Niniejszym przedstawiamy protokół do pomiaru przy łóżku pacjenta aktywności endotoksyn w próbkach ludzkiej krwi pełnej. Test aktywności endotoksyn jest prostym do wykonania testem i może być użytecznym biomarkerem u krytycznie chorych pacjentów z sepsą.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test aktywności endotoksyn w celu wykrycia endotoksemii krwi pełnej u pacjentów w stanie krytycznym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Lipopolisacharyd, znany również jako endotoksyna, jest podstawowym składnikiem bakterii Gram-ujemnych i odgrywa kluczową rolę w rozwoju sepsy i wstrząsu septycznego. Wczesna identyfikacja procesu zakaźnego, który szybko ewoluuje w chorobę krytyczną, może skłonić do szybszego i bardziej intensywnego leczenia, co potencjalnie może prowadzić do lepszych wyników leczenia pacjentów. Test aktywności endotoksyn (EA) może być stosowany przy łóżku pacjenta jako wiarygodny biomarker endotoksemii układowej. Wielokrotnie wykazano, że wykrycie podwyższonego poziomu aktywności endotoksyn wiąże się ze zwiększonym nasileniem choroby u pacjentów z sepsą i wstrząsem septycznym. Test jest szybki i łatwy do wykonania. Krótko, po pobraniu próbki, podwielokrotność krwi pełnej miesza się z przeciwciałem anty-endotoksynowym i z dodatkiem LPS. Aktywność endotoksyn mierzy się jako względny wybuch oksydacyjny zaszczepionych neutrofili wykrywany przez chemioluminescencję. Wyniki testu są wyrażone w skali od 0 (brak) do 1 (maksymalnie) i sklasyfikowane jako "niskie" (<0,4 jednostki), "pośrednie" (0,4–0,59 jednostki) lub "wysokie" (≥0,6 jednostki). Szczegółowa metodologia i uzasadnienie wdrożenia testu EA zostały przedstawione w niniejszym manuskrypcie.
Wprowadzenie
Lipopolisacharyd (LPS), znany również jako endotoksyna, jest kluczowym składnikiem struktury błony bakterii Gram-ujemnych (GN). Stanowi około 10% ściany komórkowej i ma kluczowe znaczenie dla integralności błony zewnętrznej i homeostazy. Co więcej, jest silnym aktywatorem wrodzonego układu odpornościowego gospodarza1,2.
Narażenie in vitro wrodzonych komórek układu odpornościowego na LPS prowadzi do zmian w ekspresji wielu genów3. Podanie bardzo małych ilości LPS zdrowym ochotnikom wyzwala kaskadę ostrego ogólnoustrojowego stanu zapalnego, podczas gdy sepsa i wstrząs septyczny mogą wystąpić przy wyższych stężeniach endotoksyn4,5.
Sepsa jest stanem zagrażającym życiu, który, jeśli nie zostanie szybko rozpoznany, może prowadzić do niewydolności wielonarządowej i śmierci. Pacjenci z sepsą muszą być leczeni w odpowiednim czasie, z agresywną resuscytacją, odpowiednią antybiotykoterapią, optymalną kontrolą źródła i szybkimi strategiami wsparcia narządów. Rozpoznanie etiologii sepsy opiera się przede wszystkim na rozpoznaniu klinicznym i wykrywaniu patogenów na podstawie hodowli6. Jednak wyniki hodowli drobnoustrojów mogą trwać do 48 godzin i są niejednoznaczne nawet w 30% przypadków7. Wczesna identyfikacja i interwencja mogą prowadzić do lepszych wyników leczenia pacjentów. U pacjentów, u których podejrzewa się sepsę, decyzje często podejmowane są na podstawie parametrów fizjologicznych i biochemicznych, bez wyraźnych objawów endotoksemii.
Pomiar aktywności endotoksyn (EA) można uzyskać za pomocą komercyjnego testu (zobacz Tabelę Materiałów) w pełnej krwi. Może być stosowany jako biomarker endotoksemii układowej do wczesnej stratyfikacji ciężkości choroby, szczególnie u pacjentów zagrożonych wystąpieniem wstrząsu septycznego8. Test został wykorzystany do kierowania terapią hemoperfuzji polimyksyny B w niedawno opublikowanym randomizowanym, kontrolowanym badaniu klinicznym z podwójnie ślepą próbą u pacjentów ze wstrząsem septycznym9. U pacjentów w stanie krytycznym badanie MEDIC wykazało, że podwyższony poziom EA jest związany z dysfunkcją wielu narządów, długością pobytu na oddziale intensywnej terapii (OIOM) i śmiertelnością10.
Opracowano różne testy do wykrywania endotoksyn. Test lizatu amebocytów limulusa (LAL), zarówno jako test żelowo-skrzepowy, mętnościowy, jak i chromogenny, był do tej pory najczęściej stosowany do oceny endotoksyny w surowicy. Opiera się na zdolności endotoksyny do indukowania koagulacji hemolimfy kraba podkowiastego, Limulus polyphemus. Jednak ten test ma pewne ograniczenia pod względem specyficzności. W szczególności może być również aktywowany przez produkty mikrobiologiczne inne niż endotoksyna, takie jak składniki ściany komórkowej grzyba, i może być hamowany przez różne białka ludzkiego osocza11.
