Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58528

⸱

27 listopada 2019

 , 
1Department of Clinical Sciences, Division of Infection Medicine, Lund University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Streszczenie

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to podobne do sieci struktury przeciwdrobnoustrojowe składające się z DNA i białek przeciwdrobnoustrojowych pochodzących z granulek. Mikroskopia immunofluorescencyjna i metody kwantyfikacji oparte na obrazie pozostają ważnymi narzędziami do ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili. Istnieją jednak kluczowe ograniczenia dotyczące metod opartych na immunofluorescencji, które są obecnie dostępne do ilościowego oznaczania NET. Ręczne metody kwantyfikacji NET na podstawie obrazów są często subiektywne, podatne na błędy i żmudne dla użytkowników, zwłaszcza niedoświadczonych. Ponadto obecnie dostępne opcje oprogramowania do oznaczania ilościowego są albo półautomatyczne, albo wymagają szkolenia przed obsługą. W tym miejscu demonstrujemy implementację zautomatyzowanej metody kwantyfikacji obrazu opartej na immunofluorescencji do oceny powstawania NET o nazwie NETQUANT. Oprogramowanie jest łatwe w użyciu i posiada przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI). Uwzględnia ona parametry biologicznie istotne, takie jak wzrost powierzchni i stosunek białek markerowych DNA:NET oraz deformacja jądrowa w celu zdefiniowania powstawania NET. Co więcej, narzędzie to jest zbudowane jako bezpłatna aplikacja i pozwala na kwantyfikację i analizę rozdzielczości pojedynczej komórki.

Wprowadzenie

Neutrofile są kluczowymi mediatorami wrodzonych reakcji obronnych gospodarza przeciwko szerokiej gamie patogenów mikrobiologicznych1. Wykonują swoje funkcje przeciwdrobnoustrojowe, uwalniając granulki zawierające szeroki wachlarz białek przeciwdrobnoustrojowych2, wytwarzając reaktywne formy tlenu (ROS) i podchloryt1, oraz poprzez fagocytozę3. Ponadto Brinkmann i wsp.4 opisał zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili (NET) jako nowy mechanizm, dzięki któremu neutrofile wyłapują i eliminują inwazyjne patogeny. Od czasu ich odkrycia nieco ponad dekadę temu4, NET są zamieszane w wiele różnych chorób zakaźnych5,6 i non-infectious7 chorób. Tworzenie NET jest procesem aktywnym i powoduje ekstruzję DNA chromatyny pokrytego granulowanymi białkami przeciwdrobnoustrojowymi pochodzącymi z granulek8. Niektóre z kluczowych zmian w morfologii komórkowej i jądrowej związanych z powstawaniem NET obejmują utratę morfologii jądrowej, dekondensację chromatyny, mobilizację białek ziarnistych z cytoplazmy do jądra oraz wzrost średnicy jądra i komórki8,9.

Sieci podobne do sieci, które mogą wyglądać jak rozproszone struktury nieco większe niż komórka lub jako struktury kilkakrotnie większe niż pojedynczy neutrofil, są uważane za wskaźniki NETosis5,10. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej NET można wykryć poprzez sondowanie DNA za pomocą sondy fluorescencyjnej, takiej jak 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) oraz przez barwienie immunofluorescencyjne białek związanych z NET, takich jak elastaza neutrofilowa. Kwantyfikacja nakładających się obszarów barwienia dla DNA i białek związanych z NET określa całkowity obszar pod NET w image11.

Dostępnych jest wiele opcji analizy obrazu, które umożliwiają ilościowe określanie NETs na podstawie obrazów fluorescencyjnych11,12. Jednak te opcje oprogramowania mają ograniczenia, ponieważ nie są przyjazne dla użytkownika i/lub w pełni zautomatyzowane. W tym artykule demonstrujemy działanie NETQUANT13, bezpłatnej aplikacji, która może wykonywać bezstronną, w pełni zautomatyzowaną kwantyfikację NET opartą na obrazie mikroskopii immunofluorescencyjnej. Aplikacja posiada przyjazny dla użytkownika interfejs graficzny (GUI) i może wykonywać analizę pojedynczych komórek. Oprogramowanie określa ilościowo NETozę na obrazie, wykrywając zmiany morfologiczne w obszarze markera związanego z DNA-NET, deformację jądra związaną z dekondensacją chromatyny i wzrost stosunku białek związanych DNA:NET. Podsumowując, wiele kryteriów definicji NET pozwala na rygorystyczną kwantyfikację NET w kilku zestawach danych w bezstronny sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komisja etyczna Uniwersytetu w Lund zatwierdziła pobieranie krwi żylnej od zdrowych ochotników zgodnie z Deklaracją Helsińską (2013/728). Wszyscy ochotnicy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu.

