Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

DOI:

10.3791/58528

⸱

27 listopada 2019

 , 
1Department of Clinical Sciences, Division of Infection Medicine, Lund University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to podobne do sieci struktury przeciwdrobnoustrojowe składające się z DNA i białek przeciwdrobnoustrojowych pochodzących z granulek. Mikroskopia immunofluorescencyjna i metody kwantyfikacji oparte na obrazie pozostają ważnymi narzędziami do ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili. Istnieją jednak kluczowe ograniczenia dotyczące metod opartych na immunofluorescencji, które są obecnie dostępne do ilościowego oznaczania NET. Ręczne metody kwantyfikacji NET na podstawie obrazów są często subiektywne, podatne na błędy i żmudne dla użytkowników, zwłaszcza niedoświadczonych. Ponadto obecnie dostępne opcje oprogramowania do oznaczania ilościowego są albo półautomatyczne, albo wymagają szkolenia przed obsługą. W tym miejscu demonstrujemy implementację zautomatyzowanej metody kwantyfikacji obrazu opartej na immunofluorescencji do oceny powstawania NET o nazwie NETQUANT. Oprogramowanie jest łatwe w użyciu i posiada przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI). Uwzględnia ona parametry biologicznie istotne, takie jak wzrost powierzchni i stosunek białek markerowych DNA:NET oraz deformacja jądrowa w celu zdefiniowania powstawania NET. Co więcej, narzędzie to jest zbudowane jako bezpłatna aplikacja i pozwala na kwantyfikację i analizę rozdzielczości pojedynczej komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są kluczowymi mediatorami wrodzonych reakcji obronnych gospodarza przeciwko szerokiej gamie patogenów mikrobiologicznych1. Wykonują swoje funkcje przeciwdrobnoustrojowe, uwalniając granulki zawierające szeroki wachlarz białek przeciwdrobnoustrojowych2, wytwarzając reaktywne formy tlenu (ROS) i podchloryt1, oraz poprzez fagocytozę3. Ponadto Brinkmann i wsp.4 opisał zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili (NET) jako nowy mechanizm, dzięki któremu neutrofile wyłapują i eliminują inwazyjne patogeny. Od czasu ich odkrycia nieco ponad dekadę temu4, NET są zamieszane w wiele różnych chorób zakaźnych5,6 i non-infectious7 chorób. Tworzenie NET jest procesem aktywnym i powoduje ekstruzję DNA chromatyny pokrytego granulowanymi białkami przeciwdrobnoustrojowymi pochodzącymi z granulek8. Niektóre z kluczowych zmian w morfologii komórkowej i jądrowej związanych z powstawaniem NET obejmują utratę morfologii jądrowej, dekondensację chromatyny, mobilizację białek ziarnistych z cytoplazmy do jądra oraz wzrost średnicy jądra i komórki8,9.

Sieci podobne do sieci, które mogą wyglądać jak rozproszone struktury nieco większe niż komórka lub jako struktury kilkakrotnie większe niż pojedynczy neutrofil, są uważane za wskaźniki NETosis5,10. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej NET można wykryć poprzez sondowanie DNA za pomocą sondy fluorescencyjnej, takiej jak 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) oraz przez barwienie immunofluorescencyjne białek związanych z NET, takich jak elastaza neutrofilowa. Kwantyfikacja nakładających się obszarów barwienia dla DNA i białek związanych z NET określa całkowity obszar pod NET w image11.

