Połączenie barwienia histochemicznego i analizy obrazu w celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajników czereśni podczas spoczynku zimowego

Rośliny drzewiaste strefy umiarkowanej dostosowują się do pór roku, modulując swój wzrost i rozwój. Podczas gdy rozwijają się wiosną i latem, przestają rosnąć jesienią, aby przejść w stan uśpienia zimą¹. Chociaż spoczynek pozwala im przetrwać w niskich temperaturach zimowych, chłodzenie jest warunkiem wstępnym prawidłowego pękania pąków na wiosnę². Ważne implikacje spoczynku w produkcji owoców strefy umiarkowanej i leśnictwie doprowadziły do podjęcia różnorodnych wysiłków w celu określenia i przewidzenia okresu spoczynku³. W przypadku gatunków drzew owocowych eksperymenty empiryczne przenoszące pędy do warunków wymuszających oraz prognozy statystyczne oparte na danych dotyczących kwitnienia są aktualnymi podejściami do określenia daty przerwania spoczynku, co pozwala badaczom oszacować wymagania dotyczące chłodzenia dla każdej odmiany. Jednak sposób określania stanu spoczynku na podstawie procesów biologicznych pozostaje niejasny³.

Kwitnienie na drzewach owocowych strefy umiarkowanej, takich jak czereśnia (Prunus avium L.), występuje raz w roku i trwa około dwóch tygodni. Jednak kwiaty zaczynają się różnicować i rozwijać około 10 miesięcy wcześniej, podczas poprzedniego lata⁴. Primordia kwiatowe przestają rosnąć jesienią, aby zimą pozostać uśpione w pąkach. W tym okresie każda odmiana musi zgromadzić określone wymagania dotyczące chłodzenia, aby kwitnąć prawidłowo⁴. Pomimo braku zmian fenologicznych w pąkach zimą, zawiązki kwiatów są fizjologicznie aktywne w okresie spoczynku, a akumulacja niskich temperatur została ostatnio powiązana z dynamiką akumulacji lub spadku skrobi w komórkach zawiązka jajnika, oferując nowe podejście do określania spoczynku⁵. Jednak mały rozmiar i lokalizacja zawiązka jajnika wymagają specjalnej metodologii.

Skrobia jest głównym węglowodanem magazynującym gatunki roślin drzewiastych⁶. Tak więc zmiany w skrobi zostały powiązane z fizjologiczną aktywnością tkanek kwiatowych, które potrzebują węglowodanów do wspierania swojego rozwoju^7,8. Różne kluczowe zdarzenia podczas procesu rozrodczego są również związane z różnicami w zawartości skrobi w różnych strukturach kwiatowych, takimi jak mejoza pylników⁹, wzrost łagiewki pyłkowej poprzez styl lub zapłodnienie zalążka¹⁰. Techniki histochemiczne pozwalają na wykrycie skrobi w każdej poszczególnej tkance zawiązków kwiatowych w okresie spoczynku. Pozostaje jednak trudność w ilościowym określeniu tej skrobi, aby umożliwić śledzenie jej wzorca akumulacji/spadku w czasie lub porównanie zawartości skrobi między tkankami, odmianami lub latami. Wynika to z niewielkiej ilości tkanki dostępnej dla technik analitycznych¹¹. Alternatywnie, analiza obrazu połączona z mikroskopią¹² pozwala na ilościowe określenie skrobi w bardzo małych próbkach tkanki roślinnej¹³.

