Synteza białek jest krytycznym procesem biologicznym dla komórek. W mózgu jest niezbędna do zmian adaptacyjnych. Pomiar tempa syntezy białek w nienaruszonym mózgu wymaga starannych rozważań metodologicznych. W tym artykule przedstawiono ilościową metodę autoradiograficzną L-[1-14C]-leucyny do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowa metoda autoradiograficzna do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Synteza białek jest niezbędna do rozwoju i utrzymania funkcji neuronów oraz bierze udział w zmianach adaptacyjnych w układzie nerwowym. Co więcej, uważa się, że rozregulowanie syntezy białek w układzie nerwowym może być podstawowym fenotypem w niektórych zaburzeniach rozwojowych. Dokładny pomiar tempa syntezy białek mózgowych w modelach zwierzęcych jest ważny dla zrozumienia tych zaburzeń. Metoda, którą opracowaliśmy, została zaprojektowana z myślą o zastosowaniu jej do badania obudzonych, zachowujących się zwierząt. Jest to ilościowa metoda autoradiograficzna, dzięki czemu może dawać wskaźniki we wszystkich obszarach mózgu jednocześnie. Metoda opiera się na wykorzystaniu aminokwasu znacznikowego L-[1-14C]-leucyny oraz kinetycznego modelu zachowania L-leucyny w mózgu. Wybraliśmy L-[1-14C]-leucynę jako znacznik, ponieważ nie prowadzi ona do powstania obcych znakowanych produktów przemiany materii. Jest albo wbudowywany w białko, albo szybko metabolizowany, aby uzyskać 14CO2 , który jest rozcieńczany w dużej puli nieznakowanego CO2 w mózgu. Metoda i model pozwalają również na udział nieznakowanej leucyny pochodzącej z proteolizy tkanek w puli prekursorów tkankowych do syntezy białek. Metoda posiada rozdzielczość przestrzenną pozwalającą na określenie tempa syntezy białek w warstwach komórkowych i neuropilowych, a także w jądrach podwzgórza i nerwów czaszkowych. Aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne dane ilościowe, ważne jest przestrzeganie szczegółów proceduralnych. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowe procedury ilościowej autoradiograficznej metody L-[1-14C]-leucyny do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek in vivo.
Wprowadzenie
Synteza białek jest ważnym procesem biologicznym niezbędnym do długotrwałych zmian adaptacyjnych w układzie nerwowym1. Hamowanie syntezy białek blokuje przechowywanie pamięci długotrwałej zarówno u bezkręgowców, jak i kręgowców2. Synteza białek jest niezbędna do utrzymania późnych faz niektórych form długotrwałego wzmocnienia (LTP) i długotrwałej depresji (LTD)3, przeżycia neuronów podczas rozwoju4, oraz do ogólnego utrzymania neuronu i jego połączeń synaptycznych5. Pomiar tempa syntezy białek mózgowych może być ważnym narzędziem do badania zmian adaptacyjnych, a także zaburzeń neurorozwojowych i zaburzeń związanych z uczeniem się i pamięcią.
Opracowaliśmy metodę ilościowego określania szybkości syntezy białek mózgowych in vivo u przytomnego zwierzęcia, która oferuje nieodłączną przewagę nad innymi technikami, które szacują tempo in ex vivo lub in vitro preparatów tkanki mózgowej6. Przede wszystkim można je zastosować do pomiarów w nienaruszonym mózgu u przytomnego zwierzęcia. Jest to kluczowa kwestia, ponieważ umożliwia pomiary z ustaloną strukturą i funkcją synaps oraz bez obaw o efekty pośmiertne. Co więcej, stosowane przez nas ilościowe podejście autoradiograficzne osiąga wysoki stopień lokalizacji przestrzennej. Podczas gdy energia 14C jest taka, że nie możemy zlokalizować znacznika na poziomie subkomórkowym lub komórkowym, możemy mierzyć wskaźniki w warstwach komórkowych i małych obszarach mózgu, takich jak jądra podwzgórza, z rozdzielczością około 25 μm7.
