Tutaj prezentujemy protokół oceny integralności bariery krew-jądro poprzez wstrzykiwanie inuliny-FITC do jąder. Jest to skuteczna metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro, która może być zagrożona przez elementy genetyczne i środowiskowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Spermatogeneza to rozwój spermatogonii w dojrzałe plemniki w kanalikach nasiennych jądra. Proces ten jest wspierany przez połączenia komórek Sertoliego na barierze krew-jądro (BTB), która jest najściślejszą barierą tkankową w ciele ssaków i segreguje nabłonek nasienny na dwa przedziały, podstawowy i przybiegunowy. BTB tworzy unikalne mikrośrodowisko dla komórek rozrodczych w mejozie I/II oraz dla rozwoju plemników postmejotycznych w plemniki poprzez spermiogenezę. Tutaj opisujemy wiarygodny test do monitorowania integralności BTB jąder myszy in vivo. Nienaruszony BTB blokuje dyfuzję inuliny sprzężonej z FITC z przedziału podstawnego do wierzchołkowego kanalików nasiennych. Technika ta jest odpowiednia do badania kandydatów na geny, wirusów lub toksyn środowiskowych, które mogą wpływać na funkcję lub integralność BTB, przy łatwej procedurze i minimalnym wymaganiu umiejętności chirurgicznych w porównaniu z metodami alternatywnymi.
Wprowadzenie
Spermatogeneza ssaków jest uważana za wysoce ustrukturyzowany proces, który obejmuje samoodnowę i różnicowanie się spermatogoniów przez spermatocyty do haploidalnych plemników poprzez mitozę, mejozę i spermiogenezę, podczas których zachodzą dramatyczne zmiany biochemiczne i morfologiczne. Rozwijające się komórki rozrodcze są stopniowo transportowane od podstawy kanalika nasiennego w kierunku światła. Proces ten jest regulowany przez kontakty komórka-komórka między komórkami rozrodczymi a komórkami Sertoliego1,2. Sąsiednie komórki Sertoliego tworzą BTB, który znajduje się w pobliżu podstawy kanalika nasiennego. BTB fizycznie dzieli nabłonek na przedział podstawowy i adluminalny. Podczas etapów VIII - IX cyklu nabłonkowego spermatocyty preleptotenu/leptotenu z przedziałów podstawnych migrują przez BTB, wchodząc do przedziałów adluminalnych3. Dlatego funkcją BTB jest zapewnienie immunouprzywilejowanego mikrośrodowiska do zakończenia mejozy i spermiogenezy4,5,6. W przeciwieństwie do innych barier krew-tkanka (np. bariera krew-mózg), które składają się tylko ze ścisłych połączeń (TJ), BTB jest utworzona przez cztery różne połączenia (TJ, specjalizacje ektoplazmatyczne, połączenia szczelinowe i pośrednie desmosomy oparte na włóknach) między komórkami Sertoliego1,7.
Wiele badań wykorzystywało genetycznie modyfikowane myszy, infekcje wirusowe i toksyny środowiskowe do zbadania mechanizmów integralności BTB7,8,9. Zaburzenie BTB indukuje upośledzoną spermatogenezę i niepłodność lub niepłodność. Ponieważ potwierdzono, że na powstawanie i integralność BTB mają wpływ kontakty między komórkami Sertoliego8, do badania BTB zastosowano model in vitro oparty na pierwotnej hodowli izolowanych komórek Sertoliego. Jednak model ten nie może dokładnie naśladować dynamiki BTB in vivo. Co więcej, nie ustalono, że taka kohodowla komórek rozrodczych z komórkami Sertoliego jest w stanie odzwierciedlić wszystkie istotne składniki strukturalne i funkcjonalne BTB10,11.
