Połączenie barwienia histochemicznego i analizy obrazu w celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajników czereśni podczas spoczynku zimowego

Summary

Przedstawiamy metodologię ilościowego określania zawartości skrobi w zawiązkach jajników u czereśni (Prunus avium L.) podczas spoczynku zimowego za pomocą systemu analizy obrazu w połączeniu z technikami histochemicznymi.

Abstract

Zmiany w skrobi w małych strukturach są związane z kluczowymi wydarzeniami podczas kilku procesów rozwojowych roślin, w tym fazy reprodukcyjnej od zapylenia do zapłodnienia i początku owocowania. Jednak różnice w skrobi podczas różnicowania kwiatów nie są w pełni znane, głównie ze względu na trudności w ilościowym określeniu zawartości skrobi w szczególnie małych strukturach zawiązków kwiatowych. W tym miejscu opisano metodę oznaczania ilościowego zawartości skrobi w zawiązkach jajników czereśni (Prunus avium L.) za pomocą systemu analizy obrazu dołączonego do mikroskopu, który umożliwia powiązanie zmian zawartości skrobi z różnymi fazami spoczynku od jesieni do wiosny. W tym celu stan spoczynku pąków kwiatowych określa się poprzez ocenę wzrostu pąków pędów przeniesionych do kontrolowanych warunków w różnych momentach zimy. W celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajnika pąki kwiatowe są kolejno zbierane, utrwalane, zatapiane w wosku parafinowym, cięte i barwione I₂Kl (jodek potasu-jodek). Preparaty są obserwowane pod mikroskopem i analizowane przez analizator obrazu, który wyraźnie odróżnia skrobię od tła. Wartości zawartości skrobi uzyskuje się poprzez pomiar gęstości optycznej obrazu, która odpowiada barwionej skrobi, biorąc pod uwagę sumę gęstości optycznej każdego piksela jako oszacowanie zawartości skrobi w badanej klatce.

Introduction

Rośliny drzewiaste strefy umiarkowanej dostosowują się do pór roku, modulując swój wzrost i rozwój. Podczas gdy rozwijają się wiosną i latem, przestają rosnąć jesienią, aby przejść w stan uśpienia zimą¹. Chociaż spoczynek pozwala im przetrwać w niskich temperaturach zimowych, chłodzenie jest warunkiem wstępnym prawidłowego pękania pąków na wiosnę². Ważne implikacje spoczynku w produkcji owoców strefy umiarkowanej i leśnictwie doprowadziły do podjęcia różnorodnych wysiłków w celu określenia i przewidzenia okresu spoczynku³. W przypadku gatunków drzew owocowych eksperymenty empiryczne przenoszące pędy do warunków wymuszających oraz prognozy statystyczne oparte na danych dotyczących kwitnienia są aktualnymi podejściami do określenia daty przerwania spoczynku, co pozwala badaczom oszacować wymagania dotyczące chłodzenia dla każdej odmiany. Jednak sposób określania stanu spoczynku na podstawie procesów biologicznych pozostaje niejasny³.

Kwitnienie na drzewach owocowych strefy umiarkowanej, takich jak czereśnia (Prunus avium L.), występuje raz w roku i trwa około dwóch tygodni. Jednak kwiaty zaczynają się różnicować i rozwijać około 10 miesięcy wcześniej, podczas poprzedniego lata⁴. Primordia kwiatowe przestają rosnąć jesienią, aby zimą pozostać uśpione w pąkach. W tym okresie każda odmiana musi zgromadzić określone wymagania dotyczące chłodzenia, aby kwitnąć prawidłowo⁴. Pomimo braku zmian fenologicznych w pąkach zimą, zawiązki kwiatów są fizjologicznie aktywne w okresie spoczynku, a akumulacja niskich temperatur została ostatnio powiązana z dynamiką akumulacji lub spadku skrobi w komórkach zawiązka jajnika, oferując nowe podejście do określania spoczynku⁵. Jednak mały rozmiar i lokalizacja zawiązka jajnika wymagają specjalnej metodologii.

