Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie poklatkowe to potężna metoda analizy zachowania migrujących komórek. Po znakowaniu komórek fluorescencyjnych ruch znakowanych komórek w hodowli można zarejestrować pod mikroskopem wideo. Do analizy migracji komórek w rozwijającym się mózgu, hodowla plastrów jest powszechnie stosowana do obserwacji migracji komórek równolegle do sekcji plasterka, takiej jak radialna migracja komórek. Jednak metoda hodowli warstwowej umożliwia uzyskanie ograniczonych informacji w celu analizy migracji komórek prostopadłej do przekroju wycinka, takiej jak styczna migracja komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokoły obrazowania poklatkowego w celu wizualizacji migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt. Połączenie znakowania komórek za pomocą elektroporacji in ovo i późniejszej hodowli płaskiej na wkładce do hodowli komórkowej umożliwia wykrycie migrującego ruchu komórek w płaszczyźnie poziomej. Co więcej, nasza metoda ułatwia wykrywanie zarówno zachowania pojedynczych komórek, jak i zbiorowego działania grupy komórek w dłuższej perspektywie. Metoda ta może być potencjalnie zastosowana do wykrywania sekwencyjnych zmian mikrostruktury znakowanej fluorescencyjnie, w tym wydłużenia aksonów w tkance nerwowej lub przemieszczenia komórek w tkance nieneuronalnej.
Wprowadzenie
Badania nad migracją komórek postępują wraz z rozwojem techniki obrazowania na żywo. Po znakowaniu komórek fluorescencyjnych, ruch czasowy znakowanych komórek w naczyniu hodowlanym lub in vivo można zarejestrować pod mikroskopią wideo. W badaniach nad rozwojem neuronalnym przeanalizowano zmiany morfologiczne migrujących komórek lub wydłużających się aksonów za pomocą obrazowania poklatkowego. Aby obrazowanie było skuteczne, konieczne jest zastosowanie odpowiedniej metody znakowania komórek fluorescencyjnych i przygotowania tkanek, w oparciu o cel eksperymentu i analizy. Do analizy migracji komórek w rozwijającym się mózgu, hodowla warstwowa była powszechnie stosowana do obserwacji migracji komórek równolegle do sekcji wycinka, takich jak radialna migracja komórek1,2,3. System hodowli warstwowej jest również używany do wykrywania migracji komórek stycznych4,5, ale nie nadaje się do analizy kierunkowej w przypadkach, gdy komórki rozpraszają się prostopadle do sekcji warstwy.
Tektum wzrokowe składa się z wielowarstwowej struktury, utworzonej przez promienistą i sttyczną migrację komórek podczas rozwoju embrionalnego. Tworzenie się warstwy tektalnej zależy przede wszystkim od radialnej migracji postmitotycznych neuronalnych komórek prekursorowych ze strefy komorowej, a ich ostateczne miejsce przeznaczenia w warstwach koreluje z ich datą urodzenia w strefie komorowej6. Jeśli chodzi o migrację styczną, wcześniej informowaliśmy o dwóch strumieniach migracji w środkowej i powierzchownej warstwie w rozwijającym się tektum optycznym piskląt. W środkowych warstwach podczas E6-E8 komórki dwubiegunowe z długim wyrostkiem wiodącym i cienkim wyrostkiem końcowym migrują grzbietowo lub brzusznie wzdłuż pęczka aksonów tektalnie odprowadzających, które biegną grzbietowo-brzusznie7. Po tej migracji aksofilnej komórki różnicują się w wielobiegunowe neurony zlokalizowane w głębokich warstwach. W warstwach powierzchownych podczas E7-E14 migrujące komórki rozpraszają się poziomo, przekształcając rozgałęziony proces wiodący i rozpraszają się w wielu kierunkach8. Po rozproszeniu migracji te ostatnie komórki ostatecznie różnicują się w powierzchowne neurony o różnej morfologii. W obu przypadkach hodowla płaska jest skuteczna w obserwacji ruchu komórek równolegle do powierzchni błony.
Tutaj prezentujemy protokół obrazowania poklatkowego do wizualizacji migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt7,8. Połączenie znakowania komórek za pomocą elektroporacji w ovo i późniejszej hodowli płaskiej na wkładce do hodowli komórkowej umożliwia wykrycie migrującego ruchu komórki i kierunku migracji. Celem tej metody jest ułatwienie wykrywania zarówno zachowania poszczególnych komórek w długim okresie, jak i zbiorowego działania grupy komórek w płaszczyźnie poziomej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1 . Elektroporacja In Ovo
- Przygotować ekspresję plazmidowego DNA do znakowania fluorescencyjnego w wysokim stężeniu. Wyizolować DNA z 200 ml kultury bakteryjnej metodą lizy alkalicznej przy użyciu kolumn wymieniacza anionowego zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów). Zmieszać pCAGGS-EGFP i pCAGGS-mCherryNuc w końcowym stężeniu 4 μg/μL każdy.