1. Izolacja neutrofili z krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradiencie gęstości

  1. Należy pobrać krew żylną człowieka do probówek zawierających heparynę i pozostawić probówki do czasu osiągnięcia temperatury pokojowej.
    Uwaga: Aby uzyskać wystarczająco duży osad komórkowy, wymagane jest pobranie minimum 16 ml krwi od zdrowego dawcy.
  2. Wymieszać krew z taką samą objętością 2% dekstranu w soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i pozostawić do sedymentacji w temperaturze pokojowej przez 30 min w sterylnym, stożkowym probówce do wirowania o pojemności 50 ml.
  3. Odssać nadłożu do sterylnej stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować z prędkością 20 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  4. Od tego etapu kontynuuj izolację w 4 °C lub na lodzie.
  5. Osad resuspendować w 5 ml schłodzonej do temperatury lodowej soli fizjologicznej i nanieść na 5 ml gradientu do izolacji leukocytów (9,1% diatryzoanu sodu z 5,7% dekstranem, m/v) w sterylnej stożkowej probówce do wirowania o pojemności 15 ml.
  6. Wirować przez 30 min przy 40 x g w 4 °C.
  7. Odssać supernatant i go usunąć.
  8. Zlizuj erytrocyty, resuspendując osad w 3 ml lodowatej wody przez 30 s. Bezzwłocznie dodaj 1 ml 3,6% NaCl, a następnie dopełnij objętość do 10 ml lodowatym roztworem soli fizjologicznej.
  9. Odwiruj zawiesinę komórkową przez 10 min przy 350 x g.
  10. Usunąć nadsącz, zebrać osad komórkowy i zawiesić go ponownie w 1 ml soli fizjologicznej. Odstawić. 10 µL w probówce do mikrocentryfugowania w celu oceny liczby i żywotności komórek przy użyciu błękitu trypanowego w komorze Bürkera.
  11. Dodaj 10 µL zawiesiny komórkowej do 90 µL 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Nabrać 10 µL zawiesiny komórkowej w komorze Bürkera. Należy policzyć komórki w 4 kwadratach ograniczonych przez 3 linie w każdym narożniku komory. Komórki, które przybrały ciemnoniebieski kolor w wyniku wchłonięcia barwnika, są nieżywe i powinny zostać wykluczone z całkowitej liczby komórek.
  12. Liczbę komórek należy wyrazić w jednostkach komórek/ml zgodnie z poniższym równaniem.
    Schemat formuły liczenia komórek: Obliczanie liczby komórek/ml przy użyciu błękitu Trypanu, współczynnika komory i współczynnika rozcieńczenia.
    Uwaga: W tym przypadku współczynnik komory wynosił 10 00, współczynnik rozcieńczenia wynosił 10, a całkowita liczba pól wynosiła 4.
  13. Rozcieńczyć pozostałą zawiesinę komórkową do 10 ml w celu przeprowadzenia końcowego etapu płukania.
  14. Wirować przez 5 min przy 20 x g.
  15. Resuspenduj neutrofile w pożywce RPMI-1640 z dodatkiem 2 mg/ml inaktywowanej ciepłem ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) do stężenia 5 x 105 komórek/ml

2. Przygotowanie szkiełek podstawowych i stymulacja neutrofili

  1. Umieścić po jednej szkiełku nakrywce (10 mm, #1) w każdym dołku płytki 12-dołkowej, a następnie pokryć szkiełka, dodając 20 µL 0,01% roztworu poli-L-lizyny i pozostawić w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Przemyć szkiełka nakrywce raz 30 µL solą fosforanową buforowaną (PBS) i pozostawić do wyschnięcia.
  3. Dodać 40 µL zawiesiny neutrofili o stężeniu 5 x 105 neutrophils/mL do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
  4. Przenieść płytkę zawierającą neutrofile do inkubatora w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 na 15 min.
  5. Usunąć supernatant. Do kontroli dodać 400 µL uprzednio podgrzanego medium RPMI-1640 z 2 mg/mL HSA. W celu stymulacji dodać 30 µL podgrzanego medium RPMI z 20 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).
  6. Stymulować neutrofile przez 150 min w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.

