Artykuł metodologiczny

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

DOI:

10.3791/58521

⸱

5 października 2018

 , 
1Center for Bioscience Research and Education, Utsunomiya University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek, są opisane dla mrówki Vollenhovia emeryi. Protokoły te są ważne dla eksperymentów mających na celu zrozumienie genetycznych podstaw systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetyczne i molekularne składniki kaskady determinacji płci zostały dokładnie zbadane u pszczoły miodnej, Apis mellifera, organizmu modelowego błonkoskrzydłego. Niewiele jednak wiadomo na temat mechanizmów determinacji płci występujących u innych niemodelowych taksonów błonkoskrzydłych, takich jak mrówki. Ze względu na złożony charakter cykli życiowych, które wyewoluowały u gatunków błonkoskrzydłych, trudno jest utrzymać i przeprowadzić eksperymentalne krzyżówki między tymi organizmami w laboratorium. W tym miejscu opisano metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek u mrówek Vollenhovia emeryi. Indukowanie chowu wsobnego w laboratorium przy użyciu V. emeryi jest stosunkowo proste ze względu na unikalną biologię gatunku. W szczególności gatunek ten wytwarza androgenetyczne samce, a samice rozrodcze wykazują polimorfizm skrzydeł, co upraszcza identyfikację fenotypów w krzyżówkach genetycznych. Ponadto ocena sukcesu chowu wsobnego jest prosta, ponieważ samce mogą być produkowane w sposób ciągły przez krzyżówki wsobne, podczas gdy normalne samce pojawiają się tylko podczas dobrze zdefiniowanego sezonu reprodukcyjnego na polu. Nasz protokół pozwala na wykorzystanie V. emeryi jako modelu do badania genetycznych i molekularnych podstaw systemu determinacji płci u gatunków mrówek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eusocjalne taksony błonkoskrzydłych, takie jak mrówki i pszczoły, rozwinęły haplodiploidalny system determinacji płci, w którym osobniki heterozygotyczne w jednym lub więcej uzupełniających loci determinacji płci (CSD) stają się samicami, podczas gdy te, które są homo- lub hemizygotyczne, stają się samcami (Rysunek 1A)1.

Genetyczne i molekularne komponenty biorące udział w kaskadzie determinacji płci zostały dobrze zbadane u pszczoły miodnej, Apis mellifera, organizmu modelowego błonkoskrzydłego2,3,4. Ostatnie badania genomiki porównawczej sugerują, że mrówki i pszczoły miodne mają wiele domniemanych homologów w szlaku determinacji płci, takich jak początkowy gen determinacji płci, csd5. Jednak nadal brakuje dowodów na funkcjonalną konserwację tych homologów w przypadku mrówek.

Aby rozwiązać ten problem, należy rozwinąć linie chowu wsobnego, ponieważ są one niezbędne do mapowania genetycznego i badań molekularnych. Jednak utrzymanie i przeprowadzenie eksperymentalnych krzyżówek między tymi organizmami w laboratorium jest trudne ze względu na złożony charakter cykli życiowych, które wyewoluowały.

Tutaj używamy Vollenhovia emeryi jako modelu do zbadania genetycznych i molekularnych podstaw systemu determinacji płci u mrówek6,7. Linie wsobne tego gatunku zostały opracowane wcześniej w celu mapowania sprzężeń loci cech ilościowych (QTL) dla cech związanych z determinacją płci po raz pierwszy w ants6. Ponadto zbadano molekularną kaskadę determinacji płci7. Gatunek ten wyewoluował niezwykły system rozmnażania, który wykorzystuje zarówno gynogenezę, jak i androgenezę (Ryc. 1B)8,9. Większość nowych królowych i samców jest wytwarzana klonalnie odpowiednio z genomu matki i ojca. Ponadto robotnice i niektóre królowe są produkowane seksualnie8. Ten system rozrodu szczególnie dobrze nadaje się do badań genetycznych, ponieważ krzyżówki wsobne wyprodukowane przy użyciu wyhodowanych płciowo królowych i samców są genetycznie równoważne klasycznemu krzyżowaniu wstecznemu. Ponieważ królowe produkowane płciowo różnią się morfologicznie od królowych wytworzonych z genomów matczynych10 (Rysunek 1B), przeprowadzanie i ocena krzyżówek wsobnych jest znacznie uproszczone przy użyciu tej metody.