UWAGA: Oczyszczanie plazmidowego DNA bez endotoksyn może być preferowane w przypadku elektroporacji. - Płodne jaja kurze inkubować poziomo w temperaturze 38 °C i wilgotności względnej 70%.
- Po 2,5 dnia usuń 5 ml białka (białka jaja) ze spiczastej strony jajka za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z igłą o rozmiarze 18 i uszczelnij otwór igły taśmą.
- Odetnij górną część skorupki jajka zakrzywionymi nożyczkami, aby otworzyć otwór o średnicy 2 cm i sprawdź stadium rozwoju zarodka pod mikroskopem stereoskopowym (etap 17 klasy Hamburger and Hamilton9). Ponownie uszczelnij otwór taśmą.
UWAGA: Ten krok można wykonać w dowolnym momencie podczas E2.5-E3.0. Kroki 1.3 i 1.4 obniżają poziom zarodka w komórce jajowej, aby uniknąć ścisłego przylegania rosnącego zarodka i naczyń krwionośnych do górnej skorupy. - Kontynuować inkubację do E5.5.
- Przed elektroporacją należy przygotować 10 μl wspomnianego plazmidowego DNA zabarwionego 0,5 μl Fast Green (25 mg/mL), 10 ml autoklawowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającego penicylinę (100 jednostek/ml) i streptomycynę (100 μg/ml) oraz mikropipety wykonane ze szklanych kapilarnych probówek za pomocą procesora do mikropipet. Odciąć dystalną końcówkę mikropipety, aby uzyskać por o odpowiedniej wielkości w zależności od ilości DNA do wstrzyknięcia.
- Przetnij zapieczętowaną górną skorupę nożyczkami, aby ponownie otworzyć otwór o średnicy 2,5 cm i stabilnie umieść jajko pod mikroskopem stereoskopowym. Dodaj kilka kropli PBS do jajka. Oderwij błonę omocznikową pokrywającą zarodek bez krwotoku za pomocą dwóch cienkich kleszczyków. Usuń owodnię z głowy zarodka.
- Obracając głowę mikroszpatułką, wstrzyknąć 0,1-1 μl kolorowego DNA do jamy komorowej lewej cewki wzrokowej za pomocą mikropipety podłączonej do rurki ssącej.
UWAGA: Ilość wstrzykniętego DNA zależy od celu eksperymentu. Skoncentrowany roztwór DNA powinien opadać i przyczepiać się wzdłuż ściany komory. - Umieść parę elektrod typu kleszczowego (elektrody kwadratowe 3 mm z odległością 7 mm) tak, aby obszar docelowy osłony optycznej znajdował się pomiędzy nimi (Rysunek 1, Krok 1).
UWAGA: DNA jest elektroporowane do strony anody. - Naładuj impuls wstępny 30 V, 1 ms w odstępie 5 ms i cztery kolejne impulsy 6 V, 5 ms w odstępie 10 ms za pomocą generatora impulsów.
UWAGA: Stan elektroniki zależy od rozmiaru i odległości elektrod. Powinien być wystarczająco silny, aby osiągnąć wydajną transfekcję, ale musi być wystarczająco skromny, aby zapewnić normalny rozwój tkanki docelowej. - Uszczelnij otwór taśmą i kontynuuj inkubację. Namocz elektrody w PBS w celu usunięcia białka za pomocą szczoteczki międzyzębowej w plastikowym naczyniu. Powtórz 1,7-1,11 dla każdego jajka.
2. Hodowla płaska na wkładce do komórki
- Dzień przed hodowlą płaską należy przygotować powlekaną wkładkę do hodowli komórkowej. Umieść kilka wkładek do hodowli komórkowych na autoklawowanej wodzie destylowanej w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. Załadować roztwór 8 μg/ml lamininy i 80 μg/ml poli-L-lizyny, aby przykryć wkładki i pozostawić pływające wkładki w inkubatorze CO2 do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na noc.
UWAGA: Następnego dnia powlekane wkładki można przechowywać w temperaturze 4 °C. - W dniu hodowli w E7.0 wyjmij roztwór lamininy-poli-L-lizyny z wkładki i umieść wkładkę w naczyniu ze szklanym dnem (Rysunek 1, Krok 2) wypełnionym 1,1 ml pożywki hodowlanej (60% zredukowana pożywka w surowicy, 20% F12, 10% płodowa surowica bydlęca, 10% surowica piskląca, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny). Przechowywać naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowychCO 2 w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Pożywkę można stosować przez cały okres hodowli przez trzy dni bez zmian. - Przygotuj konfigurację kultury. Ustawić jednostkę wilgotnej komory na odwróconym mikroskopie konfokalnym o przepływie gazu 40%O2 i 5% CO2 (regulator gazu) w temperaturze 38 °C (regulator temperatury).
- Wytnij głowę zarodka nożyczkami. Ściśnij głowę kleszczami w lodowatym roztworze soli Hanksa (HBSS) w 6-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych.
- Odizoluj elektroporowaną osłonę optyczną za pomocą dwóch cienkich kleszczyków. Przenieś tectum z plastikowym zakraplaczem do innego naczynia wypełnionego lodowatym HBSS. Użyj wklęsłego szklanego naczynia na bazie czarnego silikonu jako spodka do krojenia.