3. Wizualizacja NETów

  1. Usunąć supernatant i przemyć próbki 2x przy użyciu 20 µL PBS.
  2. Utrwalić próbki, dodając 20 µL 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS na 20 min w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: PFA jest toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie.
  3. Przemyć próbki 3x przy użyciu 20 µL PBS.
  4. Przeprowadzić permeabilizację próbek, dodając 50 µL 0,5% Triton X-10 na 30 s.
  5. Przemyć próbki 3x przy użyciu 20 µL PBS.
  6. Zablokować próbki, stosując 5% surowicę kozia w PBS przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  7. Dodać 30 µL pierwszego przeciwciała królika przeciwko ludzkiej elastazie neutrofilowej w roztworze blokującym przy rozcieńczeniu 1:50 na 90 min w temperaturze 37 °C.
  8. Przemyć próbki 3x przy użyciu 30 µL PBS.
  9. Dodać 30 µL drugiego fluorescencyjnego przeciwciała koziego przeciwko króliczemu przy rozcieńczeniu 1:10 na 90 min w temperaturze 37 °C.
  10. Przemyć szkiełka podstawowe 3x przy użyciu 30 µL PBS.
  11. Wyjąć szkiełka podstawowe z dołków i zamontować szkiełko, stosując 10 µL medium montującego zawierającego DAPI. Przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności w celu wysuszenia próbek.
    Uwaga: Barwienie DNA za pomocą DAPI jest kluczowym etapem metody. W razie problemów użytkownicy mogą dodać egzogenną roztwór DAPI w końcowym zakresie stężeń 0,1‒0,5 µg/mL przez 2‒3 min, a następnie przeprowadzić 3 etapy płukania 30 µL PBS.
  12. Nabyć obrazy za pomocą szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego z użyciem obiektywu 20X.

4. Analiza i kwantyfikacja NETów przy użyciu NETQUANT

Uwaga: NETQUANT można pobrać, klikając plik instalacyjny znajdujący się w archiwum Zenodo Github lub na stronie internetowej Nordenfelt Lab (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).