Skrobia jest głównym węglowodanem magazynującym gatunki roślin drzewiastych⁶. Tak więc zmiany w skrobi zostały powiązane z fizjologiczną aktywnością tkanek kwiatowych, które potrzebują węglowodanów do wspierania swojego rozwoju^7,8. Różne kluczowe zdarzenia podczas procesu rozrodczego są również związane z różnicami w zawartości skrobi w różnych strukturach kwiatowych, takimi jak mejoza pylników⁹, wzrost łagiewki pyłkowej poprzez styl lub zapłodnienie zalążka¹⁰. Techniki histochemiczne pozwalają na wykrycie skrobi w każdej poszczególnej tkance zawiązków kwiatowych w okresie spoczynku. Pozostaje jednak trudność w ilościowym określeniu tej skrobi, aby umożliwić śledzenie jej wzorca akumulacji/spadku w czasie lub porównanie zawartości skrobi między tkankami, odmianami lub latami. Wynika to z niewielkiej ilości tkanki dostępnej dla technik analitycznych¹¹. Alternatywnie, analiza obrazu połączona z mikroskopią¹² pozwala na ilościowe określenie skrobi w bardzo małych próbkach tkanki roślinnej¹³.

Podejścia łączące mikroskopię i analizę obrazu zostały użyte do ilościowego określenia zawartości różnych składników w tkankach roślinnych, takich jak callose¹⁴, microtubes¹⁵, lub starch¹⁶, mierząc rozmiar obszaru zabarwionego przez określone plamy. W przypadku skrobi można go łatwo wykryć za pomocą reakcji jodek potasu z jodkiem (I₂KI) ¹⁷. Ta metoda jest bardzo specyficzna; I₂KI interkaluje się w strukturze laminarnej ziaren skrobi i tworzy ciemnoniebieski lub czerwono-brązowy kolor, w zależności od zawartości amylozy w klasie skrobi18. Skrawki barwione barwnikiem I₂KI wykazują odpowiedni kontrast między skrobią a tkanką tła, co pozwala na jednoznaczne wykrycie skrobi i późniejszą kwantyfikację przez system analizy obrazu¹⁹. Chociaż barwnik ten nie jest stechiometryczny, akumulacja jodu jest proporcjonalna do długości cząsteczki skrobi, która może się bardzo różnić¹⁷. W związku z tym rozmiar zabarwionego obszaru wyrażony jako liczba pikseli może nie odzwierciedlać dokładnie zawartości skrobi, ponieważ można stwierdzić duże różnice w zawartości skrobi między polami z barwionymi obszarami o podobnej wielkości. Alternatywnie, zawartość skrobi można ocenić, mierząc gęstość optyczną barwionych granulek na czarno-białych obrazach uzyskanych z mikroskopu, tak jak to opisano w różnych tkankach w apricot^8,13,19, avocado^10,20 i Olive²¹.

Tutaj opisujemy metodologię, która łączy eksperymentalne określanie stanu spoczynku z ilościowym oznaczaniem zawartości skrobi w tkance zawiązka jajnika od jesieni do wiosny u czereśni, oferując nowe narzędzie do zrozumienia i przewidywania spoczynku w oparciu o badanie biologicznych mechanizmów związanych ze spoczynkiem.