Jednym z wyzwań pomiarów in vivo za pomocą radioznaczników jest zapewnienie, że mierzony radioznacznik jest w produkcie interesującej nas reakcji, a nie w nieprzereagowanym znakowanym prekursorze lub innych obcych znakowanych produktach przemiany materii6. Wybraliśmy L-[1-14C]-leucynę jako aminokwas znacznikowy, ponieważ jest ona albo włączona do białka, albo szybko metabolizowana do 14CO2 , która jest rozcieńczana w dużej puli nieznakowanego CO2 w mózgu, co wynika z wysokiego tempa metabolizmu energetycznego8. Co więcej, każde 14C nie włączone do białka istnieje głównie jako wolna [14C]-leucyna, która w ciągu 60-minutowego okresu eksperymentalnego jest prawie całkowicie usuwana z klasy tissue6. Białka są następnie mocowane do tkanki za pomocą formaliny, a następnie płukane wodą w celu usunięcia wolnej [14C]-leucyny przed autoradiografią.
Innym ważnym czynnikiem jest kwestia rozcieńczenia specyficznej aktywności puli aminokwasów prekursorowych przez nieznakowane aminokwasy pochodzące z proteolizy tkanek. Wykazaliśmy, że u dorosłych szczurów i myszy około 40% puli prekursorów leucyny do syntezy białek w mózgu pochodzi z aminokwasów pochodzących z rozpadu białek6. Musi to zostać uwzględnione w obliczeniach regionalnych wskaźników syntezy białek mózgowych (rCPS) i musi zostać potwierdzone w badaniach, w których zależność ta może ulec zmianie. Podstawy teoretyczne oraz założenia metody zostały szczegółowo przedstawione w innym miejscu6. W niniejszym artykule skupiono się na problematyce proceduralnej związanej ze stosowaniem tej metodyki.
Ta metoda została zastosowana do określenia rCPS u wiewiórek ziemnych9, sheep10, rhesus monkeys11, rats12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, mysi model kompleksu stwardnienia guzowatego22, mysi model zespołu łamliwego chromosomu X23,24,25,26, myszy premutacji fragile X27, oraz mysi model fenyloketonurii28. W pracy przedstawiono procedury pomiaru rCPS metodą autoradiologiczną L-[1-14C]-leucyny in vivo. Przedstawiamy rCPS w obszarach mózgu wybudzonej myszy kontrolnej. Wykazaliśmy również, że podawanie in vivo anizomycyny, inhibitora translacji, znosi syntezę białek w mózgu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego (National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee) i przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health Guidelines) dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt.
Przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
1. Chirurgicznie wszczepić cewniki do żyły i tętnicy udowej odpowiednio w celu podania znacznika oraz pobierania próbek krwi tętniczej w określonych odstępach czasowych. Operację należy zakończyć co najmniej 2 h przed podaniem znacznika. Zabieg trwa około 1 h.
- Przygotuj niezbędne materiały: sterylne instrumenty chirurgiczne (nożyczki chirurgiczne, mikro-nożyczki, pęsety, trzy chirurgiczne haczyki skórne), sprzęt do anestezji izofluranem (parownik izofluranu, aktywny pochłaniacz gazów, szczelna komora anestezjologiczna, maska do nosa), sterylną podstawkę chirurgiczną, trymer do futra, 70% etanol, betadynę, sterylną gazę, taśmę chirurgiczną, komercyjne ogrzewacze do rąk, mikroskop chirurgiczny, sterylny 0,9% chlorek sodu (sól fizjologiczną), sterylną heparynę 10 USP units/mL w 0,9% chlorku sodu (heparyzowaną sól fizjologiczną), pięć sterylnych odcinków nici wchłanialnych 6-0 o długości 20 cm, sterylne odcinki cewników polietylenowych PE-8 i PE-10 o długości 25 cm z jednym końcem ściętym pod kątem 45o, sterylne strzykawki 1 cc, sterylne igły 32 G, sprzęt do kauteryzacji, sterylną pustą stalową rurkę o długości 15-20 cm (średnica wewnętrzna 2,5 mm, średnica zewnętrzna 3 mm), znieczulenia miejscowe (maść z bupiwakainą i lidokainą) oraz klatkę dla zwierząt z zestawem obrotowym (sprężynowa smycz 30 cm z guzikiem, przegub, uchwyt i ramię przegubu, przezroczysty cylindryczny pojemnik o wymiarach 20 X 13 cm).
