Artykuł metodologiczny

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

DOI:

10.3791/58504

⸱

4 listopada 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP0 ulega translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Mechanizm molekularny tego zdarzenia nie jest znany. W tym miejscu opisujemy zastosowanie mikroskopu konfokalnego jako narzędzia do ilościowego określania ruchu ICP0 w zakażeniu HSV-1, co stanowi podstawę do ilościowej analizy translokacji ICP0 w przyszłych badaniach mechanistycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażone białko komórkowe 0 (ICP0) wirusa opryszczki pospolitej 1 (HSV-1) jest natychmiastowym wczesnym białkiem zawierającym ligazę ubikwityny typu RING E3. Jest odpowiedzialny za proteasomalną degradację czynników ograniczających gospodarza i późniejszą aktywację genów wirusa. ICP0 zawiera kanoniczną sekwencję lokalizacji jądrowej (NLS). Dostaje się do jądra natychmiast po syntezie de novo i realizuje swoje funkcje obronne przeciwko gospodarzowi głównie w jądrze. Jednak w późniejszej fazie infekcji ICP0 znajduje się wyłącznie w cytoplazmie, co sugeruje wystąpienie translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Przypuszczalnie translokacja ICP0 umożliwia ICP0 modulowanie swoich funkcji zgodnie z jego subkomórkowymi lokalizacjami w różnych fazach infekcji. W celu nakreślenia funkcji biologicznej i mechanizmu regulacyjnego translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej ICP0, zmodyfikowaliśmy metodę mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu monitorowania transportu ICP0 podczas infekcji HSV-1. Protokół ten obejmuje barwienie immunofluorescencyjne, obrazowanie mikroskopem konfokalnym oraz analizę dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej. Celem tego protokołu jest adaptacja obrazów konfokalnych w stanie stacjonarnym wykonanych w czasie do ilościowej dokumentacji ruchu ICP0 podczas infekcji litycznej. Proponujemy, że tę metodę można uogólnić w celu ilościowej analizy lokalizacji jądrowej i cytoplazmatycznej innych białek wirusowych lub komórkowych bez angażowania technologii obrazowania na żywo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1, co prowadzi do nawracającego zakażenia opryszczką. Zakażone białko komórkowe 0 (ICP0) jest kluczowym regulatorem wirusa, kluczowym zarówno dla litycznego, jak i utajonego zakażenia HSV-1. Transaktywuje dalsze geny wirusa poprzez przeciwdziałanie wewnętrznej/wrodzonej obronie przeciwwirusowej gospodarza2,3. ICP0 wykazuje aktywność ligazy ubikwityny E3, która jest ukierunkowana na kilka czynników komórkowych degradacji zależnej od proteasomu3. Oddziałuje również z różnymi szlakami komórkowymi, regulując ich aktywność, a następnie równoważąc ograniczenia przeciwwirusowe gospodarza3. Wiadomo, że ICP0 lokalizuje się w różnych przedziałach subkomórkowych w miarę postępu infekcji3,4,5. Białko ma bogaty w lizynę/argininę sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) zlokalizowany w resztach od 500 do 5066. Po syntezie de novo we wczesnym zakażeniu HSV-1, ICP0 jest natychmiast importowany do jądra. Po raz pierwszy wykrywa się go w dynamicznej strukturze jądrowej określanej jako domena jądrowa 10 (ND10)7. Aktywność ligazy ubikwityny E3 ICP0 wyzwala degradację białek organizatora ND10, białka białaczki promielocytowej (PML) i białka nakrapianego 100 kDa (Sp100)8,9,10. Po utracie białek organizatorowych, ciała jądrowe ND10 są rozpraszane, a ICP0 ulega dyfuzji, wypełniając całe jądro4,11.

Ciekawe, po rozpoczęciu replikacji DNA wirusa, ICP0 znika z jądra. Występuje wyłącznie w cytoplazmie, co sugeruje wystąpienie translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej pod koniec infekcji HSV-14,12. Wymóg replikacji DNA implikuje potencjalny udział późnego białka (białek) wirusa w ułatwianiu cytoplazmatycznej translokacji HSV-1 ICP04,12. Wygląda na to, że transport ICP0 między różnymi przedziałami podczas infekcji umożliwia ICP0 modulowanie swoich interakcji z różnymi szlakami komórkowymi w sposób przestrzenno-czasowy, a tym samym koordynowanie swoich wielu funkcji w celu precyzyjnego dostrojenia równowagi między lityczną a utajoną infekcją HSV-113. Aby lepiej zrozumieć wielofunkcyjność ICP0 i koordynację domen funkcjonalnych ICP0 w całej infekcji litycznej, dokładnie przeanalizowaliśmy molekularne podstawy dynamicznej translokacji ICP012. Aby przeprowadzić wcześniej opisane badania mechanistyczne12, zastosowaliśmy metodę barwienia immunofluorescencyjnego, aby zobrazować lokalizację subkomórkową ICP0 w różnym stanie infekcji pod mikroskopem konfokalnym. Opracowaliśmy również protokół ilościowy do analizy dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej ICP0 za pomocą oprogramowania konfokalnego. Populacja komórek zakażonych HSV-1 została zestawiona w tabelach we wszystkich fazach infekcji i przeanalizowano trendy ruchu ICP0 w ramach różnych zabiegów biochemicznych12. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół, który dokumentuje translokację ICP0 w zakażeniu HSV-1. Proponujemy, aby ta metoda mogła zostać przyjęta jako ogólna metoda badania translokacji jądrowej i cytoplazmatycznej dla innych białek wirusowych lub komórkowych, co może służyć jako alternatywa dla obrazowania na żywo, gdy technika obrazowania na żywo nie ma zastosowania z powodu problemów, takich jak metoda znakowania, intensywność sygnału lub obfitość białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wysiewanie komórek i infekcja wirusowa

