności 10 ml mieszczą się w zakresach tej krzywej kalibracyjnej.

5. Wykonaj autoradiografię ilościową.

1. Przygotuj skrawki mózgu o grubości 20 μm do autoradiografii. Przeciąć mózg za pomocą kriostatu w temperaturze -20 °C.
2. Rozmrażanie seryjnych sekcji mózgu na szkiełkach pokrytych żelatyną. Suszyć na powietrzu.
3. Myć szkiełka w pięciu zmianach 10% formaliny przez 30 minut na zmianę, a następnie ciągły przepływ wody dejonizowanej przez 1 godzinę. Przykryj szkiełka luźno folią, aby uniknąć kurzu i pozostaw do wyschnięcia na 24 godziny.
4. Ułóż preparaty w kasecie z kliszą rentgenowską (zalecane są kasety pasujące do klisz mammograficznych o wymiarach 20X25 cm) wraz z zestawem wzorców [¹⁴C] metakrylanu metylu, które zostały wcześniej skalibrowane na tkance o znanych stężeniach ¹⁴C zgodnie z opisem²⁹. Wzorce można kupić na rynku, ale należy upewnić się, że obejmują one zakres 2-300 mCi/g tkanki i są skalibrowane względem grubości tkanki 20 μm. Pod czerwonym światłem awaryjnym umieść kawałek filmu mammograficznego, emulsją do dołu, na sekcjach.
5. Zamknij kasety i umieść w czarnej torbie do przewijania i przechowuj w szafce przez 40-45 dni.
6. Wywołuj filmy zgodnie ze wskazówkami producenta. Uwaga: Automatyczne wywoływanie filmu nie jest zalecane, ponieważ tło może być nierówne i może wpływać na kwantyfikację.

6. Analizuj obrazy.

Uwaga: Zalecany jest dostępny na rynku program do analizy obrazu w połączeniu z kamerą CCD i fluorescencyjnym światłem o równomiernym oświetleniu. Względne gęstości optyczne w oświetlonej folii są wykrywane przez kamerę CCD.

1. Skonstruować krzywą kalibracyjną gęstości optycznej (OD) w funkcji stężenia ¹⁴C w tkance w oparciu o OD zestawu skalibrowanych wzorców na folii. Dopasuj te dane (w tym puste miejsce lub tło) do równania wielomianowego. Równanie wielomianowe drugiego lub trzeciego stopnia pasuje bardzo dobrze.
2. Aby przeanalizować określone regiony mózgu, zlokalizuj obszar zainteresowania (ROI) w sześciu do ośmiu sekcjach, porównując go z atlasem mózgu. Zapisz OD pikseli w ROI we wszystkich sekcjach i na podstawie krzywej kalibracyjnej oblicz stężenie ¹⁴C w tkance w każdym pikselu. Oblicz średnie stężenie ¹⁴C w tkance w ROI.

7. Obliczanie rCPS. Oblicz rCPS w każdym ROI za pomocą następującego równania:

Gdzie P*(T) to średnie ważone stężenie w tkance ^{wynoszące 14}C w ROI, C_p(t) i C^*_p(t) to stężenia nieznakowanej i znakowanej leucyny w osoczu tętniczym w czasie, t, T to czas, w którym zwierzę zmarło (około 60 min), a λ to frakcja leucyny w puli prekursorów tkankowych, która pochodzi z osocza. Ocenę λ przeprowadza się w osobnym doświadczeniu ⁶. λ zostało ocenione w WT, Fmr1 knockout, Tsc^+/- i PKU myszy ^6,22,25,28. Jeśli eksperyment obejmuje zmiany genetyczne lub farmakologiczne, które mogą wpływać na tempo syntezy, degradacji lub metabolizmu leucyny białek, λ należy ocenić w nowych warunkach.

Wyniki

Tutaj pokazujemy reprezentatywny eksperyment demonstrujący wpływ wcześniejszego podawania inhibitora syntezy białek na rCPS. Anizomycynę w roztworze soli fizjologicznej podawano dorosłemu samcowi myszy typu dzikiego C57/BL6 podskórnie (100 mg/kg) 30 minut przed rozpoczęciem oznaczania rCPS. Efekty leczenia anizomycyną w porównaniu ze zwierzęciem kontrolnym traktowanym podłożem pokazują, że rCPS jest prawie niewykrywalny u myszy leczonej anisomycyną (Ryc. 4). Dane te st...