- Przygotuj zwierzę do operacji.
- Upewnij się, że stosowane są odpowiednie techniki aseptyczne i sterylne, zgodnie z wymogami Twojej instytucji.
- Zważ zwierzę. Aby operacja zakończyła się sukcesem, zwierzę musi ważyć co najmniej 25 g.
- Umieść zwierzę w szczelnej komorze z pleksiglasu i podłącz komorę do aparatu do anestezji izofluranem. Ustaw natężenie przepływu na 2,5 L/min dla samców i 3,0 L/min dla samic przy stężeniu 1,5% izofluranu w O2. Po około 2 minach upewnij się, że mysz jest odpowiednio zsedowana, sprawdzając brak odruchu cofania poprzez uciśnięcie palca u nogi.
- Po zsedowaniu wyjmij mysz z komory i ułóż ją w pozycji brzusznej z pyszczkiem w masce anestezjologicznej. Skonfiguruj maskę tak, aby odbierała gaz z parownika i odprowadzała go do pochłaniacza gazów. Pochłaniacz zatrzyma izofluran w filtrze węglowym.
- Za pomocą trymera ogol futro między łopatkami. Pamiętaj o odpowiedniej sterylizacji ogolonego obszaru, naprzemiennie trzykrotnie przecierając go betadyną i etanolem.
- Przełóż mysz do pozycji grzbietnej, utrzymując pyszczek w masce. Przymocuj taśmą lewą nogę do podstawki chirurgicznej i użyj trymera, aby ogolić futro od wewnętrznej strony lewego uda do górnej części lewego brzucha. Pamiętaj o odpowiedniej sterylizacji ogolonego obszaru, naprzemiennie trzykrotnie przecierając go betadyną i etanolem.
- Wsuń pod mysz aktywowany, dostępny w sprzedaży ogrzewacz do rąk zawinięty w gazę. Przymocuj taśmą prawą nogę do podstawki chirurgicznej.
- Wprowadź cewnik do lewej żyły udowej.
- Z pomocą mikroskopu chirurgicznego wykonaj nożyczkami chirurgicznymi nacięcie o długości 1 cm od górnej przyśrodkowej części lewego uda w kierunku rostralnym ku linii środkowej, odsłaniając tętnicę i żyłę udową.
- Odciągnij luźną skórę za pomocą chirurgicznych haczyków skórnych, aby dodatkowo odsłonić naczynia.
- Nanieś sterylny 0,9% chlorek sodu na odsłonięty obszar, aby utrzymać odpowiednią wilgotność.
- Używając pęsety, wykonaj tępą dyssekcję, oddzielając tkankę łączną wokół niewielkiego odcinka tętnicy i żyły udowej. Ostrożnie rozdziel tętnicę od żyły (Rysunek 2).
- Za pomocą pęsety przełóż jeden odcinek nici wchłanialnej (Nici A) pod żyłę i tętnicę udową w najbardziej bocznej części nacięcia. Przeciągnij nić do połowy, tak aby końce były równe.
- W punkcie bliższym pachwinie przełóż pęsetą drugą nić (Nici B) tylko pod żyłę udową. Delikatnie zawiąż półwęzeł, który posłuży do ograniczenia przepływu krwi.
- W punkcie między Nicią A a Nicią B przełóż pęsetą trzecią nić (Nici C) tylko pod żyłę udową. Delikatnie zawiąż pełny węzeł, który posłuży do ograniczenia przepływu krwi. Uważaj, aby nie przerwać żyły.
- Delikatnie pociągnij za Nicią B, aby ograniczyć przepływ krwi. Użyj hemostatu, aby delikatnie naciągnąć Nicią B i utrzymać ograniczenie przepływu.
- Wytnij mikro-nożyczkami mały otwór w zaciśniętym obszarze żyły udowej i ostrożnie wprowadź ścięty koniec rurki PE-8 (wcześniej przemytej heparyzowaną solą fizjologiczną) w kierunku Nici B. Po wprowadzeniu zwolnij napięcie Nici B i poprowadź cewnik dalej w górę żyły. Zaciśnij Nicią B wokół żyły zawierającej cewnik.