Podejścia łączące mikroskopię i analizę obrazu zostały użyte do ilościowego określenia zawartości różnych składników w tkankach roślinnych, takich jak callose¹⁴, microtubes¹⁵, lub starch¹⁶, mierząc rozmiar obszaru zabarwionego przez określone plamy. W przypadku skrobi można go łatwo wykryć za pomocą reakcji jodek potasu z jodkiem (I₂KI) ¹⁷. Ta metoda jest bardzo specyficzna; I₂KI interkaluje się w strukturze laminarnej ziaren skrobi i tworzy ciemnoniebieski lub czerwono-brązowy kolor, w zależności od zawartości amylozy w klasie skrobi18. Skrawki barwione barwnikiem I₂KI wykazują odpowiedni kontrast między skrobią a tkanką tła, co pozwala na jednoznaczne wykrycie skrobi i późniejszą kwantyfikację przez system analizy obrazu¹⁹. Chociaż barwnik ten nie jest stechiometryczny, akumulacja jodu jest proporcjonalna do długości cząsteczki skrobi, która może się bardzo różnić¹⁷. W związku z tym rozmiar zabarwionego obszaru wyrażony jako liczba pikseli może nie odzwierciedlać dokładnie zawartości skrobi, ponieważ można stwierdzić duże różnice w zawartości skrobi między polami z barwionymi obszarami o podobnej wielkości. Alternatywnie, zawartość skrobi można ocenić, mierząc gęstość optyczną barwionych granulek na czarno-białych obrazach uzyskanych z mikroskopu, tak jak to opisano w różnych tkankach w apricot^8,13,19, avocado^10,20 i Olive²¹.

Tutaj opisujemy metodologię, która łączy eksperymentalne określanie stanu spoczynku z ilościowym oznaczaniem zawartości skrobi w tkance zawiązka jajnika od jesieni do wiosny u czereśni, oferując nowe narzędzie do zrozumienia i przewidywania spoczynku w oparciu o badanie biologicznych mechanizmów związanych ze spoczynkiem.

1. Określanie spoczynku i zbieranie materiału roślinnego

1. Spróbuj pąków kwiatowych na polu. Badania spoczynku są eksperymentami długoterminowymi i wymagają, aby dorosłe drzewa były wystarczająco duże, aby zbierać pąki i pędy przez całą zimę bez uszczerbku dla rozwoju drzew następnej wiosny. W zależności od systemu szkolenia może być wymagane specjalne zarządzanie sadem; W związku z tym przycinanie może być mniej dotkliwe niż w przypadku produkcji owoców.
   1. Każdego tygodnia, od początku jesieni do początku pękania pąków, zbierz i zważ 10 pąków kwiatowych.
   2. Utrwalić pąki kwiatowe, umieszczając je w szklanej probówce o pojemności 10 ml z nakrętką i zanurzyć próbki w utrwalającym roztworze etanolu/kwasu octowego (3:1) przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie wyrzuć utrwalacz i dodaj 75% etanolu, obficie upewniając się, że pokrywa próbki. Próbki można przechowywać w tym roztworze w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      Uwaga: Infiltracja próżniowa może być użyta do usunięcia pęcherzyków powietrza wewnątrz pąka i zapobieżenia ich unoszeniu się. Ułatwia to przenikanie utrwalacza do tkanek, ale może uszkodzić strukturę tkanek. Staraj się tego unikać, jeśli nie jest to konieczne.
2. Pobranie próbek pędów na polu.
   1. Każdego tygodnia, od początku jesieni do początku pękania pąków, weź trzy pędy o długości 15 - 30 cm i średnicy 5 mm, zawierające co najmniej 10 pąków kwiatowych każdy. Umieścić je na nasączonej wodą piance florystycznej w komorze wzrostowej w temperaturze 22 ± 1 °C z 12-godzinnym fotoperiodem świetlnym.
   2. Po 10 dniach w komorze wzrostowej zbierz i zważ 10 pąków kwiatowych z pędów.
3. Oceń wzrost pąków i określ stan spoczynku. Okres pobierania próbek musi być dostosowany do warunków panujących w danym miejscu. W warunkach sadowniczych (Saragossa, Hiszpania, 41°44'30 � N, 0°47′00 � W, 220 m n.p.m.) pobieranie próbek pędów prowadzono od 30 listopada do końca lutego lub początku marca.
   1. Co tydzień oceniaj reakcję pąków kwiatowych na odpowiednie warunki wzrostu w komorze, od początku jesieni do pęknięcia pąków na wiosnę, porównując wagę 10 pąków zebranych z pola.
   2. Jeśli nie ma różnic lub różnice te są mniejsze niż 30%, należy wziąć pod uwagę, że pąki nie spełniły swoich wymagań dotyczących chłodzenia i są endodormantami²². Jeśli różnice są większe niż 30%, należy wziąć pod uwagę, że pąki spełniły swoje wymagania dotyczące chłodzenia i są ekodormantyczne²².