Dostępnych jest wiele opcji analizy obrazu, które umożliwiają ilościowe określanie NETs na podstawie obrazów fluorescencyjnych11,12. Jednak te opcje oprogramowania mają ograniczenia, ponieważ nie są przyjazne dla użytkownika i/lub w pełni zautomatyzowane. W tym artykule demonstrujemy działanie NETQUANT13, bezpłatnej aplikacji, która może wykonywać bezstronną, w pełni zautomatyzowaną kwantyfikację NET opartą na obrazie mikroskopii immunofluorescencyjnej. Aplikacja posiada przyjazny dla użytkownika interfejs graficzny (GUI) i może wykonywać analizę pojedynczych komórek. Oprogramowanie określa ilościowo NETozę na obrazie, wykrywając zmiany morfologiczne w obszarze markera związanego z DNA-NET, deformację jądra związaną z dekondensacją chromatyny i wzrost stosunku białek związanych DNA:NET. Podsumowując, wiele kryteriów definicji NET pozwala na rygorystyczną kwantyfikację NET w kilku zestawach danych w bezstronny sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komisja etycznej Uniwersytetu w Lund zatwierdziła pobieranie krwi żylnej od zdrowych ochotników zgodnie z Deklaracją Helsińską (2013/728). Wszyscy ochotnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Izolacja neutrofili krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

  1. Pobrać ludzką krew żylną do probówek zawierających heparynę i pozwolić probówkom osiągnąć temperaturę pokojową.
    Uwaga: Do uzyskania wystarczająco dużej osadki komórkowej wymagane jest co najmniej 16 ml krwi od zdrowego dawcy.
  2. Wymieszać krew z jedną objętością 2% dekstranu w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i pozostawić do osadu w temperaturze pokojowej przez 30 minut w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
  3. Odessać sklarowany osad do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Począwszy od tego etapu, należy kontynuować izolację w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
  5. Zawiesić osad w 5 ml lodowatej soli fizjologicznej i nałożyć na 5 ml gradientu izolacji leukocytów (9,1% diatrizoinian sodu z 5,7% dekstranem, w/v) w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
  6. Wirować przez 30 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C.
  7. Odessać supernatant i wyrzucić go.
  8. Poddaj lizie czerwone krwinki, ponownie zawieszając osad w 3 ml lodowatej wody na 30 s. Natychmiast dodaj 1 ml 3,6% NaCl, a następnie napełnij 10 ml lodowatej soli fizjologicznej.
  9. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 350 x g.
  10. Usunąć sklarowany osad, zebrać osad komórkowy i ponownie zawiesić go w 1 ml soli fizjologicznej. Odłożyć 10 μl do probówki mikrowirówkowej w celu oceny liczby komórek i żywotności przy użyciu błękitu trypanowego w komorze Bürkera.
  11. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do 90 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek do komory Bürkera. Policz komórki w 4 kwadratach ograniczonych 3 liniami w każdym rogu komory. Komórki, które wydają się ciemnoniebieskie dla wychwytu barwnika, są nieżywotne, wyklucz je z całkowitej liczby komórek.
  12. Wyraź liczbę komórek jako komórki/ml, zgodnie z poniższym równaniem.
    figure-protocol-1
    Uwaga: Tutaj współczynnik komory wynosił 10 000, współczynnik rozcieńczenia wynosił 10, a całkowita liczba kwadratów wynosiła 4.
  13. Rozcieńczyć pozostałą zawiesinę komórkową do 10 ml w celu przeprowadzenia ostatniego etapu płukania.
  14. Wirować przez 5 minut przy 200 x g.
  15. Ponownie zawiesić neutrofile w RPMI-1640 za pomocą 2 mg/ml inaktywowanej termicznie albuminy surowicy ludzkiej (HSA) w stężeniu 5 x 105 komórek/ml.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i stymulacja neutrofili

  1. Umieścić jedno szkiełko nakrywkowe (10 mm, #1) w każdym dołku płytki 12-dołkowej i pokryć szkiełko nakrywkowe, dodając 200 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny i pozostawić na noc w temperaturze 37 °C.
  2. Szkiełka nakrywkowe należy raz umyć 300 μl soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i pozostawić do wyschnięcia.
  3. Dodać 400 μl 5 x 105 neutrofili/ml do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  4. Przenieść płytkę zawierającą granulocyty obojętnochłonne do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% stężeniemCO2 na 15 minut.
  5. Usunąć supernatant. Dodaj 400 μl podgrzanej pożywki RPMI-1640 z 2 mg/ml HSA do kontroli. Dodaj 300 μl wstępnie podgrzanego RPMI z 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA) o mocy 20 nM w celu stymulacji.
  6. Stymulować neutrofile przez 150 minut w temperaturze 37 °C za pomocą 5% CO2 .