- Używając Nici C, zawiąż dodatkowy węzeł wokół cewnika. Upewnij się, że węzeł ten nie obejmuje tętnicy udowej.
- Delikatnie odciągnij tłok strzykawki, aby częściowo napełnić rurkę krwią; potwierdzi to prawidłowe wszczepienie cewnika.
- Postępując według tej samej procedury, wprowadź cewnik PE-10 do lewej tętnicy udowej.
- Zakończ procedurę chirurgiczną.
- Po zabezpieczeniu cewników żyły i tętnicy udowej, zawiąż Nicią A węzeł wokół obu cewników.
- Odetnij nadmiar nici i usuń haczyki skórne. Przepłucz cewnik tętniczy heparyzowaną solą fizjologiczną, aby zapobiec zakrzepom. Wypal końce obu cewników, aby stworzyć szczelne zamknięcie.
- Ułóż mysz w pozycji brzusznej, wykonaj małe nacięcie u podstawy szyi i nanieś sól fizjologiczną na odsłonięty obszar.
- Wprowadź pustą metalową rurkę podskórnie od nacięcia szyjnego do nacięcia udowego. Przeciągnij cewniki przez pustą rurkę i wyprowadź je przez nacięcie szyjne. Usuń metalową rurkę. Podskórne wszczepienie cewników zapobiegnie ich uszkodzeniu przez myszy.
- Nanieś bupiwakainę na brzegi rany. Zamknij nacięcie udowe szwem. Na zamkniętą, zaszytą ranę nanieś maść z lidokainą.
- Przeciągnij cewniki przez 30-cm elastyczną pustą rurkę (sprężynową smycz) i zaszyj guzik smyczowej sprężyny pod skórą. Nanieś bupiwakainę na brzegi rany. Zaszyj guzik sprężynowej smyczy pod skórą. Na zamkniętą, zaszytą ranę nanieś maść z lidokainą.
- Przenieś mysz do przezroczystego cylindrycznego pojemnika (wysokość 20 cm, średnica 13 cm) z uchwytem i ramieniem obrotowym, aby zwierzę mogło przebywać w nim podczas okresu rekonwalescencji. Pod pojemnikiem umieść ogrzewacz do rąk, aby zapewnić zwierzęciu ciepło.
- Przykręć górną część sprężynowej smyczy do przegubu i zamocuj przegub do ramienia obrotowego przymocowanego do cylindrycznego pojemnika. Upewnij się, że mysz ma pełny zakres ruchu, a cewniki są dostępne.
- Nałóż na klatkę z żłobieniem, które nie utrudnia działania mechanizmu obrotowego. Pełny schemat zestawu przedstawiono na Rysunku 3.
- Pozostaw mysz do rekonwalescencji. Zaleca się co najmniej 2 h.
2. Przygotuj roztwór L-[1-14C]leucyny do wstrzykiwania oraz 16% (m/v) roztwór dwuwodny kwasu 5-sulfosalicylowego (SSA) do deproteinizacji próbek osocza. W roztworze SSA należy zawrzeć również 0,04 mM norleucyny oraz 1 µCi/mL [H3]leucyny jako standardy wewnętrzne odpowiednio do analizy aminokwasów oraz analizy stężenia znacznika w kwasolubnych frakcjach osocza. Roztwór SSA przechowywać do dwóch miesięcy w temperaturze 4 ˚C.
- Należy zakupić dostępne komercyjnie L-[1-14C]leucynę (50-60 mCi/mmol), sprzedawaną jako roztwór w 2% etanolu lub 0,1 N HCl. Odpowiednią aktywność znacznika należy wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu, a następnie rozpuścić w sterylnym roztworze soli fizjologicznej tak, aby uzyskać stężenie 100 μCi/mL.
