Method Article

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

DOI:

10.3791/58506

⸱

October 24th, 2018

 ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Embryology, School of Medicine, Fukushima Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie poklatkowe to potężna metoda analizy zachowania migrujących komórek. Po znakowaniu komórek fluorescencyjnych ruch znakowanych komórek w hodowli można zarejestrować pod mikroskopem wideo. Do analizy migracji komórek w rozwijającym się mózgu, hodowla plastrów jest powszechnie stosowana do obserwacji migracji komórek równolegle do sekcji plasterka, takiej jak radialna migracja komórek. Jednak metoda hodowli warstwowej umożliwia uzyskanie ograniczonych informacji w celu analizy migracji komórek prostopadłej do przekroju wycinka, takiej jak styczna migracja komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokoły obrazowania poklatkowego w celu wizualizacji migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt. Połączenie znakowania komórek za pomocą elektroporacji in ovo i późniejszej hodowli płaskiej na wkładce do hodowli komórkowej umożliwia wykrycie migrującego ruchu komórek w płaszczyźnie poziomej. Co więcej, nasza metoda ułatwia wykrywanie zarówno zachowania pojedynczych komórek, jak i zbiorowego działania grupy komórek w dłuższej perspektywie. Metoda ta może być potencjalnie zastosowana do wykrywania sekwencyjnych zmian mikrostruktury znakowanej fluorescencyjnie, w tym wydłużenia aksonów w tkance nerwowej lub przemieszczenia komórek w tkance nieneuronalnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad migracją komórek postępują wraz z rozwojem techniki obrazowania na żywo. Po znakowaniu komórek fluorescencyjnych, ruch czasowy znakowanych komórek w naczyniu hodowlanym lub in vivo można zarejestrować pod mikroskopią wideo. W badaniach nad rozwojem neuronalnym przeanalizowano zmiany morfologiczne migrujących komórek lub wydłużających się aksonów za pomocą obrazowania poklatkowego. Aby obrazowanie było skuteczne, konieczne jest zastosowanie odpowiedniej metody znakowania komórek fluorescencyjnych i przygotowania tkanek, w oparciu o cel eksperymentu i analizy. Do analizy migracji komórek w rozwijającym się mózgu, hodowla warstwowa była powszechnie s....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 . Elektroporacja In Ovo

  1. Przygotować ekspresję plazmidowego DNA do znakowania fluorescencyjnego w wysokim stężeniu. Wyizolować DNA z 200 ml kultury bakteryjnej metodą lizy alkalicznej przy użyciu kolumn wymieniacza anionowego zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów). Zmieszać pCAGGS-EGFP i pCAGGS-mCherryNuc w końcowym stężeniu 4 μg/μL każdy.
    UWAGA: Oczyszczanie plazmidowego DNA bez endotoksyn może być preferowane w przypadku elektroporacji.
  2. Płodne jaja kurze inkubować poziomo w temperaturze 38 °C i wilgotności względnej 70%.
  3. Po 2,5 dnia usuń 5 ml białka (białka jaja) ze spiczastej strony jajk....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje wizualizację powierzchownej migracji stycznej w kulturze flat-mount w czasie, który upłynął (0, 9, 18, 27 h) po rozpoczęciu rejestracji. Film 1 to film poklatkowy trwający 10 minut w okresie 28 godzin i 50 minut. Klatka jest wybierana w celu ustawienia ostrości na migrujących komórkach z oznaczonego lewego dolnego rogu ramki do przestrzeni bez etykiety (Rysunek 3A). Masowy ruch.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania migracji komórek w warstwach powierzchniowych 6,8. Ma zastosowanie do wykrywania strumieni migracji warstwy środkowej (film 5)6,7, po prostu poprzez przesunięcie czasu elektroporacji (E5,5 do E4,5) oraz początku hodowli i obrazowania (E7,0 do E6,0).

Przedstawiona procedura skład.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez JSPS KAKENHI Grant Number 15K06740 dla Y.W.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiały
NucleoBond Xtra Midi Plus EFMACHEREY-NAGEL740422.5do oczyszczania plazmidu DNA bez endotoksyn
strzykawka 20 ml IgłaTERUMOSS-20ESZ
o rozmiarze 18TERUMONN-1838R
Fast GreenWako061-00031
100x penicylina i streptomycynaGibco15140-122
szklana rurka kapilarnaNarishigeG-1
wkładka do hodowli komórkowejMilliporeMillicell CM-ORG
LamininSIGMAL2020powłoka wkładki hodowlanej
poli-L-LizynaPeptyd Instytut3075powłoka wkładki hodowlanej
szklane naczynie dolneMatsunamiD11130H
Opti-MEMGibco31985-070pożywka hodowlana
F12Gibco11765-054pożywka hodowlana
płodowa surowica bydlęcaGibco12483pożywka hodowlana
pisklątPożywka hodowlana Gibco16110082pożywka
hodowlana 10xHBSSGibco14065-056
nóż mikrochirurgicznySpecjalizacje chirurgiczne współpraca72-1501
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Sprzęt
zakrzywione nożyczkiAS ONENo.11
procesor mikropipetSUTTER INSTRUMENTP97/IVF
elektroda kleszczowaBEXLF646P3x3
generator impulsówElektroporatorBEXCUY21EX
fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Mikroskop fluorescencyjnyodwrócony LeicaMZ16F
Kontroler
Regulator temperatury TokkenMIGM/OL-2
Laserowa jednostka konfokalna
zestaw gazu Olympus IX81 Tokai Hit MI-IBC Olympus FV300

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time ima....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tangential Cell MigrationChick Optic TectumTime lapse ImagingIn Ovo ElectroporationFlat mount CultureConfocal MicroscopyCell Culture InsertFluorescent LabelingNeuronal Cell MigrationParticle Tracking

Related Articles