  1. Importowanie zestawów danych do analizy, nazywanie kanałów i konwersja obrazów
    1. Otwórz kartę Setup w programie NETQUANT.
    2. Wybierz folder źródłowy do analizy, klikając opcję Get path w menu źródłowym, i zaznacz folder zawierający sekwencje obrazów do analizy.
    3. Kliknij opcję Get Path w menu docelowym i wybierz folder do zapisywania danych po analizie obrazów.
    4. Nazwij kanały tak, aby „DNA channel” odpowiadał barwieniu DNA (np. DNA lub DAPI), a „NET-channel” obrazował barwienie białek związanych z NET (np. NET, elastaza neutrofilowa) na obrazach. Dla prawidłowego działania oprogramowania (zaleca się) nazwać folder zawierający pliki obrazów kontrolnych jako „control”.
      Uwaga: Kanał NET odnosi się wyłącznie do barwienia markerów białek ziarnuelkowych związanych z NET.
    5. Wprowadź metadane obrazów do oprogramowania, klikając przycisk Load image information w podmenu Image information.
    6. W podmenu Channel order wybierz prawidłową kolejność kanałów zawartych w obrazach. Opcja ta została wprowadzona jako zabezpieczenie przed przypadkowymi błędami w dopasowaniu.
    7. Pobierz podstawowe właściwości obrazów z danych surowych i dokonaj konwersji obrazów, klikając przycisk Prepare data button. Przekonwertowane obrazy pojawią się w podmenu Sample type. Kliknij menu Sample type, aby wyświetlić i wybrać wszystkie zestawy danych pobrane do analizy.
    8. Wybierz obraz z podmenu Sample type i kliknij przycisk Display image data, aby wyświetlić obrazy rozdzielone odpowiednio na kanał DNA i NET.
  2. Segmentacja komórek w kanale DNA i kanale NET
    1. Wybierz metodę segmentacji, klikając podmenu Method zarówno dla kanału DNA, jak i kanału NET.
      Uwaga: Domyślna metoda segmentacji jest ustawiona na adaptive i jest to zalecane ustawienie. Dostępne są również inne opcje, takie jak global, edge i Chan-Vese. Dołączono również opcję watershed, aby pomóc w rozróżnianiu blisko położonych komórek lub struktur NET.
    2. Przejdź do karty Segmentation, aby najpierw przeprowadzić segmentację komórek kontrolnych w obu kanałach, klikając opcję Segment control samples.
    3. Wybierz PMA z podmenu typu próbki i kliknij opcję Batch (zalecane), aby rozpocząć segmentację wszystkich obrazów zawartych w zestawie danych. Wybierz obrazy w menu typu próbki i kliknij przycisk Display image data, aby zwizualizować i zweryfikować binarne maski obrazów (maskę DNA i maskę NET) wygenerowane po segmentacji.
  3. Analiza pojedynczych komórek w celu określenia identyfikowalnych właściwości
    1. Przejdź do karty analizy i przeanalizuj próbki kontrolne, klikając przycisk Determine threshold.
    2. Zmień typ próbki na PMA i kliknij przycisk Get cell properties, aby zakończyć analizę próbek stymulowanych.
    3. Wybierz obraz z podmenu Sample type i kliknij przycisk Display image data, aby wyświetlić nałożone obrazy oraz liczbę wszystkich komórek i komórek tworzących NET na obrazie.
  4. Porównanie właściwości komórek w celu identyfikacji komórek tworzących NET
    1. Wybierz próbkę z podmenu typu próbki i kliknij przycisk Analyze NETs, aby zakończyć analizę. Do analizy można wybrać poszczególne obrazy z podmenu typu próbki lub przeanalizować całą partię obrazów, wybierając opcję batch (zalecane).
    2. Ręcznie dostosuj kryteria NET, aby uzyskać optymalne wyniki dla danej próbki. Porównaj zidentyfikowane NET z oryginalnymi obrazami, aby ocenić jakość identyfikacji.
      Uwaga: Kryteria NET można następnie zastosować do wszystkich obrazów w zestawie danych. Wszelkie zmiany w kryteriach NET są stosowane jednocześnie we wszystkich próbkach kontrolnych. Ogranicza to możliwość wystąpienia potencjalnych różnic wynikających z nadmiernego dopasowania (over-fitting) parametrów NET. Ustawienia w kryteriach NET mogą być dostosowane do wymagań użytkownika. Związek między wskaźnikami fałszywych odkryć a NETQUANT był badany wcześniej13. Typowe zakresy dla wzrostu powierzchni wynoszą 2‒4, okrągłość powinna wynosić 0,7‒0,9, a stosunek DNA/NET od 0,6 do 2,0.
    3. Przejrzyj podsumowanie danych w podmenu Cell data, gdzie wyświetlana jest liczba obrazów, liczba komórek na obraz oraz procent NET na obraz.
      Uwaga: Całkowity procent NET w całym zestawie danych jest wyświetlany przez „NET-gauge”. Całkowita liczba obrazów, liczba komórek, procent NET w próbce (NETs%) oraz NETs% w próbce kontrolnej są wyświetlane w tabeli statystyk podsumowujących poniżej NET-gauge. Zalecamy raportowanie danych kontrolnych wraz z danymi uzyskanymi z próbek stymulowanych.
  5. Wyniki analizy
    1. Przejdź do karty Output, aby wybrać i przejrzeć wyniki.
    2. Przeanalizuj i porównaj różne wyniki danych wygenerowane z analizy próbek kontrolnych i PMA, wybierając formę wyjścia i klikając przycisk Output results.
      Uwaga: Wszystkie dane wygenerowane po analizie zarówno dla kontroli, jak i stymulacji, są zapisywane w folderze analizy wybranym w podmenu docelowym. Dane są zapisywane w formatach .csv lub .pdf.
    3. Uruchom Method file, aby uzyskać wersję oprogramowania oraz kryteria NET użyte do analizy (do zamieszczenia w sekcji materiały i metody publikacji).
    4. Kliknij Results data table, aby zwizualizować poszczególne punkty danych w danej próbce.
    5. Wizualizuj rozkład powierzchni NET i stosunek DNA:NET w próbkach. Czerwona linia na wykresach wskazuje wartość progową.
    6. Określ powierzchnię NET w stosunku do kształtu DNA, klikając plik Bivariate distribution.
  6. Wczytywanie poprzednich analiz i automatyzacja wszystkich kroków
    1. Wczytaj wcześniej pomyślnie zastosowane ustawienia analizy do NETQUANT za pomocą przycisku Load previous analysis.
    2. Użyj przycisku Batch all steps zawartego w menu Setup, aby uruchomić kroki 5‒12 (Rycina 1, Rycina 2, Rycina 3, Rycina 4, Rycina 5) bezpośrednio w celu uzyskania końcowego wyniku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Neutrofile w stężeniu 5 x 105 neutrophils/mL wysiano na szkiełka podstawowe umieszczone w płytce 12-dołkowej, a następnie stymulowano za pomocą 20 nM PMA lub pozostawiono bez stymulacji przez 150 min. Próbki barwiono przy użyciu pierwszorzędowych króliczych przeciwciał anty-ludzka elastaza neutrofilowa, drugorzędowych kozich przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z fluorophorem oraz DAPI – barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym DNA (szczegóły znajdują się w Tabeli materi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Formacja NET jest stosunkowo nowym dodatkiem do zróżnicowanego arsenału neutrofili4 i zauważalny jest wzrost zainteresowania badaniem implikacji NET w szerokim zakresie obszarów badawczych 5,7,14,15. Akwizycja obrazów za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, a następnie kwantyfikacja oparta na obrazie jest szeroko stosowaną metodą ilościowego oznaczania NET. Takie p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