3. Podaj dożylnie L-[1-14C]leucynę i pobierz próbki krwi tętniczej.
- Przygotować niezbędne materiały: 18 probówek typu microcentrifuge o pojemności 1,5 mL do deproteinacji próbek osocza (do każdej probówki dodać 70 µL wody dejonizowanej), 17 szklanych wkładów do fiolek o pojemności 250 µL (15 wkładów do pobierania próbek krwi tętniczej i 2 wkłady do pobierania krwi z przestrzeni martwej w celu ponownego wstrzyknięcia; aby ograniczyć pobieranie nadmiernej i niepotrzebnej krwi, zaleca się stosowanie małych, cienkich szklanych wkładów z tapered bottoms, które umożliwiają łatwe pipetowanie supernatantu osocza), 2 rurki mikrokapilarne (32 X 0,8 mm, do pomiaru hematokrytu), 1 probówkę do mikrocentryfugi powleczoną heparyną i fluorkiem litu (odpowiednio w celu zapobiegania krzepnięciu i glikolizie), kleszczyki hemostatyczne (końcówki należy pokryć rurkami Tygon, aby zaciski nie uszkodziły rurek PE), glukometr, przetwornik ciśnienia krwi, sterylne strzykawki 1 mL (do przemywania solą fizjologiczną) oraz dostępny w handlu roztwór do eutanazji (rozcieńczony 1:1 w wodzie dejonizowanej (dla myszy)).
- Upewnić się, że zwierzę znajduje się w normalnym stanie fizjologicznym na początku eksperymentu.
- Zacisnąć rurkę tętniczą około 2 cm od końca i odciąć końcówkę, tworząc otwór dla przepływu krwi. Następnie zwolnić zacisk rurki i pobrać krew z przestrzeni martwej (ok. 30 µL w celu usunięcia resztek soli fizjologicznej i/lub krwi z poprzednich pobrań), a w osobnej probówce pobrać próbkę kontrolną (ok. 30 µL), próbki do hematokrytu (około połowy objętości rurki kapilarnej) oraz próbkę glukozy (ok. 20 µL).
- Zmierzyć hematokryt, zatykając jeden koniec masą uszczelniającą i wirując przez 1 min przy 450 x g. Zmierzyć stosunek objętości erytrocytów do całkowitej objętości krwi. Jeśli hematokryt zwierzęcia wynosi poniżej 30%, nie kontynuować badania.
- Użyć dostępnego w handlu glukometru do pomiaru poziomu glukozy w kropli krwi.
- Wirować próbkę kontrolną przez 2 min przy 18 0 x g w celu oddzielenia osocza. Deproteinizować próbki osocza w następujący sposób: dodać 5 µL osocza do 70 µL wody dejonizowanej w probówce 1,5 mL, dodać 25 µL 16% roztworu SSA i wymieszać na wortexie. Przechowywać na lodzie przez 30 min przed zamrożeniem na suchym lodzie.
- Wstrzyknąć krew z przestrzeni martwej z powrotem do zwierzęcia przez linię żylną, a następnie przemyć linię heparynowaną solą fizjologiczną, aby zapobiec nadmiernej utracie krwi.
- Podłączyć linię tętniczą do przetwornika ciśnienia krwi w celu pomiaru średniego tętniczego ciśnienia krwi.
- Po pobraniu próbek należy ponownie zacisnąć linię tętniczą i przemyć ją niewielką objętością (50 µL) heparynowanej soli fizjologicznej.
- Podać znacznik dożylnie i pobrać w określonych odstępach czasu próbki krwi tętniczej.
- Użyć konektora Y, aby podłączyć jedną strzykawkę ze znacznikiem (10 µCi/kg) i jedną strzykawkę z 50 µL sterylnej soli fizjologicznej do przemycia linii żylnej po wstrzyknięciu znacznika. Podłączyć konektor Y do linii żylnej.
- Rozpocząć badanie, jednocześnie uruchamiając stoper i wstrzykując znacznik. Natychmiast po wstrzyknięciu przemyć linię żylną solą fizjologiczną (ok. 10 µL).
- Pobierać próbki krwi 1-7 w sposób ciągły przez pierwsze 2 min eksperymentu w ten sam sposób. Po pobraniu 7. próbki pobrać 30 µL krwi z przestrzeni martwej przed każdą z pozostałych próbek. Próbki 8-14 pobierać odpowiednio w 3, 5, 10, 15, 30, 45 i 60 min.
