Artykuł metodologiczny

Izolacja, fiksacja i obrazowanie immunofluorescencyjne nadnerczy myszy

DOI:

10.3791/58530

⸱

2 października 2018

 , 
1Department of Internal Medicine (Division of Metabolism, Endocrinology, and Diabetes), University of Michigan Health System, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Health System, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan Health System, 4Endocrine Oncology Program, University of Michigan Health System, 5Comprehensive Cancer Center, University of Michigan Health System

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę izolowania nadnerczy od myszy, naprawiania tkanek, dzielenia ich na sekcje i przeprowadzania barwienia immunofluorescencyjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunofluorescencja jest dobrze znaną techniką wykrywania antygenów w tkankach z wykorzystaniem przeciwciał sprzężonych z fluorochromem i ma szerokie spektrum zastosowań. Wykrywanie antygenów pozwala na scharakteryzowanie i identyfikację wielu typów komórek. Położony nad nerkami i otoczony warstwą komórek mezenchymalnych, nadnercza są narządem endokrynnym złożonym z dwóch różnych tkanek o różnym pochodzeniu embrionalnym, kory zewnętrznej mezodermy pośredniej mezofrycznej i rdzenia wewnętrznego wywodzącego się z grzebienia nerwowego. Kora nadnerczy wydziela steroidy (tj. mineralokortykosteroidy, glikokortykosteroidy, hormony płciowe), podczas gdy rdzeń nadnerczy wytwarza katecholaminy (tj. adrenalinę, noradrenalinę). Podczas prowadzenia badań nadnerczy ważne jest, aby umieć rozróżnić unikalne komórki o różnych funkcjach. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany w naszym laboratorium, który opisuje szereg sekwencyjnych kroków wymaganych do uzyskania barwienia immunofluorescencyjnego w celu scharakteryzowania typów komórek nadnerczy. Najpierw skupiamy się na rozwarstwieniu nadnerczy myszy, mikroskopijnym usuwaniu tłuszczu okołonadnerczowego, a następnie na utrwalaniu, przetwarzaniu i osadzaniu parafiny w tkance. Następnie opisujemy sekcje bloków tkankowych za pomocą mikrotomu obrotowego. Na koniec szczegółowo opisujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego nadnerczy, który opracowaliśmy w celu zminimalizowania zarówno nieswoistego wiązania przeciwciał, jak i autofluorescencji w celu uzyskania optymalnego sygnału.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemia to technika wykrywania składników tkanek za pomocą przeciwciał przeciwko specyficznym cząsteczkom komórkowym i późniejszych technik barwienia do wykrywania sprzężonych przeciwciał1. Ta procedura immunohistochemiczna wymaga specyficznego utrwalenia i przetwarzania tkanek, które często są empirycznie określane dla określonego użytego antygenu, tkanki i przeciwciała2. Utrwalenie ma kluczowe znaczenie dla zachowania "pierwotnego" stanu tkanki, a tym samym utrzymania nienaruszonych struktur komórkowych i subkomórkowych oraz wzorców ekspresji. Konieczne jest dalsze przetwarzanie i zatapianie w celu przygotowania tkanki do podziału na cienkie plasterki, które są wykorzystywane do badań histologicznych obejmujących immunohistochemię.

Barwienie immunologiczne może być przeprowadzone zarówno za pomocą detekcji chromogennej, jak i fluorescencyjnej. Wykrywanie chromogenne wymaga użycia enzymu do przekształcenia rozpuszczalnego substratu w nierozpuszczalny kolorowy produkt. Chociaż enzym ten może być sprzężony z przeciwciałem rozpoznającym antygen (przeciwciało pierwszorzędowe), częściej jest sprzężony z przeciwciałem rozpoznającym przeciwciało pierwszorzędowe (tj. przeciwciało drugorzędowe). Ta technika jest bardzo czuła; Kolorowy produkt powstały w wyniku reakcji enzymatycznej jest fotostabilny i wymaga jedynie mikroskopu jasnego pola do obrazowania. Jednak chromogenne barwienie immunologiczne może nie być odpowiednie, gdy próbuje się uwidocznić dwa białka, które łączą się w sobie, ponieważ osadzanie się jednego koloru może maskować osadzanie się drugiego. W przypadku współbarwienia koenzymescencja okazała się korzystniejsza. Pojawienie się immunofluorescencji przypisuje się Albertowi Coonsowi i współpracownikom, którzy opracowali system do identyfikacji antygenów tkankowych z przeciwciałami oznaczonymi fluoresceiną i wizualizacji ich w wyciętych tkankach w świetle ultrafioletowym3. Detekcja fluorescencji opiera się na przeciwciałie sprzężonym z fluoroforem, który emituje światło po wzbudzeniu. Ponieważ istnieje kilka fluoroforów z emisjami na różnych długościach fal (bez nakładania się lub z niewielkim nakładaniem się), ta metoda wykrywania jest idealna do badań wielu białek.