  1. W 20–24 godziny przed zakażeniem wirusem, nasiona 5 x 104 ludzkich komórek fibroblastów płuc zarodkowych (HEL) lub innych komórek, które należy zbadać na 4-dołkowym 11 mm schodkowym szkiełku w pożywce wzrostowej (zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2 ).
    UWAGA: Każda studzienka powinna mieć 70-80% zbiegu komórek w momencie infekcji.
  2. Następnego dnia należy usunąć pożywkę wzrostową i zainfekować komórki wirusami w pożywce 199 w zakresie 4–10 pfu/komórkę. Inkubować komórki zakażone wirusem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. W okresie inkubacji należy wstrząsać szkiełkiem.
  3. Po 1 godzinnej inkubacji usunąć Medium-199 i uzupełnić pożywką wzrostową.
    UWAGA: Leki, które zakłócają różne fazy infekcji, mogą być dodawane na tym etapie lub przed wchłonięciem wirusa.
  4. Inkubować komórki zakażone wirusem w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez różną długość okresu infekcji.

2. Utrwalenie i przepuszczalność

  1. W odpowiednim momencie infekcji szybko przemyj zakażone komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 3 razy i dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu świeżo przygotowanego w PBS. Inkubuj komórki z paraformaldehydem przez 8-10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki w każdym dołku.
  2. Odessać paraformaldehyd i przemyć studzienki 200 μl PBS 3 razy. Całkowicie odessać PBS po 3praniu.
  3. Dodaj 100 μl 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego do każdej studzienki, aby przepuszczalność komórek przez 5–10 minut.
  4. Odessać niejonowy środek powierzchniowo czynny i przemyć studzienki 200 μl PBS 3 razy.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Całkowicie odessać PBS i dodać 200 μl buforu blokującego (1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5% surowicy końskiej w PBS) do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Dodać eksperymentalnie określone stężenie przeciwciała pierwszorzędowego (królicze przeciwciało poliklonalne anty-ICP0 12) w buforze blokującym i inkubować przeciwciało pierwszorzędowe w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Przemyć buforem blokującym 3 razy w 10 minutowej inkubacji. Dodać sprzężone z Alexa 594 kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi (1:400 rozcieńczone w buforze blokującym) i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie umyć szkiełka 3 razy buforem blokującym w odstępie 10 minut.
  4. Na koniec umyj szkiełko raz PBS, aby usunąć resztki BSA i końskiej surowicy.
  5. Dodaj jedną kroplę podłoża mocującego antifade z 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI), aby zamontować szkiełko i uszczelnić je szkiełkiem nakrywkowym za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.

4. Obrazowanie konfokalne

  1. Za pomocą mikroskopu konfokalnego ustaw długość fali na 590–650 nm dla Alexa 594 i 410–520 nm dla DAPI. Wybierz format obrazu 1024 x 1024 i średnią liniową 8, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości.
  2. Przeanalizuj każdą studzienkę na 4-dołkowym szkiełku pod mikroskopem konfokalnym. Uzyskaj reprezentatywne obrazy komórek pod obiektywem 100X, jak pokazano na Rysunek 1 i Rysunek 2.
  3. Aby zliczyć dużą liczbę komórek, wykonaj zdjęcia kolejnych pól pod obiektywem 40X.
    UWAGA: Potrzeba 5–10 obrazów, aby zgromadzić ponad 200 zainfekowanych komórek z każdego punktu czasowego każdej infekcji.
  4. W każdym eksperymencie należy wykonać zdjęcia ze stałymi parametrami konfokalnymi dla wszystkich próbek.