- Przetwarzać próbki krwi natychmiast po pobraniu, zgodnie z opisem dla próbki kontrolnej. W przypadku opóźnienia umieścić próbki na lodzie. Ostrożnie wstrzyknąć krew z przestrzeni martwej z powrotem do tętnicy za pomocą cewnika tętniczego i przemyć solą heparynowaną.
- W pewnym momencie eksperymentu przygotować trzy standardy wewnętrzne, dodając 25 µL 16% SSA, 0,04 mM norleucyny i 1 mCi/mL [3H]leucyny do 75 µL wody, wymieszać na wortexie i umieścić na lodzie.
- Po pobraniu 14. próbki w 60 min, wstrzyknąć około 0,2 mL B-euthanasia-D do linii żylnej w celu uśmiercenia zwierzęcia. Odnotować czas zgonu.
- Odkręcić zwierzę z uchwytu obrotowego i wyjąć z klatki. Ostrożnie usunąć mózg, położyć na folii aluminiowej i zamrozić na suchym lodzie. Nie mrozić mózgów ciekłym azotem, ponieważ mogą one pękać. Przechowywać mózg, próbki i standardy wewnętrzne w temperaturze -80 ˚C do czasu przetwarzania. Przetwarzanie można przeprowadzić w dowolnym późniejszym terminie.
4. Analiza stężeń leucyny i L-[1-14C]leucyny w próbkach osocza.
- Próbki oraz standardy wewnętrzne rozmrozić na lodzie, wymieszać w wortexie, a następnie wirować przy 18,0 x g przez 5 min w temperaturze 2 ˚C. Frakcja nadosadu będzie zawierać wolną leucynę znakowaną i nieznakowaną.
- Przenieść 40 µL nadosadu do fiolki do liczenia scyntylacyjnego i dodać koktajl scyntylacyjny. Ilość rozpadów na minutę (DPM) dla 3H i 14C oznaczyć za pomocą liczenia scyntylacyjnego w cieczy, wykorzystując krzywą tłumienia (quench curve) przeznaczoną do jednoczesnego liczenia podwójnego znakowania (3H i 14C).
- W celu oznaczenia stężeń leucyny w osoczu zastosować system HPLC z kolumną kationowymienną sodową oraz pochodnowaniem powydzieleniowym za pomocą o-ftalaldehydu i detekcją fluorometryczną.
- Skonfigurować system HPLC zgodnie z następującymi specyfikacjami: wzbudzenie fluorometru 30 nm i emisja 465 nm. Faza ruchoma składa się z eluentu sodowego o pH 7,40 oraz eluentu sodowego z dodatkiem 5% sulfolanu o pH 3,15. Ustawić szybkość przepływu buforu na 0,40 mL/min, a szybkość przepływu urządzenia do pochodnowania na 0,30 mL/min. Temperaturę kolumny ustawić na 48 ˚C, a temperaturę reaktora na 45 ˚C.
- Zkalibrować system przy użyciu zakresu stężeń aminokwasów (w tym norleucyny) od 30 do 50 pmol/10mL. Krzywa kalibracyjna jest liniowa. Stężenia aminokwasów w analizowanych próbkach o objętości wstrzyku 10 mL mieszczą się w zakresie tej krzywej kalibracyjnej.
5. Przeprowadź ilościową autoradiografię.
- Przygotować skrawki mózgu o grubości 20 µm do autoradiografii. Przeciąć mózg przy użyciu kriostatu w temperaturze -20 ˚C.
- Zamontować seryjne skrawki mózgu na szkiełkach powlekanych żelatyną metodą rozmrażania. Wysuszyć na powietrzu.
- Przemyć szkiełka w pięciu zmianach 10% formaliny przez 30 min na każdą zmianę, a następnie poddać działaniu ciągłego przepływu wody dejonizowanej przez 1 h. Luźno przykryć szkiełka folią, aby uniknąć osiadania kurzu, i pozostawić do wyschnięcia na 24 h.