2. Przygotowanie materiału roślinnego do ilościowego oznaczania skrobi

1. Wybierz około sześciu stałych pąków z każdej daty pobierania próbek (patrz krok 1.1). W zależności od odmiany, każdy pączek kwiatowy czereśni zawiera do pięciu zawiązków kwiatowych.
   1. Usuń zewnętrzne łuski pąków i umieść je na szkiełku zegarmistrzowskim z 75% etanolem, aby zapobiec jego wysychaniu.
   2. Wypreparuj pączek i wyekstrahuj co najmniej jeden zawiązek kwiatowy na pączek za pomocą precyzyjnych kleszczy i skalpela okulistycznego pod mikroskopem stereoskopowym. Zawiązki kwiatowe można przechowywać w szklanej probówce o pojemności 10 ml zawierającej 75% etanolu w temperaturze 4 °C lub od razu przejść do następnego kroku.
2. Odwodnić próbki w serii trzeciorzędowego alkoholu butylowego.
   1. Zastąp 75% roztwór etanolu 10 ml 75% trzeciorzędowego alkoholu butylowego (TBA), aby obficie pokryć próbki i inkubować je przez 1,5 godziny. Pipeta Pasteura może być przydatna do wyrzucenia roztworu.
   2. Powtórzyć krok 2.2.1, dodając TBA o rosnących stężeniach (85%, 95% i 100% v/v; oraz 3x z czystym TBA) w piecu suszącym w temperaturze 30 °C z ekstrakcją powietrza, ponieważ czysty TBA krystalizuje w temperaturze pokojowej (< 20 °C) i jest bardzo lotny i toksyczny. Jeśli TBA skrystalizuje się z próbką, uszkodzi tkanki.
3. Zanurzyć próbki w parafinie¹⁸.
   1. Stopić parafinę, wprowadzając perełki parafinowe do pieca suszącego w temperaturze 60 °C z ekstrakcją powietrza poprzedniego dnia. Perły parafinowe można również topić na płycie grzejnej, ale upewnij się, że ciekła parafina ma temperaturę 60 °C, a nie wyższą, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
   2. Zastąp TBA mieszaniną TBA i oleju parafinowego (1:1) i inkubuj przez 24 godziny w piecu do suszenia w temperaturze 60 °C. Następnie zastąpić mieszaninę TBA i oleju parafinowego czystą stopioną parafiną i inkubować przez co najmniej 6 godzin w piecu suszącym w temperaturze 60 °C. Powtórzyć to 2 razy i inkubować ostatnią zmianę przez co najmniej 4 - 6 dni.
   3. Umieść każdą próbkę na małej metalowej podstawie na gorącej powierzchni, zatopionej w wosku parafinowym i nadaj tempo kasecie do zatapiania. Umieść go na zimnej powierzchni i usuń blok po zestaleniu się wosku.
4. Preparaty należy podzielić na sekcje i ponownie nawodnić.