5. Analiza dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej

  1. Otwórz projekt za pomocą oprogramowania konfokalnego. Wybierz obraz, z którego komórki muszą zostać zestawione w tabeli pod kątem dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej ICP0.
  2. Kliknij zakładkę "Ilość" w górnym menu i wybierz "sortuj ROI" z menu narzędzi.
  3. Narysuj linię podłużną w poprzek komórki, która ma być analizowana, wybierając "Rysuj linię" z górnego menu.
    UWAGA: Pojawi się histogram pokazujący intensywność fluorescencji wzdłuż linii zarówno dla ICP0, jak i DAPI. Na histogramie niebieska linia reprezentuje piksele DAPI i wyznacza granicę jądra, podczas gdy czerwona linia reprezentuje piksele ICP0.
  4. Na podstawie barwienia tła ustaw stały próg intensywności ICP0, aby przeanalizować dystrybucję subkomórkową ICP0 w każdym eksperymencie.
    1. Jak pokazano na przykładzie Rysunek 2, jeśli czerwony sygnał jest średnio poniżej progu w obszarze jądrowym, ale jest powyżej progu poza niebieską granicą, skategoryzuj czerwony sygnał jako zlokalizowany głównie w cytoplazmie.
    2. Jeśli sygnał czerwony znajduje się powyżej progu w całym jądrze i poza granicą sygnału niebieskiego, pogrupuj sygnał czerwony jako jądro plus lokalizacja cytoplazmatyczna.
    3. Jeśli sygnał czerwony znajduje się powyżej progu w jądrze, ale średnio znajduje się poniżej niego poza granicą sygnału niebieskiego, należy pogrupować sygnał czerwony jako lokalizację jądrową.
  5. Zbierz w tabeli ponad 200 zainfekowanych komórek z każdej próbki w różnym czasie infekcji i narysuj wykres słupkowy, aby zilustrować ruch ICP0 w zależności od czasu (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć molekularne podstawy i biologiczne funkcje transportu ICP0 podczas infekcji HSV-1, używamy metody mikroskopii immunofluorescencyjnej do analizy dystrybucji subkomórkowej ICP0 w różnych fazach infekcji. Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne komórki z charakterystyczną lokalizacją ICP0 w miarę postępu infekcji. Aby określić ilościowo translokację ICP0 od jądra do cytoplazmy, analizujemy rozkład ICP0 względem jądra, kategoryzując zakażone komórki na t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został wykorzystany do badania translokacji ICP0 HSV-1 z jądra do cytoplazmy. ICP0 ulega transportowi subkomórkowemu podczas infekcji HSV-1 (ryc. 1). Prawdopodobnie ICP0 oddziałuje z różnymi szlakami komórkowymi, aby wykonywać różne funkcje w różnych lokalizacjach. Dzięki temu ICP0 może dostroić swoje liczne funkcje w przeciąganiu liny z ludzkim gospodarzem13. Jednak sposób, w jaki ICP0 koordynuje wiele funkcji w sposób przestrzenno-czasowy, nie został do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy finansowemu wsparciu z grantu NIH (RO1AI118992) przyznanego Haidong Gu. Dziękujemy Centrali Mikroskopii, Obrazowania i Cytometrii (MICR) na Uniwersytecie Stanowym Wayne za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
komórki i wirusy
ludzkie embrionalne fibroblasty płuc (komórki HEL)Dr Thomas E. Shenk (Uniwersytet Princeton)Komórki HEL hodowano w DMEM uzupełnionym 10%
wirusem FBS HSV-1 Stock (szczep F)Dr. Bernard Roizman Lab
Średni
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Invitrogen  11965-092
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF0926-500ml
Medium-199 (10x)Gibco11825-015
Odczynniki
- well 11 mm schodkowa naprzemiennaCel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% roztwór paraformaldehydu (w/v) Bez metanoluThermo Scientific28908
Triton X-100Odczynniki FisherBP151-1C0
Surowica bydlęca Abumin (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
Surowica dla koniSigmaH1270
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4)Dr. Haidong Gu lab
NaCl           Bioodczynnik FisherBP358-212
KH2PO4                       Bioodczynnik FisherBP362-500
KCl                         Fisher Naukowy BP366-500
Na2HPO4                         Fisher BioreagentBP332-500
Bufor blokujący (PBS z 1% BSA i 5% surowicą końską)Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Przeciwciało anty-ICP0Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Mysi monoklonalny IgGsanta Cruz BiotechnologySC-966
Alexa Fluor 594-kozia anty-królicza IgGinvitrogenA11012
Alexa Fluor 488-koza anty-mysia IgGinvitrogenA11001
Vectashield Pożywka do metalu z laboratoriami DAPIVectorPipeta H-1200
PasteurFisher Brand13-678-20D
Lakier do paznokciSally Hansen
Sprzęt
MikroskopkonfokalnyLeica SP8
Confocal SoftwareLeica LAS X Pakiet aplikacji Oprogramowanie
ExcelMicrosoft Excel
Inkubator CO2 ThermoScientificKod zamówienia 51026282
4

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13 (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378(2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Translokacja j drowo cytoplazmatycznabia ko ICP0 wirusa HSV 1analiza transportu bia eklokalizacja subkom rkowaprotok obrazowania konfokalnegopomiar intensywno ci fluorescencjibarwienie j dra DAPIprzebieg czasowy infekcjiaktywacja gen w wirusowych

Powiązane artykuły