- Umieścić szkiełka w kasecie do filmów rentgenowskich (zaleca się kasety dopasowane do filmów mammograficznych o wymiarach 20X25 cm) wraz z zestawem standardów [14C]metylometakrylanu, które wcześniej skalibrowano względem tkanek o znanych stężeniach 14C zgodnie z opisem29. Standardy można nabyć w handlu, jednak należy upewnić się, że obejmują zakres 2-300 mCi/g tkanki i są skalibrowane dla grubości tkanki 20 µm. Przy czerwonym świetle bezpiecznym położyć arkusz filmu mammograficznego, stroną emulsyjną do dołu, na skrawkach.
- Zamknąć kasety, umieścić w czarnej torbie do wymiany i przechowywać w szafce przez 40-45 dni.
- Wywołać filmy zgodnie z instrukcją producenta. Uwaga: Nie zaleca się automatycznego wywoływania filmów, ponieważ tło może być nierównomierne, co może wpłynąć na kwantyfikację.
6. Analiza obrazów.
Uwaga: Zaleca się stosowanie dostępnego komercyjnie programu do analizy obrazu sprzężonego z kamerą CCD oraz fluorescencyjnej kasetki świetlnej z równomiernym oświetleniem. Względne gęstości optyczne w oświetlonej folii są wykrywane przez kamerę CCD.
- Sporządź krzywą kalibracyjną gęstości optycznej (OD) w funkcji stężenia 14C w tkance, opierając się na wartościach OD zestawu wzorców kalibracyjnych na kliszy. Dopasuj te dane (uwzględniając próbkę ślepą lub tło) do równania wielomianowego. Bardzo dobrze pasuje równanie wielomianowe drugiego lub trzeciego stopnia.
- Aby przeanalizować konkretne obszary mózgu, zlokalizuj interesujący obszar (ROI) w sześciu do ośmiu przekrojach poprzez porównanie z atlasem mózgu. Zapisz wartości OD pikseli w obrębie ROI we wszystkich przekrojach i na podstawie krzywej kalibracyjnej oblicz stężenie 14C w tkance dla każdego piksela. Oblicz średnie stężenie 14C w tkance w obszarze ROI.
7. Obliczanie rCPS. Oblicz rCPS dla każdego ROI za pomocą następującego równania:
![Równanie równowagi statycznej \( R_i = \frac{P_i^*}{\lambda_i \int_0^T \left[\frac{C_p^*(t)}{C_p}\right] dt} \) w formule.](/files/ftp_upload/58503/58503eq1.jpg "figure-protocol-1")
Gdzie P*(T) to średnia ważona koncentracja 14C w tkance w obrębie ROI, Cp(t) i C*p(t) to tętnicze stężenia leucyny nieznakowanej i znakowanej w czasie t, T to czas śmierci zwierzęcia (około 60 min), a λ to frakcja leucyny w tkankowej puli prekursorów pochodząca z osocza. Ocena λ jest przeprowadzana w oddzielnym eksperymencie 6. λ została oceniona u myszy WT, z nokautem Fmr1, Tsc+/- oraz z PKU 6,2,25,28. Jeśli eksperyment obejmuje zmiany genetyczne lub farmakologiczne, które mogą wpływać na szybkość syntezy białek, ich degradację lub metabolizm leucyny, wartość λ powinna zostać oceniona w nowych warunkach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiamy tutaj reprezentatywny eksperyment demonstrujący wpływ uprzedniego podania inhibitora syntezy białek na rCPS. Anizomycynę w soli fizjologicznej podano dorosłemu samcowi myszy typu dzikiego C57/BL6 podskórnie (10 mg/kg) na 30 min przed rozpoczęciem oznaczania rCPS. Efekty leczenia anizomycyną w porównaniu z zwierzęciem kontrolnym traktowanym nośnikiem pokazują, że rCPS jest niemal niewykrywalny u myszy traktowanej anizomycyną (Rycina 4). Dane te s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiono ilościową metodę wyznaczania regionalnych wskaźników syntezy białek mózgowych (rCPS) in vivo u zwierząt doświadczalnych. Metoda ta ma znaczne zalety w porównaniu z istniejącymi metodami: 1. Pomiary są wykonywane u przytomnego zwierzęcia zachowującego się, dzięki czemu odzwierciedlają one zachodzące procesy zachodzące w funkcjonującym mózgu. 2. Pomiary wykonywane są za pomocą autoradiografii ilościowej, dającej możliwość jednoczesnego określenia rCPS we wszystkich regionach i podregionach mózgu. 3. Model kin...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Zengyan Xia za genotypowanie myszy, Tomowi Burlinowi za przetwarzanie aminokwasów i filmów oraz Mei Qin za przeprowadzenie niektórych eksperymentów rCPS. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program NIMH, ZIA MH00889. RMS był również wspierany przez stypendium podoktoranckie Autism Speaks 8679 oraz stypendium podoktoranckie FRAXA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myszy | Laboratorium Jacksona | 003024 | Fmr1 knockout pary hodowlane |