Ogólnie, testy integralności BTB in vivo są zazwyczaj oparte na małych cząsteczkach, takich jak EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna i inulina sprzężona z FITC (inulina-FITC). Zwykle dyfuzja biotyny lub inuliny-FITC z przedziału podstawowego jest blokowana przez strukturę BTB. Dlatego jesteśmy w stanie wykorzystać tę metodę do oceny stopnia uszkodzenia BTB w porównaniu z grupami kontrolnymi. Podczas gdy BTB może być zagrożony przez niektóre rodzaje bodźców, takie jak leczenie chlorkiem kadmu (CdCl2)12, BTB staje się dostępny dla małych cząsteczek, które ostatecznie dostają się do przedziału świetlnego jako wskaźniki.
Wczesny test integralności BTB in vivo polega na wstrzyknięciu biotyny lub inuliny-FITC do żyły szyjnej, co wiąże się z operacją i jest inwazyjne, skomplikowane i czasochłonne. Poza tym, ponieważ substancje reporterowe dyfundują przez całe ciało przez krążenie, miejscowe stężenie biotyny lub inuliny-FITC w kanalikach nasiennych jest ograniczone. Ponadto narażenie ogólnoustrojowe może wywoływać reakcje immunologiczne. W tym miejscu przedstawiamy prosty i skuteczny test integralności BTB in vivo umożliwiający bezpośrednie wstrzyknięcie małej porcji inuliny-FITC do śródmiąższu jądra. Dzięki metodzie znakowania fluorescencyjnego proces barwienia jest wygodny, ponieważ przeciwciała wtórne nie są wymagane. Tutaj wizualizuje się proces wnikania barwnika fluorescencyjnego do jądra.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet Uniwersytetu Medycznego w Nankinie. Samce myszy C57BL/6 trzymano w kontrolowanych warunkach fotoperiodycznych i zaopatrywano je w pokarm i wodę.
1. Przygotowania
- Kapilary mikroiniekcyjne
- Stosować kapilary do mikroiniekcji o średnicy zewnętrznej, średnicy wewnętrznej i długości odpowiednio 1,0 mm, 0,8 mm i 10,0 cm.
- Pociągnij szklane kapilary za pomocą ściągacza kapilarnego (Rysunek 1A). Przetestuj i dostosuj ustawienia w zależności od używanej ściągacza kapilary.
- Połamać końcówki pipet kleszczami, aby uzyskać kapilary o średnicy 50 μm na końcówce.
Uwaga: Końcówki mogą być zbyt długie, aby przeniknąć do jądra. - Naostrz końcówkę pod kątem 30° za pomocą ukosowarki do mikropipet (Rysunek 1C).
- Odczynniki
- Przygotować 1% pentobarbital sodu: rozpuścić pentobarbital sodu 100 mg w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (krok 2.3.3).
- Przygotować 10 mg/ml inuliny-FITC: rozpuścić inulinę-FITC 1 mg w 100 μl PBS (krok 2.1.6).
- Przygotować 4% paraformaldehydu: rozpuścić paraformaldehyd (PFA) 4 g w 100 ml PBS (krok 2.3.3).
- Przygotować 30% sacharozy: rozpuścić sacharozę 3 g w 10 ml PBS (krok 2.3.4).
- Przygotować 0,1% chlorek kadmu: rozpuścić chlorek kadmu 10 mg w 10 ml PBS (etap 2.1.1).
2. Metody
- Anestezjologia i przygotowanie przedoperacyjne
- Zważyć 8-tygodniowe samce myszy C57BL/6 i obliczyć wymaganą dawkę CdCl2. Leczyć grupę myszy (n = 3) CdCl2 (5 mg/kg m.c., i.p.) przez 3 dni przed operacją. Potraktuj inną grupę 8-tygodniowych samców myszy C57BL / 6 (n = 3) z PBS jako kontrolą.
- Wykonuj operację w warunkach aseptycznych przy użyciu sterylnej strzykawki, igły, nożyczek i kleszczy.