W ciągu ostatniej dekady pomiar EA został opracowany i zatwierdzony jako biomarker krążącej endotoksemii. W porównaniu z testem LAL, EA jest szybszy i łatwiejszy do wdrożenia w warunkach klinicznych. Co więcej, wykazano, że jest dokładniejszy niż LAL w krwi pełnej, ze zwiększoną czułością i swoistością, zarówno in vitro, jak i in vivo12.
Pomimo początkowej implementacji jako wczesnego narzędzia diagnostycznego do szybkiej identyfikacji bakterii GN jako czynników wywołujących sepsę, poziom EA był również badany jako biomarker ciężkości choroby. W tym kontekście wykazano, że jest to szczególnie przydatne do oceny stanu hipoperfuzji z powodu trwającej choroby krytycznej, takiej jak wstrząs septyczny lub zespół po zatrzymaniu krążenia13. Niedawno, od czasu opracowania systemów hemooczyszczania, zaproponowano również pozytywny wynik EA jako narzędzie przesiewowe w celu dokładnej identyfikacji potencjalnych kandydatów do takiej terapii14. Niedawno przeprowadziliśmy obserwacyjne badanie retrospektywne dotyczące częstości występowania i znaczenia klinicznego wczesnych wysokich poziomów EA u 107 pacjentów ze wstrząsem septycznym. Zgodnie z innymi ostatnimi wynikami stwierdziliśmy, że EA jest obiecującym markerem ciężkości choroby u pacjentów ze wstrząsem septycznym15.
Celem niniejszego manuskryptu jest opisanie metody przeprowadzania testu EA, zarówno przy łóżku pacjenta, jak i w laboratorium, oraz opisanie jej potencjalnego zastosowania w reprezentatywnym scenariuszu wstrząsu septycznego. Technika ta może wykrywać aktywność LPS poprzez pomiar wzmocnionego wybuchu oksydacyjnego w neutrofilach po ich pobudzeniu przez kompleksy przeciwciała anty-endotoksynowego i LPS. Zwiększony impuls oddechowy jest wykrywany przez chemiluminometr, a ilość emitowanego światła jest uważana za proporcjonalną do ilości endotoksyny w próbce krwi. Test wymaga kilku odczynników, trwa około 30 minut i wykorzystuje zaledwie 40 μl krwi pełnej12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół jest przeprowadzany zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi postępowania z ludzkimi próbkami biologicznymi i zgodnie z aktualnymi standardowymi procedurami operacyjnymi naszego laboratorium klinicznego. Wykorzystanie danych EA i informacji klinicznych badanych pacjentów jest zgodne z wytycznymi komisji etycznej ds. badań klinicznych na ludziach w naszej instytucji.
1. Zawartość sprzętu laboratoryjnego i zestawu do testów
- Przechowuj zestaw EA w temperaturze 2–8 °C, gdy nie jest używany.
- Każdy test EA składa się z 5 różnych rodzajów probówek; użyj każdej z nich do innej części testu (patrz sekcja 2).
- Użyj probówki #1 (probówka "kontrolna") do pomiaru podstawowej aktywności niespecyficznego wybuchu oksydacyjnego neutrofili pacjenta przy braku swoistego przeciwciała.
- Użyj probówki #2 (probówka "Próbka") do pomiaru wybuchu oksydacyjnego w odpowiedzi na kompleks LPS-przeciwciało.
- Użyj probówki #3 (rurka "Max") do zmierzenia maksymalnego wybuchu oksydacyjnego neutrofili pacjenta w odpowiedzi na nadmiar endotoksyny.
- Użyj rurki #4 (rurki "LPS") jako źródła egzogennej endotoksyny.
- Użyj probówki #5 (tubka "Podwielokrotna") do przechowywania krwi.
nuta: Duplikaty probówek #1, #2 i #3 są dostarczane dla łącznie 8 probówek, które należy użyć do każdej badanej próbki krwi (butelka z odczynnikiem EA i test kontroli jakości mogą być używane do wszystkich testów zawartych w woreczku).
- Próbki krwi pacjenta należy pobrać w sterylnych probówkach zawierających antykoagulant EDTA. Przechowuj próbki krwi w temperaturze pokojowej przed uruchomieniem testu EA.
- Przed rozpoczęciem badania włącz chemiluminometr i wytrząsarkę inkubatora. Ogrzać inkubator do temperatury 37 °C.
- Najlepiej rozpocząć przetwarzanie próbki w ciągu 30 minut od pobrania krwi.
2. Test aktywności endotoksyn
- Przygotuj probówki EA dla każdej próbki krwi pacjenta, którą chcesz przebadać. Umieść probówki w stojakach na tuby. Następnie zdejmij nakrętki.