| Anisomycyna | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Rurki mikrohematokrytowe | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | Rurki kapilarne |
| Critoseal Uszczelniacz do rurek kapilarnych | Leica Microsystems | 39215003 | szpachlówka uszczelniająca |
| Fiolka szklana wkładki | Agilent | 5183-2089 | służące do pobierania próbek krwi |
| Digi-Med Analizator ciśnienia krwi | Micro-Med Inc. | Analizator ciśnienia krwi | BPA-400 |
| monitorowania stężenia glukozy we krwi Bayer Breeze 2 | Glukometr | Bayer Breeze | 9570A |
| Strzykawka gazoszczelna | Hamilton Co. | 1710 | strzykawka ze szkła tuberkulinowego |
| Ogrzewacze do rąk HeatMax HotHands-2 Podkładki | rozgrzewające | HeatMax | Model HH2 |
| Roztwór do spłukiwania Heparin Lock | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | sól fizjologiczna heparyny |
| Przezroczysty pojemnik na zwierzęta | Wybieg dla zwierząt | Instech | MTANK/W |
| Sprężynowa linka | Instech | PS62 | rurka cewnika/nasadka dla gryzoni |
| Obrotowe | Instech | 375/25 | do sprężynowej linki Obrotowe |
| ramię i mocowanie | Instech | SMCLA | Haki do krętlika i obudowy dla zwierząt |
| Przycisk linki | Instech | VAB62BS/22 | mocowany do spodu linki sprężynowej |
| Rura ze stali nierdzewnej | Wykonana we własnym | zakresie N/A | używana do wężowych cewników przez mysz |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | waporyzator izofluranowy |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | adsorberów izofluranowych/halotanowych |
| Finisher Oster Model | 59 | ||
| Chirurgiczne haczyki do skóry | Wykonane we własnym zakresie (??) | Nie dotyczy (??) | |
| 0,9% sól fizjologiczna chlorku sodu | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Kleszcze | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Mikronożyczki | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Jedwabne szwy chirurgiczne UNIFY | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, niewchłanialne |
| rurki polietylenowe PE-8 | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Strzykawka | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1 cm3 / ml |
| Clay Adams | 427400 | ||
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Wersja 7.0 | gęstości optycznej |
| Szkiełka powlekane żelatyną (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Kriostat | Leica | CM1850 | |
| Medyczna klisza rentgenowska Super RX-N | Fuji | 47410-19291 | |
| Hiperkasety (8x10 cali) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucyna | Probówka do mikrowirówek Moravek | MC404E | |
| Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | służy do deproteinizacji próbek krwi | |
| Szklana pipeta Pasteura | Wheaton | 357335 | |
| Wełna szklana | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Centrum | Zaopatrzenia w Azot NIH | 6830009737285 | |
| Płyn scyntylacyjny | CytoScint | 882453 | |
| Licznik scyntylacji cieczy | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Analizator aminokwasów | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| Jednostka HPLC | Agilent Technologies | 1260 Infinity | zawiera 1260 Pompa bioinertna |
| Mikroskop chirurgiczny | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Kwas sulfosalicylowy | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | Kwas 5-sulfosalicylowy dwuwodny |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucyna | Moraevk | MC672 | |
| Probówka Falcon | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL stożkowe probówki wirówkowe |
| Stoper Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min | |
| Roztwór do eutanazji | Vet One | H6438 | |
| Precyzyjny oświetlacz Northern Light | Imaging Research Inc. | Model B95 | świetlówka fluorescencyjna |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD |
Bibliografia
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034(2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