W tym artykule opisano metody zakładania kolonii laboratoryjnych do testów krzyżowych, stosowania krzyżówek wsobnych przy użyciu par full-sib oraz oceny sukcesu tych krzyżówek za pomocą genotypowania członków kolonii i sekcji genitaliów męskiego potomstwa.

Niezależnie od zastosowanego systemu reprodukcji, zastosowanie krzyżówek inbredialnych jest często niezbędnym pierwszym krokiem w każdym badaniu systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych. Na przykład u Cardiocondyla obscurior, prawie całkowity brak diploidalnych samców po 10 pokoleniach pełnego krycia w laboratorium dowodzi braku locus11. Możliwe jest przewidzenie liczby loci CSD na podstawie stosunku samców wyprodukowanych w krzyżówkach chowu wsobnego6,12,13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Terenowe zbieranie i utrzymywanie kolonii V. emeryi w laboratorium

UWAGA: Gniazda V. emeryi znajdują się w gnijących kłodach i powalonych, rozkładających się gałęziach drzew w lasach wtórnych w całej Japonii. Gatunek ten wykazuje dwa typy kolonii, tj. (1) kolonie produkujące tylko długoskrzydłe królowe i (2) kolonie produkujące głównie krótkoskrzydłe królowe oprócz niewielkiej liczby długoskrzydłych królowych8,14. W tym protokole zebraliśmy ten drugi typ kolonii w prefekturze Ishikawa w Japonii.

  1. Zbieraj kolonie V. emeryi wczesnym latem.
    UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą liczbę osobników płciowych w sezonie rozrodczym, preferowane są kolonie zawierające więcej niż 300 osobników.
  2. Przenieś okazy mrówek z zebranych gałęzi do sztucznego gipsowego gniazda ze szklaną pokrywą za pomocą aspiratora (Rysunek 2, po lewej).
  3. Utrzymuj kolonie w sztucznym gnieździe w temperaturze 25 °C w cyklu 16:8 godzin światło/ciemność. Zapewnij wodę z kranu z butelką do mycia, aby zwilżyć tynk.
    1. Dodawaj około 100 mg suchego proszku ze świerszczy zawiniętego w folię aluminiową i końcówkę wypełnioną wodą z brązowego cukru (końcówka 20 μl) co drugi dzień, aż pojawią się nowe zwierzęta rozrodcze (skrzydlate królowe F1 i samce F1).

2. Eksperymentalne Krzyże Laboratoryjne

UWAGA: Nowe czynniki rozrodcze zaczynają się pojawiać od późnego lata do jesieni (Rysunek 3). Długoskrzydłe królowe są produkowane płciowo, a krótkoskrzydłe królowe są produkowane klonalnie i mają genom matczyny (Ryc. 1). Używaj długoskrzydłych królowych i samców do krzyżówek wsobnych.

  1. Aby powstrzymać osobniki przed poruszaniem się, należy umieścić kolonie w pomieszczeniu o stałej temperaturze 4 °C na 15 minut.
  2. Usuń środkowe nogi 30 robotnic za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś je do nowego mniejszego gipsowego gniazda (Rysunek 2, po prawej) dla krzyżówek wsobnych.
    UWAGA: Nogi są usuwane, aby odróżnić obecne robotnice od robotnic, które zostaną wyprodukowane przez kolejne krzyżówki wsobne.
  3. Dodaj 3-4 larwy lub poczwarki do gipsowego gniazda zawierającego robotnice.
    UWAGA: Robotnice wykazują aktywność eksploracyjną w kolonii bez matek F0. Larwy lub poczwarki mogą skutecznie przyciągać te robotnice i nowe zwierzęta rozrodcze w środku kolonii podczas testu krzyżowego. W rezultacie utrzymuj warunki kolonii doświadczalnej zbliżone do normalnej kolonii.
  4. Przenieś długoskrzydłą królową i samca do gipsowego gniazda przygotowanego w kroku 2.3 do krzyżówek wsobnych.
  5. Utrzymywać kolonie w temperaturze 25 °C w cyklu 16:8 godzin światło/ciemność, z pokarmem i wodą dostarczanymi zgodnie z opisem w ppkt 1.3, aż królowa straci skrzydła i złoży jaja.
    UWAGA: Trwa to od tygodnia do miesiąca.
  6. Codziennie sprawdzaj eksperymentalną kolonię pod mikroskopem stereoskopowym. Po wykonaniu krzyżówek wsobnych między potomstwem F1 jaja można obserwować pod mikroskopem stereoskopowym.
  7. Po tym, jak królowa F1 zacznie składać jaja, należy usunąć z gniazda samce F1 oraz larwy lub poczwarki dodane w kroku 2.3, aby uniknąć mieszania się pokolenia F1 (samce i samice wykorzystywane do krzyżówek wsobnych) i pokolenia F2 (potomstwo powstałe z krzyżówek wsobnych).
    UWAGA: Jeśli w rodzinie jest kilka samców, możliwe jest wywołanie krzyżówek wsobnych przy użyciu jednego samca i 1 do 3 królowych w tej samej kolonii doświadczalnej.
  8. Utrzymuj kolonie w tych samych warunkach, jak opisano w 1.3, aż pojawi się potomstwo F2.
    UWAGA: Przenieś królową F1 i potomstwo F2 do nowego, większego gipsowego gniazda (Rysunek 2, po lewej) w celu długoterminowego utrzymania kolonii.