- Sprawdź położenie oznakowania pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Wytnij tkankę tektalną otaczającą obszar etykietowania za pomocą noża mikrochirurgicznego. Upewnij się, że kierunek tkanki w tectum (przednio-tylny, grzbietowo-brzuszny).
- Przenieś oznakowaną tkankę za pomocą plastikowego zakraplacza do wkładu tak, aby strona pia była przymocowana do wkładu. Ułóż tkankę tektalną w pożądanym kierunku i usuń nadmiar HBSS (Rysunek 1, Krok 2).
- Powtórzyć czynności 2,4-2,7 w celu przygotowania innych tkanek na tej samej wkładce. Umieść naczynie w podgrzanej komorze w odwróconym mikroskopie konfokalnym (Rysunek 1, Krok 3).
3. Obrazowanie poklatkowe
- Sprawdź oznakowanie fluorescencyjne i skoncentruj pole mikroskopowe w odwróconym mikroskopie konfokalnym. Uruchom laserowe jednostki konfokalne i spróbuj pobrać próbki skanu konfokalnego, aby dostosować kierunek i położenie tkanki wzdłuż osi X i Y w terenie. Używaj soczewek obiektywowych 10X lub 20X bez olejku immersyjnego.
- Wybierz rozmiar skanowania (np. 512x512 dpi). Określ interwał i całkowity zakres skanowania konfokalnego wzdłuż osi z. Dla zakresu 100 μm należy przyjąć odstęp 5 lub 10 μm. Określ przedział czasowy obrazowania konfokalnego i całkowity czas trwania obrazowania (np. 10-minutowe odstępy w ciągu 48 godzin).
UWAGA: Aby uniknąć fototoksyczności laserowej, należy zabronić skanowania w dużym rozmiarze skanowania z krótkimi odstępami Z dla długiego zakresu Z lub z krótkimi odstępami czasu podczas długiego czasu trwania obrazowania. Na przykład w przypadku stosowania dużego rozmiaru skanowania (np. 1024x1024 dpi) należy zmniejszyć liczbę skanów wzdłuż osi z. - Ustaw parametry programu do pracy konfokalnej opisanego w ppkt 3.2 i rozpocznij obrazowanie.
- Po obrazowaniu połącz obrazy konfokalne w różnych osiach z, aby uzyskać obrazy ze stosu z precyzyjną regulacją ogniskowej w każdym punkcie czasowym.
- Dołącz obrazy z-stack w różnych punktach czasowych i skonstruuj film poklatkowy w formacie AVI.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 2 przedstawia wizualizację powierzchownej migracji stycznej w kulturze typu flat-mount w określonych odstępach czasu (0, 9, 18, 27 h) po rozpoczęciu rejestracji. Film 1 to film typu time-lapse z interwałami 10 min przez okres 28 h i 50 min. Kadrowanie zostało dobrane tak, aby skupić się na migrujących komórkach, od oznaczonego lewego dolnego rogu klatki do nieoznaczonej przestrzeni (Rysunek 3A
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany powyżej protokół jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania migracji komórek w warstwach powierzchniowych 6,8. Ma zastosowanie do wykrywania strumieni migracji warstwy środkowej (film 5)6,7, po prostu poprzez przesunięcie czasu elektroporacji (E5,5 do E4,5) oraz początku hodowli i obrazowania (E7,0 do E6,0).
Przedstawiona procedura skład...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez JSPS KAKENHI Grant Number 15K06740 dla Y.W.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | do oczyszczania plazmidu DNA bez endotoksyn |
| strzykawka 20 ml Igła | TERUMO | SS-20ESZ | |
| o rozmiarze 18 | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicylina i streptomycyna | Gibco | 15140-122 | |
| szklana rurka kapilarna | Narishige | G-1 | |
| wkładka do hodowli komórkowej | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | powłoka wkładki hodowlanej |
| poli-L-Lizyna | Peptyd Instytut | 3075 | powłoka wkładki hodowlanej |
| szklane naczynie dolne | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | pożywka hodowlana |
| F12 | Gibco | 11765-054 | pożywka hodowlana |
| płodowa surowica bydlęca | Gibco | 12483 | pożywka hodowlana |
| piskląt | Pożywka hodowlana Gibco | 16110082 | pożywka |
| hodowlana 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| nóż mikrochirurgiczny | Specjalizacje chirurgiczne współpraca | 72-1501 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Sprzęt | |||
| zakrzywione nożyczki | AS ONE | No.11 | |
| procesor mikropipet | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| elektroda kleszczowa | BEX | LF646P3x3 | |
| generator impulsów | Elektroporator | BEX | CUY21EX |
| fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Mikroskop fluorescencyjny | odwrócony Leica | MZ16F | |
| Kontroler | |||
| Regulator temperatury Tokken | MIGM/OL-2 | ||
| Laserowa jednostka konfokalna | |||
Bibliografia
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266(2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