TM i PN mają zgłoszony patent związany z algorytmami stosowanymi w NETQUANT.

Podziękowania

Praca została sfinansowana przez Fundację Crafoord (TM i PN), grant badawczy rządu szwedzkiego (PN, TM), Szwedzką Radę ds. Badań (PN) i Fundację Groschinsky'ego (TM, PN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD Vacutainer Heparynizowane probówki z tworzywa sztucznegoBD Biosciences367885
LymphoprepAxis-Shield114547
RPMI-1640 z L-glutaminąGibco11835-030
Kolby stożkowe 50 mlSarstedt62.547.004
Kolby stożkowe 15 mlSarstedt62.554.002
Tkanka 12-dołkowa Płytki hodowlaneFalcon10626491
#1 Szkiełka nakrywkowe 10mmMenzel GlaserCS10100
Szkiełka podstawoweMenzel Glaser631-0098
Pierwotna elastaza antyludzkaDAKO DAKOkrólik 1373, immunizacja kontraktowa
Wtórny fluorofor sprzężony koza anty-królikTechnologie życiaA-11072, A-11070
Odczynnik PROLONG-Gold Antifade z technologiami DAPILifeP36930Podłoże montażowe
Kozia surowicaSigma-AldrichG9023
12-mirystynian 13-octanu Phorbol (PMA)Sigma-Aldrich79346
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Nikon Ti-E Mikroskop epifluorescencyjnyNikon
Andor Zyla
Plan Apochromat Obiektywy 20x, 40xNikon
Windows 10MicrosoftSystem operacyjny
macOS Sierra 10.12AppleSystem operacyjny
MATLABMathworks
Aparat CCD firmy

Bibliografia

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
  3. Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  6. Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
  10. Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
  11. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).
  12. Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
  13. Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999(2017).
  14. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  15. Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
  16. Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilościowe oznaczanie NETanaliza obrazuzautomatyzowana kwantyfikacjamikroskopia immunofluorescencyjnaanaliza pojedynczych komórekstosunek DNA do NETdeformacja jądra komórkowegooprogramowanie NETQUANTstymulacja PMA
Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.