3. Ocena sukcesu chowu wsobnego

  1. Ekstrakcja DNA i genotypowanie pokolenia rodzicielskiego (F0)
    1. Usunąć jedną nogę królowej F0 za pomocą kleszczy i przenieść nogę do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl środka chelatującego.
    2. Pod mikroskopem stereoskopowym wypreparuj brzuch samicy w szklanym naczyniu wypełnionym 300 μl ultraczystej wody za pomocą kleszczy i wyizoluj spermatekę zawierającą plemniki od pokrytych samców.
    3. Oderwij tkankę spermateki i odizoluj plemniki od tkanki samicy za pomocą szpilek do owadów.
      UWAGA: Aby ułatwić ekstrakcję plemników z spermateki, przechowuj próbki żeńskie w 100% EtOH przez więcej niż jeden dzień przed sekcją.
    4. Za pomocą mikropipety przenieś plemniki do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl środka chelatującego.
    5. Inkubować próbki matki F0 i plemników przygotowanych odpowiednio w kroku 3.1.1 i 3.1.3 w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Odwirować błyskawicznie mikroprobówkę i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Genotyp wszystkich próbek przy użyciu metody opisanej gdzie indziej4.
  2. Ekstrakcja DNA od pary mrówek wykorzystywanych do krzyżówek wsobnych (F1)
    1. Po potwierdzeniu, że królowa F1 wyprodukowała jaja, należy pobrać DNA królowej za pomocą jej zrzuconych skrzydeł lub jednego środkowego odcinka nogi i genotypu, stosując tę samą metodę opisaną w sekcji 3.1 powyżej.
    2. Pobrać DNA samca F1 za pomocą jednej nogi i genotypować je tą samą metodą, co w sekcji 3.1 powyżej.
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w 100% EtOH przed ekstrakcją DNA, a DNA w środku chelatującym można przechowywać przez dwa miesiące w temperaturze 4 °C.
  3. Ocena płodności samców pochodzących z krzyżówek wsobnych
    UWAGA: Diploidalne samce powstałe z krzyżówek wsobnych są często bezpłodne.
    1. Wypreparować wewnętrzne narządy rozrodcze w szklanym naczyniu z 400 μl roztworu PBS za pomocą kleszczy.
    2. Usuń PBS i dodaj 4% paraformaldehydu (PFA) za pomocą mikropipety.
    3. Utrwalić tkankę przez inkubację w PFA przez 30 minut w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
    4. Umyj chusteczkę 5 razy 400 μl PBS za pomocą mikropipety.
    5. Rozcieńczyć roztwór 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) do 1 μg/ml w PBS.
    6. Usunąć PBS i dodać około 300 μl tego rozcieńczonego roztworu barwiącego DAPI do tkanki.
    7. Inkubować przez 15 minut w ciemnych warunkach, w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
    8. Umyj tkankę 5 razy 400 μl PBS i przenieś tkankę na środek szkła szkiełkowego za pomocą kleszczy.
    9. Zamontuj tkankę na podłożu montażowym zawierającym falloidynę sprzężoną z tetrametylodaminą (TRITC).
    10. Obserwuj próbki za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego przy użyciu soczewek obiektywowych 20X lub 63X.
    11. Do wykrywania DAPI należy użyć lasera wzbudzającego o długości fali 405 nm i detektora hybrydowego o długości fali 410-530 nm.
    12. Do wykrywania TRITC należy użyć lasera wzbudzającego o długości fali 561 nm i detektora hybrydowego o długości fali 565-650 nm.
    13. Użyj prędkości skanowania 400 Hz (400 linii/s) przy rozdzielczości 1024 × 1024 pikseli.