- Za pomocą pipety dwufunkcyjnej odpipetuj 1 ml objętości odczynnika EA z butelki do probówek #1 (probówka kontrolna), #2 (probówka na próbkę) i #3 (probówka Max), każda w dwóch egzemplarzach.
nuta: Odpipetować bok probówki, aby uniknąć ponownego rozpryskiwania się roztworu. - Wymieszaj próbkę krwi pacjenta, delikatnie odwracając probówkę do pobierania krwi 20 razy. Następnie odpipetować 0,5 ml krwi pacjenta do probówki #4 (probówka LPS max) i probówki #5 (probówka z podwielokrotnością). Rurka wirowa #4 przez 10 s.
- Umieść stojaki na probówki ze wszystkimi probówkami EA w wytrząsarce inkubatora. Zamknąć pokrywkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37°C.
- Otwórz pokrywę i wyjmij stojaki na probówki z wytrząsarki inkubatora. Rurka wirowa #5 (rurka podwielokrotna). Za pomocą sterylnej końcówki odpipetować 40 μl krwi do probówek #1 i #2, po kolei.
- Rurka wirowa #4 (rura LPS). Używając tej samej końcówki do pipety, odpipetuj 40 μl krwi z probówki #4 do probówki #3 (probówka Max), w dwóch egzemplarzach.
- Wiruj sześć końcowych probówek (#1, #2, #3 i odpowiednie duplikaty), a następnie umieść je z powrotem w stojakach.
nuta: Upewnij się, że wszystkie rurki są wirowane przez ten sam czas. - Włóż stojaki na probówki z powrotem do wytrząsarki inkubacyjnej i zamknij pokrywę. Ustaw wytrząsarkę inkubacyjną na 100 obr./min, a następnie rozpocznij ruch na 14 minut.
- Włóż kartę chipową z oznaczeniem EA do chemiluminometru i naciśnij start. Po 14 minutowej inkubacji postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na chemiluminometrze, aby odczytać probówki EA we właściwej kolejności.
- Delikatnie wirować każdą probówkę przez 10 s przed umieszczeniem jej na uchwycie próbki chemiluminometru. Otwórz szufladę na próbkę i umieść rurkę #1 w uchwycie na próbkę. Następnie zamknij szufladę na próbki i poczekaj na odczyt względnej jednostki światła (RLU).
- Powtórz krok 2.10 dla rurki 2 i rurki 3.
- Powtórz krok 2.10 dla zduplikowanych rur 1, 2 i 3.
nuta: Spróbuj wirować wszystkie rurki przez ten sam czas w krokach 2.10–2.12. - Po przetworzeniu wszystkich probówek należy pamiętać, że wyniki EA zostaną obliczone i wydrukowane automatycznie. Poziomy są wyrażone w jednostkach EA i reprezentują średnią z podwójnych oznaczeń z tych samych próbek.
- Powtórz kroki od 2.2 do 2.13 dla każdej próbki krwi, która musi zostać zbadana.
- Po zakończeniu testu należy przechowywać pozostałe probówki i odczynniki EA w temperaturze 2–8 °C przez okres do 30 dni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
72-letni mężczyzna został przyjęty na Szpitalny Oddział Ratunkowy (SOR) akademickiego szpitala miejskiego. Kilka dni wcześniej zgłosił się do lekarza pierwszego kontaktu z dolegliwościami w postaci pieczenia podczas oddawania moczu. Zalecono krótką terapię doustną fosfomycyną. W wywiadzie medycznym pacjenta znajdowały się nadciśnienie tętnicze, niepowikłana cukrzyca typu 2 oraz łagodny przerost prostaty. Przyjmowane leki obejmowały enalaprylową, atorwastatynę, tamsulosynę i metforminę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wstrząs septyczny nadal wiąże się ze śmiertelnością sięgającą 40%, chociaż wskaźnik ten różni się w zależności od rozważanych doniesień16. Większość ekspertów w tej dziedzinie opowiada się za potrzebą nowatorskich i lepszych biomarkerów, aby pomóc klinicystom we wczesnej diagnozie, lepszym leczeniu i prognozowaniu pacjentów ze wstrząsem septycznym6.
Wykonanie testu EA nie wymaga wcześniejszej wiedzy technicznej ani zaawansowanego sprzętu laborato...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Estor S.p.A. pokryła koszty publikacji czasopisma i opłaty za produkcję wideo. Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Paolo Braganò i Lisie Mathiasen, Ph.D. za ich przegląd metodologii protokołu testu. Dr Dario Winterton udzielił znaczącej pomocy w recenzowaniu manuskryptu pod kątem znajomości języka angielskiego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw EAA | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Pakiet z 20 testami + 1 kontrola jakości |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometr |
| Wytrząsarka inkubatora | GRANT | ES-20 | Mini-inkubator Wytrząsarka |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Przyrząd wirowy |
Bibliografia
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
- Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).
- Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
- Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).
- Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).
- Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).
- Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).
- Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).
- Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).
- Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218(2014).
- Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
- Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).
- Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).
- Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).
- Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).
- Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10 (7), (2015).
- Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology? Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).
- Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).
- Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).
- Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42 (3), 521-528 (2014).
- Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28 (5), 524-529 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