3. Wizualizacja sieci NET

  1. Usunąć supernatant i przemyć próbki 2x 200 μl PBS.
  2. Utrwalać próbki, dodając 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) do PBS przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  3. Próbki przemyć 3x 200 μL PBS.
  4. Przepuszczalność próbek przez dodanie 50 μl 0,5% Triton X-100 przez 30 s.
  5. Przemyć próbki 3x 200 μl PBS.
  6. Próbki należy zablokować 5% surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  7. Dodać 300 μl pierwotnej króliczej elastazy anty-ludzkiej neutrofili w roztworze blokującym w rozcieńczeniu 1:500 przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Przemyć próbki 3x 300 μl PBS.
  9. Dodać 300 μl wtórnego koziego przeciwciała fluorescencyjnego przeciwko królikowi w rozcieńczeniu 1:1000 przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
  10. Szkiełka nakrywkowe umyć 3x 300 μl PBS.
  11. Wyjąć szkiełka nakrywkowe ze studzienek i zamontować szkiełko nakrywkowe z 10 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI. Przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności do wysuszenia próbek.
    Uwaga: Barwienie DNA za pomocą DAPI jest z pewnością krytycznym krokiem w tej metodzie. Użytkownicy mogą również rozwiązywać problemy, dodając egzogenny roztwór DAPI w końcowym zakresie stężeń 0,1\u20120.5 μg/ml przez 2\u20123 min, a następnie w 3 etapach płukania 300 μl PBS.
  12. Uzyskuj obrazy za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu obiektywu 20X.

4. Analiza i kwantyfikacja NET za pomocą NETQUANT

Uwaga: NETQUANT można pobrać, klikając plik instalacyjny znajdujący się w archiwum Zenodo Github lub na stronie Nordenfelt Lab (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).