   1. Przygotować klej Haupta: rozpuścić 1 g zwykłej żelatyny Knox w 100 ml wody destylowanej o temperaturze 30 °C, następnie dodać 2 g luźnych kryształów fenolu (C₆H₅OH) i 15 ml glicerolu. Rozprowadź klej Haupt na szkiełku za pomocą pędzla i dodaj kroplę 1% roztworu formaldehydu.
   2. Każdy blok parafiny należy rozciąć na głębokość 10 μm w mikrotomie rotacyjnym i umieścić skrawki na szkiełku podstawowym pokrytym klejem Haupta.
   3. Umieścić szkiełka podstawowe wraz z sekcjami na powierzchni grzewczej w temperaturze 35 - 40 °C do wyschnięcia, a następnie przenieść szkiełka podstawowe na stojak na szkiełka.
   4. Przygotuj roztwory do odparafinowania i ponownego nawodnienia. Umieścić 200 ml Histoclear II w trzech naczyniach do barwienia szkła, drugim z Histoclear II: etanol (1:1, v/v), serię etanolową (100%, 70%, 40%, v/v) i końcowe płukanie wodą destylowaną.
   5. Odwoskować skrawki trzema płukaniami, każde 5 minut, w Histoclear II i w Histoclear II: etanol (1:1, v/v). Umieść stojak na szkiełka wewnątrz naczyń do barwienia szkła, upewniając się, że roztwór całkowicie zakrywa szkiełka, a następnie przenieś stojak na szkiełka z jednego roztworu do drugiego.
   6. Ponownie uwodnić sekcje w następujących seriach 2-minutowych płukań: seria etanolu (100%, 70%, 40%, v/v) i końcowe płukanie wodą destylowaną. Na koniec wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej.
5. Plamić sekcje¹⁸.
   1. Przygotować barwnik I₂KI: rozpuścić 2 g jodku potasu (KI) i 0,2 g jodu (I₂) w 100 ml wody destylowanej. Nałóż kroplę świeżego I₂KI na sekcję (sekcje) przez 5 minut, a następnie wyrzuć nadmiar plamy, wchłaniając ją bibułą. Szybko przejdź do następnego kroku.
   2. Nałóż niewielką kroplę syntetycznego nośnika montażowego, umieść małą szklankę nakrywkową na wierzchu i mocno dociśnij. Po wyschnięciu podłoża mocującego obserwować pod mikroskopem w jasnym polu w celu wstępnej oceny skrobi jajnikowej.
      Uwaga: Ten krok nie jest obowiązkowy, chociaż uzyskuje się lepszy kontrast między skrobią a tłem. Jeżeli po ilościowym określeniu skrobi skrobia musi być ponownie użyta z innymi plamami, należy umieścić szkło nakrywkowe na kropli plamy i wyrzucić nadmiar, wchłaniając go bibułą (patrz ppkt 2.5.1). Następnie, po ilościowym określeniu skrobi, przepłukać plamę I₂KI wodą destylowaną i umieścić preparaty na powierzchni grzewczej w temperaturze 35-40 °C aż do wyschnięcia.