- Przygotuj świeżo roztwór roboczy do znieczulenia. Wymagana dawka znieczulenia to 70 mg pentobarbitalu sodu/kg masy ciała. Średnio dorosła mysz C57BL/6 w wieku 8 tygodni waży ~25 g, co odpowiada 175 μl 1% pentobarbitalu sodu (1,75 mg na mysz).
UWAGA: Sól sodowa pentobarbitalu rozpuszcza się w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Roztwór jest filtrowany przez jednostkę filtrującą 0,22 um przed użyciem. - Oczyść obszar do zabiegu 75% etanolem i przykryj obszar czystym ręcznikiem tkankowym.
- Włącz grzałkę termostatyczną i ustaw temperaturę na 37 °C.
- Przygotować roztwór roboczy inulina-FITC (10 mg/ml) w dniu zabiegu.
- Zabiegu chirurgicznego
- Zważ 8-tygodniowe samce myszy C57BL/6 i oblicz wymaganą dawkę znieczulenia.
- Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml. Trzymaj mysz w czystej klatce.
- Obserwuj reakcję odruchową oka i wzorzec oddychania myszy, aby upewnić się, że jest ona w pełnym znieczuleniu.
UWAGA: Zwykle potrzeba 10 - 15 minut, aż mysz zostanie głęboko znieczulona, przy całkowitym braku reakcji na szczypanie palców u nóg i utrzymaniu powolnego, równomiernego oddechu. - Przesuń mysz do obszaru operacyjnego i przykryj okolice oczu wilgotną bibułą, aby uniknąć wysuszenia podczas znieczulenia (Rysunek 2A).
- Ogol włosy na brzuchu golarką i zdezynfekuj obszar operacji 75% etanolem.
- Ostrymi nożyczkami wykonaj 1-centymetrowe nacięcie skóry nad gruczołami napletkowymi, aby odsłonić ścianę brzucha. Podnieś ścianę brzucha za pomocą małych kleszczy i wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie, aby odsłonić jamę otrzewnej (Rysunek 2B).
- Użyj kleszczy, aby poszukać poduszek tłuszczowych wokół najądrza i jądra. Ostrożnie wyciągnij poduszeczki tłuszczowe, aby wyraźnie odsłonić przyczepione jądro ( Rysunek 2C i 2D). Zazwyczaj operuj na jednym jądrze na raz.
UWAGA: Unikaj dotykania poduszek tłuszczowych i jąder rękami. - Umieść papier (o średnicy 9 cm) pod poduszeczkami tłuszczowymi i jądrem (Rysunek 2C).
- Wstrzyknąć inulinę-FITC do pipety do mikroiniekcji i podłączyć ją do jednostki mikromanipulatora (Rysunek 1D). Delikatnie włożyć pipetę do mikroiniekcji pod osłonkę białawą i załadować łącznie 20 μl inuliny-FITC do śródmiąższu jądra (Rysunek 2E i 2F).
UWAGA: Ostrożnie wciśnij pipetę do mikroiniekcji, aby jej nie przesuwać. - Monitoruj ruch inuliny-FITC w jądrze (Rysunek 2G).
- Po zakończeniu wstrzyknięcia należy natychmiast umieścić jądro z powrotem w jamie brzusznej.
- Powtórz procedurę na przeciwległym jądrze. Do tego jądra wstrzykuje się 20 μl PBS jako kontrolę.
- Zamknij skórę szwem chirurgicznym i przesuń mysz do poduszki grzewczej grzejnika termostatycznego (Rysunek 1B). Podawać dawkę 1 mg leku przeciwbólowego (buprenorfiny) na 1 kg masy ciała we wstrzyknięciu podskórnym.
- Zbiór jąder i przygotowanie zamrożonych części
- 40 minut po wstrzyknięciu należy poddać eutanazji mysz biorcy przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi pielęgnacji i stosowania zwierząt.
- Użyj ostrych nożyczek, aby zebrać jądra. Umieść jądra w 1 ml lodowatego PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia krwi.