  1. Importowanie zestawów danych do analizy, nazywanie kanałów i konwersja obrazów
    1. Otwórz kartę Ustawienia w NETQUANT.
    2. Wybierz folder źródłowy do analizy, klikając opcję Pobierz ścieżkę w menu źródłowym i wybierz folder zawierający sekwencje obrazów do analizy.
    3. Kliknij opcję Pobierz ścieżkę w menu docelowym i wybierz folder, w którym chcesz zapisać dane po analizie obrazu.
    4. Nazwij kanały tak, aby "kanał DNA" odpowiadał barwieniu DNA (np. DNA lub DAPI), a "kanał NET" przedstawiał barwienie białek związanych z NET (np. NET, elastaza neutrofilowa) na obrazach. Aby zapewnić sprawne działanie oprogramowania, (zalecane) nazwij folder zawierający pliki obrazów kontrolnych jako "control".
      Uwaga: Kanał NET odnosi się tylko do barwienia markerem białka ziarnistości związanego z NET.
    5. Wprowadź metadane obrazu do oprogramowania, klikając przycisk Załaduj informacje o obrazie w podmenu Informacje o obrazie.
    6. Wybierz właściwą kolejność kanałów zawartą na obrazach w podmenu Kolejność kanałów. Ta opcja została dołączona jako zabezpieczenie przed awarią, aby zapobiec przypadkowym niezgodnościom.
    7. Uzyskaj podstawowe właściwości obrazu z danych RAW i przekonwertuj obrazy, klikając przycisk Przygotuj dane. Przekonwertowane obrazy pojawią się w podmenu Typ próbki. Kliknij menu Typ próbki, aby wyświetlić i wybrać wszystkie zestawy danych pozyskane do analizy.
    8. Wybierz obraz z podmenu Typ próbki i kliknij przycisk Wyświetl dane obrazu, aby wyświetlić obrazy podzielone odpowiednio na kanał DNA i NET.
  2. Segmentacja komórek w kanale DNA i kanale NET
    1. Wybierz metodę segmentacji, klikając podmenu Metoda zarówno w kanale DNA, jak i w kanale NET.
      Uwaga: Domyślna metoda segmentacji jest ustawiona na adaptacyjną i jest to ustawienie zalecane. Dostępne są również inne opcje, w tym globalne, krawędziowe i Chan-Vese. Dostępna jest również opcja zlewni, która pomaga rozróżnić blisko rozmieszczone komórki lub sieci NET.
    2. Wejdź w zakładkę Segmentacja, aby najpierw podzielić komórki kontrolne na segmenty w obu kanałach, klikając opcję Segmentuj próbki kontrolne.
    3. Wybierz PMA z podmenu typu próbki i kliknij opcję Batch (zalecana), aby rozpocząć segmentację wszystkich obrazów zawartych w zestawie danych. Wybierz obrazy w menu typu próbki i kliknij przycisk Wyświetl dane obrazu, aby zwizualizować i zweryfikować binarne maski obrazu (maska DNA i maska NET) wygenerowane po segmentacji.
  3. Jednokomórkowa analiza możliwych do zidentyfikowania właściwości
    1. Wejdź w zakładkę analiza i przeanalizuj próbki kontrolne, klikając przycisk Wyznacz próg.
    2. Zmień typ próbki na PMA i kliknij przycisk Pobierz właściwości komórki, aby zakończyć analizę stymulowanych próbek.
    3. Wybierz obraz z podmenu Typ próbki i kliknij przycisk Wyświetl dane obrazu, aby wyświetlić nakładkę oraz liczbę komórek i komórek tworzących NET na obrazie.
  4. Porównanie właściwości komórek w celu identyfikacji komórek tworzących NET
    1. Wybierz próbkę z podmenu typu próbki i kliknij przycisk Analizuj NETs, aby zakończyć analizę. Poszczególne obrazy można wybrać z podmenu typu próbki do analizy lub całą partię obrazów można przeanalizować, wybierając opcję wsadową (zalecane).
    2. Dostosuj kryteria NET ręcznie, aby uzyskać optymalne wyniki dla danej próbki. Porównaj zidentyfikowane sieci NET z oryginalnymi obrazami, aby ocenić jakość identyfikacji.
      Uwaga: Kryteria NET mogą być następnie używane w odniesieniu do wszystkich obrazów w zestawie danych. Wszelkie zmiany w kryteriach NET są stosowane jednocześnie we wszystkich próbach kontrolnych. Ogranicza to możliwość wystąpienia jakichkolwiek różnic potencjałów, które mogą powstać w wyniku nadmiernego dopasowania parametrów NET. Ustawienia w kryteriach NET można dostosować do wymagań użytkownika. Związek między współczynnikiem fałszywych wykryć a NETQUANT został zbadany wcześniej13. Typowe zakresy wzrostu powierzchni to 2\u20124, kołowość wynosi 0,7\u20120,9, a stosunek DNA/NET wynosi 0,6–2,0.
    3. Sprawdź podsumowanie danych w podmenu Dane komórki, w którym wyświetlana jest liczba obrazów, liczba komórek na obraz i procent NET na obraz.
      Uwaga: Łączny procent NET w całym zbiorze danych jest wyświetlany przez "NET-gauge". Całkowita liczba obrazów, liczba komórek, procent NET w próbie (NETs%) i NETs% w próbie kontrolnej są wyświetlane w tabeli statystyk podsumowujących poniżej wskaźnika NET. Zalecamy, aby dane kontrolne były przedstawiane wraz z danymi uzyskanymi z próbek stymulowanych.