3. Kwantyfikacja zawartości skrobi

1. Skalibruj warunki optyczne.
   Uwaga: Poziomy detekcji używane przez analizator obrazu do wykrywania barwionej skrobi są bezpośrednio zależne od warunków oświetleniowych i powiększenia mikroskopu; W ten sposób ustal te warunki dla wszystkich ocenianych preparatów. Dostosuj proponowaną tutaj regulację do dostępnego mikroskopu i warunków oświetleniowych.
   1. Dostosuj przysłonę przy 20-krotnym powiększeniu i regulatorze jasności lub natężeniu światła.
   2. Upewnij się, że w uchwycie filtra nie ma filtrów i wybierz warunki jasnego pola w mikroskopie. Wybierz odpowiednie powiększenie (np. 40X dla zawiązka jajnika czereśni).
2. Kontroluj warunki akwizycji obrazu. Dostosuj ustawienia aparatu za pomocą barwionego preparatu bez chusteczki za pomocą Obraz | Akwizycja | Podgląd wstępny.
   1. Ustaw jasność na 50%, wzmocnienie na 1,0x, a histogram wskazuje wartość gamma na 1,00 i kontrast na 0 - 100, wyrównując się z granicami histogramu rozkładu jasności.
   2. Aktywuj funkcję prześwietlenia/niedoświetlenia i dostosuj czas ekspozycji na granicy prześwietlenia.
   3. Zastosuj funkcję balansu bieli do całego obrazu, aby wyświetlić wszystkie elementy obrazu o neutralnych kolorach bez żadnych odcieni kolorów, a korekcję cieniowania do całego obrazu, aby uzyskać skorygowany i jednorodny obraz.
3. Skalibruj system analizy obrazu, aby uzyskać wartości kontrolne poziomu szarości (0,; 255, biały) o różnych gęstościach optycznych (OD), które są uzyskiwane przez wartości transmitancji (T).
   1. Uzyskaj obraz barwionego preparatu bez tkanki, uważanego za biały kontrolny, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą opcji Pomiar | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 0 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to 100% przepuszczalności; zatem gęstość optyczna 0, zgodnie z OD = 2 - log T.
   2. Uzyskaj obraz tego samego preparatu z filtrem 4N, który zmniejsza ilość światła 4x, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą Measure | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 0,6 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to przepuszczalności 25%; zatem gęstość optyczna 0,6, zgodnie z OD = 2 - log T.
   3. Uzyskaj obraz tego samego preparatu bez światła, uważany za, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą opcji Pomiar | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 1 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to przepuszczalności 0%; zatem gęstość optyczna 1, zgodnie z OD = 2 - log T.
4. Wykryj skrobię.
   1. Uzyskaj kolorowy obraz pola do pomiaru w formacie TIFF o rozdzielczości co najmniej 300 punktów na cal (dpi).
   2. Utwórz obraz binarny odpowiadający poplamionemu obszarowi. Ustaw trzy progi kolorów (wartości od 0 do 255 dla każdego), aż obraz binarny dokładnie odzwierciedli zaobserwowane zabarwione granulki skrobi za pomocą punktu menu Obraz | Wykrywanie | Wybierz progi czerwonego, niebieskiego i zielonego | Dobrze. Dokonuj wielokrotnych porównań wizualnych w różnych preparatach i tkankach, aby dostroić końcowe poziomy wykrywania. Przechowuj i używaj tych poziomów do wszystkich preparatów.
   3. Określ ilościowo skrobię. Przekształć oryginalny kolorowy obraz w czarno-biały obraz za pomocą systemu analizy obrazu. Użyj obrazu binarnego jako maski nałożonej na obraz czarno-biały za pomocą opcji Obraz | Edycja binarna. Zmierz sumę gęstości optycznej każdego piksela pod maską za pomocą opcji Zmierz | Poziom szarości | OK i potraktuj tę wartość jako zawartość skrobi w mierzonym polu.
   4. Powtórzyć kroki 3.4.1 - 3.4.3 w czterech miejscach zawiązków jajnika, aby uzyskać reprezentatywną wartość zawartości skrobi w jajniku zawiązków kwiatowych.
   5. Powtórz kroki 3.4.1 - 3.4.3 i 3.4.5 dla różnych kwiatów w każdej dacie zbioru.

Badania nad spoczynkiem wymagają określenia momentu, w którym spełnione są wymagania dotyczące mrożących krew w żyłach. Pomimo braku zmian fenologicznych podczas zimy w warunkach polowych (Rysunek 1A), wiśnie nie odzyskują zdolności wzrostu w odpowiednich warunkach, dopóki nie przejdą pewnego okresu w niskich temperaturach. Regularne przenoszenie pędów do komory w kontrolowanych warunkach (Rysunek 1B) w okresie zimowym pozwoliło na ocenę stanu spoczynku pąków kwiatowych. Ocenę wzrostu pąków kwiatowych przeprowadzono poprzez pomiar wzrostu masy pąków. Podczas gdy w okresie spoczynku nie można było zaobserwować żadnych zmian po 10 dniach odpowiednich warunków (Rysunek 1C), po pokonaniu spoczynku pąki pęczniały i pękały w komorze wzrostu (Ryc. 1D). Wyniki tej analizy pozwoliły na ustalenie stanu spoczynku pąków. Ze względu na różne temperatury występujące zimą, spoczynek był pokonywany w różnych terminach, w zależności od roku. Podczas gdy w pierwszym roku badania przerwanie spoczynku nastąpiło w styczniu, w drugim roku zima była łagodniejsza; Tak więc mrożące krew w żyłach spełnienie nastąpiło jakieś trzy tygodnie później, w lutym.