Dyskusja

Przedstawiono ilościową metodę wyznaczania regionalnych wskaźników syntezy białek mózgowych (rCPS) in vivo u zwierząt doświadczalnych. Metoda ta ma znaczne zalety w porównaniu z istniejącymi metodami: 1. Pomiary są wykonywane u przytomnego zwierzęcia zachowującego się, dzięki czemu odzwierciedlają one zachodzące procesy zachodzące w funkcjonującym mózgu. 2. Pomiary wykonywane są za pomocą autoradiografii ilościowej, dającej możliwość jednoczesnego określenia rCPS we wszystkich regionach i podregionach mózgu. 3. Model kin...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy	Laboratorium Jacksona	003024	Fmr1 knockout pary hodowlane
Anisomycyna	Tocris Bioscience	1290
Rurki mikrohematokrytowe	Drummond Scientific	1-000-3200-H	Rurki kapilarne
Critoseal Uszczelniacz do rurek kapilarnych	Leica Microsystems	39215003	szpachlówka uszczelniająca
Fiolka szklana wkładki	Agilent	5183-2089	służące do pobierania próbek krwi
Digi-Med Analizator ciśnienia krwi	Micro-Med Inc.	Analizator ciśnienia krwi	BPA-400
monitorowania stężenia glukozy we krwi Bayer Breeze 2	Glukometr	Bayer Breeze	9570A
Strzykawka gazoszczelna	Hamilton Co.	1710	strzykawka ze szkła tuberkulinowego
Ogrzewacze do rąk HeatMax HotHands-2 Podkładki	rozgrzewające	HeatMax	Model HH2
Roztwór do spłukiwania Heparin Lock	Fresenius Kabi USA, LLC	504505	sól fizjologiczna heparyny
Przezroczysty pojemnik na zwierzęta	Wybieg dla zwierząt	Instech	MTANK/W
Sprężynowa linka	Instech	PS62	rurka cewnika/nasadka dla gryzoni
Obrotowe	Instech	375/25	do sprężynowej linki Obrotowe
ramię i mocowanie	Instech	SMCLA	Haki do krętlika i obudowy dla zwierząt
Przycisk linki	Instech	VAB62BS/22	mocowany do spodu linki sprężynowej
Rura ze stali nierdzewnej	Wykonana we własnym	zakresie N/A	używana do wężowych cewników przez mysz
Matrx VIP 3000	Matrx	91305430	waporyzator izofluranowy
Isoflurane	Stoelting Co.	50207	adsorberów izofluranowych/halotanowych
	Finisher Oster Model	59
Chirurgiczne haczyki do skóry	Wykonane we własnym zakresie (??)	Nie dotyczy (??)
0,9% sól fizjologiczna chlorku sodu	APP Pharmaceuticals LLC	918610
Kleszcze	Fine Science Tools	11274-20
Nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tools	14058-11
Mikronożyczki	Fine Science Tools	15000-00
Jedwabne szwy chirurgiczne UNIFY	AD Surgical	#S-S618R13	6-0 USP, niewchłanialne
rurki polietylenowe PE-8	SAI Infusion Technologies	PE-8-25
Strzykawka	Becton Dickinson and Co.	309659	1 cm3 / ml
	Clay Adams	427400
MCID Analysis	Imaging Research Inc.	Wersja 7.0	gęstości optycznej
Szkiełka powlekane żelatyną (75x25mm)	FD Neurotechnologies	PO101
Kriostat	Leica	CM1850
Medyczna klisza rentgenowska Super RX-N	Fuji	47410-19291
Hiperkasety (8x10 cali)	Amersham Pharmacia Biotech	11649
[1-14C]leucyna	Probówka do mikrowirówek Moravek	MC404E
	Sarstedt Aktiengesellschaft & Co.	72.692.005	służy do deproteinizacji próbek krwi
Szklana pipeta Pasteura	Wheaton	357335
Wełna szklana	Sigma-Aldrich	18421
Centrum	Zaopatrzenia w Azot NIH	6830009737285
Płyn scyntylacyjny	CytoScint	882453
Licznik scyntylacji cieczy	Packard Tri-Carb	2250CA
Analizator aminokwasów	Pickering Laboratories	Pinnacle PCX
Jednostka HPLC	Agilent Technologies	1260 Infinity	zawiera 1260 Pompa bioinertna
Mikroskop chirurgiczny	Wild Heerbrugg	M650
Kwas sulfosalicylowy	Sigma-Aldrich	MKBS1634V	Kwas 5-sulfosalicylowy dwuwodny
Norleucine	Sigma	N8513
1.0 N HCl	Sigma-Aldrich	H9892
[H3]leucyna	Moraevk	MC672
Probówka Falcon	Thermo Scientific	339652	50 mL stożkowe probówki wirówkowe
	Stoper Heuer Microsplit	Model 1000	1/100 min
Roztwór do eutanazji	Vet One	H6438
Precyzyjny oświetlacz Northern Light	Imaging Research Inc.	Model B95	świetlówka fluorescencyjna
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8	Nikon	1442	CDD