Protocol

1. Określanie spoczynku i zbieranie materiału roślinnego

1. Spróbuj pąków kwiatowych na polu. Badania spoczynku są eksperymentami długoterminowymi i wymagają, aby dorosłe drzewa były wystarczająco duże, aby zbierać pąki i pędy przez całą zimę bez uszczerbku dla rozwoju drzew następnej wiosny. W zależności od systemu szkolenia może być wymagane specjalne zarządzanie sadem; W związku z tym przycinanie może być mniej dotkliwe niż w przypadku produkcji owoców.
   1. Każdego tygodnia, od początku jesieni do początku pękania pąków, zbierz i zważ 10 pąków kwiatowych.
   2. Utrwalić pąki kwiatowe, umieszczając je w szklanej probówce o pojemności 10 ml z nakrętką i zanurzyć próbki w utrwalającym roztworze etanolu/kwasu octowego (3:1) przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie wyrzuć utrwalacz i dodaj 75% etanolu, obficie upewniając się, że pokrywa próbki. Próbki można przechowywać w tym roztworze w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      Uwaga: Infiltracja próżniowa może być użyta do usunięcia pęcherzyków powietrza wewnątrz pąka i zapobieżenia ich unoszeniu się. Ułatwia to przenikanie utrwalacza do tkanek, ale może uszkodzić strukturę tkanek. Staraj się tego unikać, jeśli nie jest to konieczne.
2. Pobranie próbek pędów na polu.
   1. Każdego tygodnia, od początku jesieni do początku pękania pąków, weź trzy pędy o długości 15 - 30 cm i średnicy 5 mm, zawierające co najmniej 10 pąków kwiatowych każdy. Umieścić je na nasączonej wodą piance florystycznej w komorze wzrostowej w temperaturze 22 ± 1 °C z 12-godzinnym fotoperiodem świetlnym.
   2. Po 10 dniach w komorze wzrostowej zbierz i zważ 10 pąków kwiatowych z pędów.
3. Oceń wzrost pąków i określ stan spoczynku. Okres pobierania próbek musi być dostosowany do warunków panujących w danym miejscu. W warunkach sadowniczych (Saragossa, Hiszpania, 41°44'30 � N, 0°47′00 � W, 220 m n.p.m.) pobieranie próbek pędów prowadzono od 30 listopada do końca lutego lub początku marca.
   1. Co tydzień oceniaj reakcję pąków kwiatowych na odpowiednie warunki wzrostu w komorze, od początku jesieni do pęknięcia pąków na wiosnę, porównując wagę 10 pąków zebranych z pola.
   2. Jeśli nie ma różnic lub różnice te są mniejsze niż 30%, należy wziąć pod uwagę, że pąki nie spełniły swoich wymagań dotyczących chłodzenia i są endodormantami²². Jeśli różnice są większe niż 30%, należy wziąć pod uwagę, że pąki spełniły swoje wymagania dotyczące chłodzenia i są ekodormantyczne²².