Czereśnia ma pąki kwiatowe w ostrogach, gdzie wierzchołek jest pączkiem wegetatywnym, a boczne pąki są pąkami kwiatowymi (Rysunek 1C i 1D). Niezróżnicowane pąki zaczęły różnicować się w pąki kwiatowe lub wegetatywne pod koniec lata, a kiedy wchodzą w stan spoczynku w okresie zimowym, w pąku pozostaje kilka zawiązków kwiatowych, chronionych licznymi zielonymi łuskami i pokrytych brązowymi łuskami zewnętrznymi (Rysunek 1C i Rysunek 2A). Sekcja pąka kwiatowego wykazała małe zawiązki kwiatowe w środku (Ryc. 2A). Każdy pączek kwiatowy zawierał od jednego do pięciu pojedynczych zawiązków kwiatowych (Ryc. 2B). Pomimo niewielkich rozmiarów każdego zawiązka kwiatowego, wszystkie części kwiatu są zróżnicowane i można je rozróżnić: słupek, pylniki, płatki i działki kielicha (Rysunek 2C). Zastosowanie technik histochemicznych (utrwalanie alkohol:oct [3:1], zatapianie wosku parafinowego, cięcie mikrotomów i barwienie skrobi na bazie jodu) pozwoliło na zaobserwowanie rozmieszczenia skrobi w tkankach zawiązków kwiatowych (Rysunek 2D).

Skrobia w zawiązku jajnika została oznaczona ilościowo w każdej sekcji. Cztery pomiary 1337 μm2, przy 40-krotnym powiększeniu, reprezentowały ogólny układ skrobi w zawiązku jajnika czereśni (Ryc. 3A). Granulki skrobi zostały wyraźnie odróżnione od tła po barwieniu I2KI (Rysunek 3B). Skrobia została zidentyfikowana przez system analizy obrazu, poprzez dostosowanie progów kolorów czerwonego, zielonego i niebieskiego, aż wszystkie obserwowane granulki skrobi zostały pokryte obrazem binarnym utworzonym przez system na podstawie zdefiniowanych parametrów koloru (Rysunek 3C). Uzyskane wartości zawartości skrobi były wynikiem pomiaru gęstości optycznej każdego piksela pod maską na czarno-białym obrazie (Rysunek 3D).

Kwantyfikacja skrobi ujawniła spójny wzorzec dynamiki skrobi podczas zimy (Rysunek 4). Konsekwentnie, ilość skrobi wczesną zimą przedstawiała wartość gęstości optycznej mniejszą niż 40 0003, podczas gdy maksymalna ilość osiągała wartość między 120 000 a 140 000 w obu latach. Podczas gdy maksymalna wartość została osiągnięta w styczniu w pierwszym roku (Rysunek 4A), wystąpiła w lutym w drugim roku (Rysunek 4B). Porównując te wyniki z karnacją w stanie spoczynku, maksymalna ilość skrobi wystąpiła jednocześnie z chłodzącym wypełnieniem w obu latach.

To podejście wymaga określenia stanu spoczynku (Rysunek 5A) równocześnie z kwantyfikacją skrobi na tkance jajnika (Rysunek 5B) w celu określenia zmian zawartości skrobi w odniesieniu do spoczynku.