- Utrwalić jądra w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C przez 12 - 24 godziny. Wyrzuć 4% PFA i umyj tkankę 3x 1,5 ml 1% PBS w temperaturze pokojowej.
- Odwodnić tkankę w 30% sacharozy przez noc. Umieść jądro w ramce do osadzania i przykryj tkankę związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Po zamrożeniu OCT wypełnij ramkę osadzającą OCT, aby całe jądro mogło być pokryte OCT.
- Wytnij zamrożone przekroje jąder o grubości 5 μm w kriostacie w temperaturze -20 °C i pozwól im przylegać do szkiełek mikroskopowych.
UWAGA: Ponowne zamrożenie tkanek osadzonych w suchym lodzie może zwiększyć sztywność cięcia.
- Zapotrzebowanie na obrazy
- Umieść szkiełka w nawilżonym pudełku. Podgrzewaj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 min.
- Przemyj sekcje 3x solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) w temperaturze pokojowej.
- Suszyć na powietrzu przez 5 minut w ciemności. Zetrzyj wszelkie resztki TBS papierem bezpyłowym.
- Pokryj przekroje 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Umieść odwrócone szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym.
- Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Całkowite 20-krotne powiększenie jest na ogół wystarczające do wykrycia jasno fluorescencyjnego sygnału.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Układ doświadczalny do przeprowadzenia testu szczelności BTB przedstawiono na Ryc. 1. Wyciągnij i zaostrz kapilary do mikroiniekcji, odpowiednio za pomocą wyciągacza kapilar oraz urządzenia do skosowania mikropipet (Ryc. 1A i 1C). Grzałka termostatyczna oraz sprzęt do mikroiniekcji zilustrowano na Ryc. 1B i 1D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Spermatogeneza zachodzi w nabłonku nasiennym i jest wysoce uporządkowanym i dynamicznym procesem, którym zarządzają komórki rozrodcze i komórki somatyczne (np. komórki Sertoliego)13. Struktura BTB, która jest budowana przez komórki Sertoliego, dzieli nabłonek nasienny na przedział podstawowy i wierzchołkowy. Rozwój mejotycznych i haploidalnych komórek rozrodczych zachodzi w przedziale wierzchołkowym, który tworzy barierę immunologiczną14.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFA0500902), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31471228, 31771653), Fundację Naukową Jiangsu dla Wybitnych Młodych Uczonych (BK20150047), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) oraz Program Innowacyjny i Przedsiębiorczy Prowincji Jiangsu dla K.Z.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ściągacz kapilarny | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclon (USA) | SH30258,01 | rozcieńczenie do 1&razy; w ddH2O |
| 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Szkiełka mikroskopowe adhezyjne | CITOGLAS (Chiny) | 80312-3161 | |
| Chlorek kadmu | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Mikroskop konfokalny | Zeiss (Niemcy) | LSM700 | |
| Papier bezpyłowy | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulina-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Kapilary mikroiniekcyjne | Zhengtianyi (Chiny) | BJ-40 | 1,0 mm & razy; 0,8 mm × 100 mm |
| Ukosowarka do mikropipet | NARISHIGE (JAPONIA) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPONIA) | 4583 | |
| Paraformaldehyd | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodowy | Merck (Niemcy) | Golarka P11011 | |
| Yashen (Chiny) | |||
| Mikroskop stereoskopowy | Nikon (JAPONIA) | SMZ1000 | |
| Sacharoza | Sangon Biotech (Chiny) | A610498 | |
| Narzędzia chirurgiczne | Mocniejsze (Chiny) | nożyczki, kleszcze, uchwyt na igłę | |
| Strzykawka | KDL (Chiny) | 20163150518 | 0,45 mm i razy 0,16 mm RW LB |
| Grzejnik termostatyczny | KELL (Nanjing, Chiny) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7,6 | |||
| 0,2 mln Tris | Sangon Biotech (Chiny) | A600194 | |
| 1,37 mln Nacl | Sangon Biotech (Chiny) | A610476 |
Bibliografia
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