2. Przygotowanie materiału roślinnego do ilościowego oznaczania skrobi

1. Wybierz około sześciu stałych pąków z każdej daty pobierania próbek (patrz krok 1.1). W zależności od odmiany, każdy pączek kwiatowy czereśni zawiera do pięciu zawiązków kwiatowych.
   1. Usuń zewnętrzne łuski pąków i umieść je na szkiełku zegarmistrzowskim z 75% etanolem, aby zapobiec jego wysychaniu.
   2. Wypreparuj pączek i wyekstrahuj co najmniej jeden zawiązek kwiatowy na pączek za pomocą precyzyjnych kleszczy i skalpela okulistycznego pod mikroskopem stereoskopowym. Zawiązki kwiatowe można przechowywać w szklanej probówce o pojemności 10 ml zawierającej 75% etanolu w temperaturze 4 °C lub od razu przejść do następnego kroku.
2. Odwodnić próbki w serii trzeciorzędowego alkoholu butylowego.
   1. Zastąp 75% roztwór etanolu 10 ml 75% trzeciorzędowego alkoholu butylowego (TBA), aby obficie pokryć próbki i inkubować je przez 1,5 godziny. Pipeta Pasteura może być przydatna do wyrzucenia roztworu.
   2. Powtórzyć krok 2.2.1, dodając TBA o rosnących stężeniach (85%, 95% i 100% v/v; oraz 3x z czystym TBA) w piecu suszącym w temperaturze 30 °C z ekstrakcją powietrza, ponieważ czysty TBA krystalizuje w temperaturze pokojowej (< 20 °C) i jest bardzo lotny i toksyczny. Jeśli TBA skrystalizuje się z próbką, uszkodzi tkanki.
3. Zanurzyć próbki w parafinie¹⁸.
   1. Stopić parafinę, wprowadzając perełki parafinowe do pieca suszącego w temperaturze 60 °C z ekstrakcją powietrza poprzedniego dnia. Perły parafinowe można również topić na płycie grzejnej, ale upewnij się, że ciekła parafina ma temperaturę 60 °C, a nie wyższą, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
   2. Zastąp TBA mieszaniną TBA i oleju parafinowego (1:1) i inkubuj przez 24 godziny w piecu do suszenia w temperaturze 60 °C. Następnie zastąpić mieszaninę TBA i oleju parafinowego czystą stopioną parafiną i inkubować przez co najmniej 6 godzin w piecu suszącym w temperaturze 60 °C. Powtórzyć to 2 razy i inkubować ostatnią zmianę przez co najmniej 4 - 6 dni.
   3. Umieść każdą próbkę na małej metalowej podstawie na gorącej powierzchni, zatopionej w wosku parafinowym i nadaj tempo kasecie do zatapiania. Umieść go na zimnej powierzchni i usuń blok po zestaleniu się wosku.
4. Preparaty należy podzielić na sekcje i ponownie nawodnić.
   1. Przygotować klej Haupta: rozpuścić 1 g zwykłej żelatyny Knox w 100 ml wody destylowanej o temperaturze 30 °C, następnie dodać 2 g luźnych kryształów fenolu (C₆H₅OH) i 15 ml glicerolu. Rozprowadź klej Haupt na szkiełku za pomocą pędzla i dodaj kroplę 1% roztworu formaldehydu.
   2. Każdy blok parafiny należy rozciąć na głębokość 10 μm w mikrotomie rotacyjnym i umieścić skrawki na szkiełku podstawowym pokrytym klejem Haupta.
   3. Umieścić szkiełka podstawowe wraz z sekcjami na powierzchni grzewczej w temperaturze 35 - 40 °C do wyschnięcia, a następnie przenieść szkiełka podstawowe na stojak na szkiełka.
   4. Przygotuj roztwory do odparafinowania i ponownego nawodnienia. Umieścić 200 ml Histoclear II w trzech naczyniach do barwienia szkła, drugim z Histoclear II: etanol (1:1, v/v), serię etanolową (100%, 70%, 40%, v/v) i końcowe płukanie wodą destylowaną.
   5. Odwoskować skrawki trzema płukaniami, każde 5 minut, w Histoclear II i w Histoclear II: etanol (1:1, v/v). Umieść stojak na szkiełka wewnątrz naczyń do barwienia szkła, upewniając się, że roztwór całkowicie zakrywa szkiełka, a następnie przenieś stojak na szkiełka z jednego roztworu do drugiego.
   6. Ponownie uwodnić sekcje w następujących seriach 2-minutowych płukań: seria etanolu (100%, 70%, 40%, v/v) i końcowe płukanie wodą destylowaną. Na koniec wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej.
5. Plamić sekcje¹⁸.
   1. Przygotować barwnik I₂KI: rozpuścić 2 g jodku potasu (KI) i 0,2 g jodu (I₂) w 100 ml wody destylowanej. Nałóż kroplę świeżego I₂KI na sekcję (sekcje) przez 5 minut, a następnie wyrzuć nadmiar plamy, wchłaniając ją bibułą. Szybko przejdź do następnego kroku.
   2. Nałóż niewielką kroplę syntetycznego nośnika montażowego, umieść małą szklankę nakrywkową na wierzchu i mocno dociśnij. Po wyschnięciu podłoża mocującego obserwować pod mikroskopem w jasnym polu w celu wstępnej oceny skrobi jajnikowej.
      Uwaga: Ten krok nie jest obowiązkowy, chociaż uzyskuje się lepszy kontrast między skrobią a tłem. Jeżeli po ilościowym określeniu skrobi skrobia musi być ponownie użyta z innymi plamami, należy umieścić szkło nakrywkowe na kropli plamy i wyrzucić nadmiar, wchłaniając go bibułą (patrz ppkt 2.5.1). Następnie, po ilościowym określeniu skrobi, przepłukać plamę I₂KI wodą destylowaną i umieścić preparaty na powierzchni grzewczej w temperaturze 35-40 °C aż do wyschnięcia.