Rysunek 1: Zestaw doświadczalny do określania stanu spoczynku pąków kwiatowych czereśni. (A) Na gałęziach zimą ukazują uśpione pąki zamknięte i pokryte ciemnobrązowymi łuskami. (B) Panel ten pokazuje pędy przeniesione do komory wzrostowej. W połowie stycznia niektóre odmiany pozostawały w stanie uśpienia z pąkami nadal zamkniętymi (biała strzałka), podczas gdy inne były w stanie rosnąć, pokazując spuchnięte pąki (strzałka). (C) Panel ten pokazuje szczegół pędu z uśpionymi pąkami kwiatowymi umieszczonymi z boku i pojedynczym pąkiem wegetatywnym umieszczonym w pozycji wierzchołkowej ostrogi. (D) Panel ten pokazuje szczegół pędu po przezwyciężeniu spoczynku po 10 dniach w komorze wzrostu, pokazując pęcznienie pąków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie materiału roślinnego do ilościowego oznaczania skrobi. (A) Panel ten pokazuje poprzeczny przekrój pąka kwiatowego, pokazujący dwie zawiązki kwiatowe (fp) chronione licznymi łuskami (sc). (B) Trzy zawiązki kwiatowe (fp) zbierają się w pąk kwiatowy. (C) Ten panel pokazuje poprzeczny przekrój zawiązka kwiatowego, ze wszystkimi zróżnicowanymi okółkami: działkami kielicha (se), płatkami (pe), pylnikami (an) i słupkiem (pi). Zawiązek jajnika wyróżnia się u podstawy słupka (strzałka). (D) Środkowa część zawiązka kwiatowego została zebrana i utrwalona w styczniu, zatopiona w wosku parafinowym, pocięta i zabarwiona I2KI (ciemnobrązowy) na skrobię. Ten panel pokazuje zawiązek jajnika (strzałka). Podziałki mają wymiary 500 μm w panelach A i B oraz 200 μm w panelach C i D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Kwantyfikacja skrobi w zawiązkach jajnika czereśni. (A) Panel ten przedstawia środkową część zawiązka jajnika wybarwionego I2KI, pokazując cztery ramki, w których zmierzono zawartość skrobi. (B) Ten panel pokazuje szczegół zawiązka jajnika. Granulki skrobi są zabarwione na ciemnobrązowy kolor. (C) Ten panel pokazuje pseudokolorowy obraz, w którym skrobia odpowiada różnym odcieniom niebieskiego. (D) Ten panel pokazuje binarną maskę obrazu pokrywającą skrobię barwioną I2KI (niebieską) na czarno-białym oryginalnym obrazie. Gęstość optyczna jest mierzona tylko w pikselach oryginalnego obrazu pokrytego maską. Podziałki mają wymiary 100 μm w panelu A i 20 μm w panelach B - D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki oznaczania ilościowego skrobi w zawiązkach jajników czereśni pobieranych co miesiąc od jesieni do wiosny przez dwa lata w różnych warunkach temperatury zimowej. (A) Panel ten pokazuje wyniki z lat 2010 - 2011, które miały mroźną zimę. Chłodzące spełnienie (płatek śniegu) nastąpiło w styczniu, wraz z maksymalną ilością skrobi. (B) Panel ten pokazuje wyniki z lat 2011 - 2012, które charakteryzowały się łagodną zimą. Chłodzące spełnienie (płatek śniegu) nastąpiło w lutym, wraz z maksymalną ilością skrobi. Wartości te są średnią ± błędem standardowym średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Schemat projektu doświadczalnego mającego na celu ocenę stanu spoczynku pąków i kwantyfikacji skrobi w zawiązkach jajników czereśni. (A) Ten panel pokazuje procesy pracy związane z określaniem stanu spoczynku: przygotowanie materiału roślinnego, proces i uzyskane wyniki. (B) Ten panel przedstawia procesy kwantyfikacji skrobi: histochemiczne przygotowanie pąków do mikroskopowej obserwacji skrobi, wykrywanie skrobi w analizie obrazu oraz oznaczanie ilościowe skrobi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.