    14. Rób zdjęcia za pomocą platformy programowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki analizy mikrosatelitarnej z wykorzystaniem pokoleń F0 i F1 wykazały, że krzyżówki wsobne zostały pomyślnie przeprowadzone (Rysunek 4)6. W wyniku krzyżowania wsobnego kryte matki uzyskiwano w ciągu miesiąca od założenia eksperymentalnych rodzin krzyżowych. Jedna czwarta (27,1 ± 8,91% SD) całego potomstwa (F2) z krzyżówek wsobnych była płci męskiej, podczas gdy pozostała część to samice (robotnice i królowa)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono protokoły, które można wykorzystać do indukowania krzyżówek wsobnych i oceny występowania chowu wsobnego u mrówki V. emeryi. W eksperymentach konieczne jest genotypowanie osobników użytych do krzyżówek, aby upewnić się, że krzyżówki wsobne zakończyły się sukcesem. Skuteczność tych testów krzyżowych jest jednak wyraźnie widoczna, ponieważ diploidalne samce mogą być produkowane przez cały rok, podczas gdy haploidalne samce mogą być produkowane tylko jesienią, zarówno w terenie, jak i w lab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Panu Taku Shimadzie, delegatowi AntRoom, Tokio, Japonia, za dostarczenie nam swojego zdjęcia V. emeryi reproductions. Projekt ten został sfinansowany przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Research Fellowship for Young Scientists (16J00011) oraz Grant in Aid for Young Scientists (B)(16K18626).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tynk proszkowyN/AN/AMożna użyć dowolnej marki
Węgiel drzewny, aktywowany, proszekWako033-02117,037-02115
Szkło przesuwneNIE DOTYCZYDOTYCZYMożna użyć dowolnej marki
Sucha dieta krykietaNIENie dotyczy Można użyć dowolnej marki
Brązowy shuger N/AN/AMożna użyć dowolnej marki
Styrenowy futerał w kształcie kwadratuJAKO JEDENDowolny rozmiarRozmiar różni się w zależności od liczby mrówek
IncbatorMożna użyć dowolnej marki
Aluminiowa wanna blokowa Sucha jednostka termiczna DTU-1BTAITEC0014035-000
1,5 ml Hyper Microtube, przezroczysta, okrągła dnoWATSON131-715CS
Etanol (99,5)Wako054-07225
Mikroskop stereoskopowyN/AN/AMożna użyć dowolnej marki
ForsepsDUMONT0108-5-PO
Chelex 100 forma sodowaSIGMA11139-85-8
Tabletki z buforem fosforanowym (PBS), pH 7,4TaKaRaT9181
ParaformaldehydWako162-16065
-Cellstain- Rozwiązanie DAPIDojindo Molecular TechnologiesD523
ABI 3100xl Analizator genetycznyApplied BiosystemsSkontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Leica TCS SP8LeicaSkontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMMLeicaSkontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATERLeicaSkontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.
Leica HyDTMLeicaSkontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.
Leica Application Suite X (LAS X)LeicaSkontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.
NIE DOTYCZY

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
  2. Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
  3. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
  4. Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
  5. Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895(2012).
  6. Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
  7. Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
  8. Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
  9. Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
  10. Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
  11. Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
  12. De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
  13. Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  14. Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
  15. Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
  16. Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
  17. Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).
  18. Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
  19. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).
  20. da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
  21. Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
  22. Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
  23. Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Determinacja p cigenetyka b onk weksamce androgenetycznepolimorfizm skrzydeekstrakcja DNAmikroskopia konfokalnabarwienie DAPIsekcja organ w rozrodczych

Powiązane artykuły