  5. Wyniki
    1. Wejdź do zakładki Wyjście, aby wybrać i wyświetlić wyniki wyjściowe.
    2. Przeglądaj i porównuj różne dane wyjściowe wygenerowane w wyniku analizy kontroli i PMA, wybierając formę danych wyjściowych i klikając przycisk Wyniki wyjściowe.
      Uwaga: Wszystkie dane wygenerowane po analizie zarówno dla kontroli, jak i stymulacji są zapisywane w folderze analizy, jak wybrano w podmenu celu. Dane są zapisywane w formacie .csv lub .pdf.
    3. Uruchom plik Method, aby uzyskać wersję oprogramowania i kryteria NET używane do analizy (do dołączenia do sekcji metod w celu publikacji).
    4. Kliknij tabelę danych Wyniki, aby zwizualizować poszczególne punkty danych w danej próbce.
    5. Wizualizacja rozkładu powierzchni NET i stosunku DNA:NET w próbkach. Czerwona linia wskazuje wartość progową na wykresach.
    6. Określ obszar NET w funkcji kształtu DNA, klikając plik rozkładu dwuwymiarowego.
  6. Wczytywanie poprzedniej analizy i wsadowanie wszystkich kroków
    1. Wczytaj poprzednio udane ustawienia analizy do NETQUANT za pomocą przycisku Wczytaj poprzednią analizę.
    2. Użyj przycisku Grupuj wszystkie kroki znajdującego się w menu Ustawienia, aby uruchomić kroki 5\u201212 (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5) bezpośrednio, aby uzyskać końcowy wynik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5 x 105 neutrofili/ml wysiewano na szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na 12-dołkowej płytce i stymulowano albo 20 nM PMA, albo pozostawiono bez stymulacji przez 150 min. Próbki zostały następnie wybarwione przy użyciu pierwotnych przeciwciał przeciwko ludzkiej elastazie neutrofilowej królika, wtórnych przeciwciał sprzężonych przeciwko króliczemu fluoroforowi i DAPI - fluorescencyjnie znakowanego barwnika, który barwi DNA (szczegóły w Tabeli Materiałów). Nast...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formacja NET jest stosunkowo nowym dodatkiem do zróżnicowanego arsenału neutrofili4 i zauważalny jest wzrost zainteresowania badaniem implikacji NET w szerokim zakresie obszarów badawczych 5,7,14,15. Akwizycja obrazów za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, a następnie kwantyfikacja oparta na obrazie jest szeroko stosowaną metodą ilościowego oznaczania NET. Takie p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TM i PN mają zgłoszony patent związany z algorytmami stosowanymi w NETQUANT.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca została sfinansowana przez Fundację Crafoord (TM i PN), grant badawczy rządu szwedzkiego (PN, TM), Szwedzką Radę ds. Badań (PN) i Fundację Groschinsky'ego (TM, PN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD Vacutainer Heparynizowane probówki z tworzywa sztucznegoBD Biosciences367885
LymphoprepAxis-Shield114547
RPMI-1640 z L-glutaminąGibco11835-030
Kolby stożkowe 50 mlSarstedt62.547.004
Kolby stożkowe 15 mlSarstedt62.554.002
Tkanka 12-dołkowa Płytki hodowlaneFalcon10626491
#1 Szkiełka nakrywkowe 10mmMenzel GlaserCS10100
Szkiełka podstawoweMenzel Glaser631-0098
Pierwotna elastaza antyludzkaDAKO DAKOkrólik 1373, immunizacja kontraktowa
Wtórny fluorofor sprzężony koza anty-królikTechnologie życiaA-11072, A-11070
Odczynnik PROLONG-Gold Antifade z technologiami DAPILifeP36930Podłoże montażowe
Kozia surowicaSigma-AldrichG9023
12-mirystynian 13-octanu Phorbol (PMA)Sigma-Aldrich79346
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Nikon Ti-E Mikroskop epifluorescencyjnyNikon
Andor Zyla
Plan Apochromat Obiektywy 20x, 40xNikon
Windows 10MicrosoftSystem operacyjny
macOS Sierra 10.12AppleSystem operacyjny
MATLABMathworks
Aparat CCD firmy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
  3. Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  6. Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
  10. Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
  11. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).
  12. Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
  13. Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999(2017).
  14. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  15. Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
  16. Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie NETanaliza obrazuzautomatyzowana kwantyfikacjamikroskopia immunofluorescencyjnaanaliza pojedynczych kom rekstosunek DNA do NETdeformacja j dra kom rkowegooprogramowanie NETQUANTstymulacja PMA

Powiązane artykuły