3. Kwantyfikacja zawartości skrobi

1. Skalibruj warunki optyczne.
   Uwaga: Poziomy detekcji używane przez analizator obrazu do wykrywania barwionej skrobi są bezpośrednio zależne od warunków oświetleniowych i powiększenia mikroskopu; W ten sposób ustal te warunki dla wszystkich ocenianych preparatów. Dostosuj proponowaną tutaj regulację do dostępnego mikroskopu i warunków oświetleniowych.
   1. Dostosuj przysłonę przy 20-krotnym powiększeniu i regulatorze jasności lub natężeniu światła.
   2. Upewnij się, że w uchwycie filtra nie ma filtrów i wybierz warunki jasnego pola w mikroskopie. Wybierz odpowiednie powiększenie (np. 40X dla zawiązka jajnika czereśni).
2. Kontroluj warunki akwizycji obrazu. Dostosuj ustawienia aparatu za pomocą barwionego preparatu bez chusteczki za pomocą Obraz | Akwizycja | Podgląd wstępny.
   1. Ustaw jasność na 50%, wzmocnienie na 1,0x, a histogram wskazuje wartość gamma na 1,00 i kontrast na 0 - 100, wyrównując się z granicami histogramu rozkładu jasności.
   2. Aktywuj funkcję prześwietlenia/niedoświetlenia i dostosuj czas ekspozycji na granicy prześwietlenia.
   3. Zastosuj funkcję balansu bieli do całego obrazu, aby wyświetlić wszystkie elementy obrazu o neutralnych kolorach bez żadnych odcieni kolorów, a korekcję cieniowania do całego obrazu, aby uzyskać skorygowany i jednorodny obraz.
3. Skalibruj system analizy obrazu, aby uzyskać wartości kontrolne poziomu szarości (0,; 255, biały) o różnych gęstościach optycznych (OD), które są uzyskiwane przez wartości transmitancji (T).
   1. Uzyskaj obraz barwionego preparatu bez tkanki, uważanego za biały kontrolny, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą opcji Pomiar | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 0 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to 100% przepuszczalności; zatem gęstość optyczna 0, zgodnie z OD = 2 - log T.
   2. Uzyskaj obraz tego samego preparatu z filtrem 4N, który zmniejsza ilość światła 4x, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą Measure | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 0,6 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to przepuszczalności 25%; zatem gęstość optyczna 0,6, zgodnie z OD = 2 - log T.
   3. Uzyskaj obraz tego samego preparatu bez światła, uważany za, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą opcji Pomiar | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 1 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to przepuszczalności 0%; zatem gęstość optyczna 1, zgodnie z OD = 2 - log T.
4. Wykryj skrobię.
   1. Uzyskaj kolorowy obraz pola do pomiaru w formacie TIFF o rozdzielczości co najmniej 300 punktów na cal (dpi).
   2. Utwórz obraz binarny odpowiadający poplamionemu obszarowi. Ustaw trzy progi kolorów (wartości od 0 do 255 dla każdego), aż obraz binarny dokładnie odzwierciedli zaobserwowane zabarwione granulki skrobi za pomocą punktu menu Obraz | Wykrywanie | Wybierz progi czerwonego, niebieskiego i zielonego | Dobrze. Dokonuj wielokrotnych porównań wizualnych w różnych preparatach i tkankach, aby dostroić końcowe poziomy wykrywania. Przechowuj i używaj tych poziomów do wszystkich preparatów.
   3. Określ ilościowo skrobię. Przekształć oryginalny kolorowy obraz w czarno-biały obraz za pomocą systemu analizy obrazu. Użyj obrazu binarnego jako maski nałożonej na obraz czarno-biały za pomocą opcji Obraz | Edycja binarna. Zmierz sumę gęstości optycznej każdego piksela pod maską za pomocą opcji Zmierz | Poziom szarości | OK i potraktuj tę wartość jako zawartość skrobi w mierzonym polu.
   4. Powtórzyć kroki 3.4.1 - 3.4.3 w czterech miejscach zawiązków jajnika, aby uzyskać reprezentatywną wartość zawartości skrobi w jajniku zawiązków kwiatowych.
   5. Powtórz kroki 3.4.1 - 3.4.3 i 3.4.5 dla różnych kwiatów w każdej dacie zbioru.

Results

Badania nad spoczynkiem wymagają określenia momentu, w którym spełnione są wymagania dotyczące mrożących krew w żyłach. Pomimo braku zmian fenologicznych podczas zimy w warunkach polowych (Rysunek 1A), wiśnie nie odzyskują zdolności wzrostu w odpowiednich warunkach, dopóki nie przejdą pewnego okresu w niskich temperaturach. Regularne przenoszenie pędów do komory w kontrolowanych warunkach (Rysunek 1B) w okresie zimowym pozwoliło na ocenę stanu spocz...

Discussion

Spoczynek bylin drzewiastych ma wyraźne implikacje dla produkcji owoców i leśnictwa w zmieniającym się klimacie, chociaż proces biologiczny stojący za spoczynkiem pozostaje niejasny. Do badań nad spoczynkiem można podchodzić z różnych punktów widzenia, ale badania poszukujące biologicznego markera spoczynku zimowego nasiliły się w ostatnich latach. Jednak większość prób znalezienia jednoznacznego wskaźnika pokazującego, kiedy pączek przerwał spoczynek, zakończyła się niepowodzeniem³. Opisana tu me...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Skala precyzyjna	Sartorius	CP225D
Mikroskop stereoskopowy	Leica Microsystems	MZ-16
Piec suszący	Memmert	U15
Stacja zatapiania parafiny	Leica Microsystems	EG1140H
Mikrotom rotacyjny	Reichert-Jung	1130/Biocut
Ostrze mikrotomu	Feather	S35	Stal nierdzewna
Mikroskop jasnego pola	Aparat cyfrowy Leica Microsystems	DM2500
System	Leica Microsystems	DC-300
		Quantiment Q550