Nadnercze to parzysty narząd znajdujący się nad nerką i charakteryzujący się dwoma embriologicznie odrębnymi komponentami otoczonymi mezenchymalną torebką. Zewnętrzna kora nadnerczy, wywodząca się z mezodermy pośredniej mezofryki, wydziela hormony steroidowe, podczas gdy rdzeń wewnętrzny, wywodzący się z grzebienia nerwowego, wytwarza katecholaminy, w tym adrenalinę, noradrenalinę i dopaminę. Kora nadnerczy jest histologicznie i funkcjonalnie podzielona na trzy koncentryczne strefy, z których każda wydziela różne klasy hormonów steroidowych: zewnętrzna strefa kłębuszka nerkowego (zG) wytwarza mineralokortykosteroidy, które regulują homeostazę elektrolitów i objętość wewnątrznaczyniową; środkowa zona fasciculata (zF), bezpośrednio pod zG, wydziela glikokortykosteroidy, które pośredniczą w odpowiedzi na stres poprzez mobilizację zapasów energii w celu zwiększenia stężenia glukozy w osoczu; oraz wewnętrzna strefa reticularis (zR), która syntetyzuje prekursory steroidów płciowych (tj. dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.

Pewne różnice w strefowaniu kory nadnerczy występują między gatunkami: na przykład Mus musculus nie ma zR. Unikalna poporodowa strefa X M. musculus jest pozostałością kory płodowej charakteryzującej się małymi komórkami ubogimi w lipidy z cytoplazmami acidofilnymi5. Strefa X znika w okresie dojrzewania u samców myszy i po pierwszej ciąży u samic myszy lub stopniowo ulega degeneracji u samic nierozmnażanych 6,7. Co więcej, krętość i grubość zG wykazuje wyraźną zmienność między gatunkami, podobnie jak organizacja obwodowych komórek macierzystych i progenitorowych w zG i w jego sąsiedztwie. Szczur, w przeciwieństwie do innych gryzoni, ma widoczną niezróżnicowaną strefę (zU) między zG i zF, która funkcjonuje jako strefa komórek macierzystych i/lub strefa przejściowych amplifikujących komórek progenitorowych. Nie wiadomo, czy zU jest unikalne dla szczurów, czy po prostu jest bardziej wyraźnie zorganizowanym skupiskiem komórek8,9.

Komórki kory nadnerczy zawierają kropelki lipidów, które przechowują estry cholesterolu, które służą jako prekursor wszystkich hormonów steroidowych10,11. Termin "steroidogeneza" określa proces produkcji hormonów steroidowych z cholesterolu poprzez szereg reakcji enzymatycznych, które obejmują aktywność czynnika steroidogennego 1 (SF1), którego ekspresja jest markerem potencjału steroidogennego. W nadnerczach ekspresja Sf1 występuje tylko w komórkach kory mózgowej12. Interesujące badanie wykazało ekspresję endogennej biotyny w komórkach kory nadnerczy o potencjale steroidogennym13. Chociaż może to być przyczyną wyższego tła w metodach barwienia opartych na biotynie/streptawidynie, ze względu na wykrywanie endogennej biotyny przez przeciwciało sprzężone ze streptawidyną, cecha ta może być również wykorzystana do odróżnienia komórek steroidogennych od innych populacji w obrębie nadnerczy, tj. komórek śródbłonka, torebki i rdzenia.

Unerwiony przez współczulne neurony przedzwojowe, rdzeń nadnerczy charakteryzuje się bazofilnymi komórkami z ziarnistą cytoplazmą zawierającą epinefrynę i noradrenalinę. Komórki rdzenia nazywane są "chromochłonnymi" ze względu na wysoką zawartość katecholamin, które po utlenieniu tworzą brązowy pigment14. Hydroksylaza tyrozyny (TH) jest enzymem, który katalizuje etap ograniczający szybkość syntezy katecholamin i w nadnerczu ulega ekspresji tylko w rdzeniu15.

Tutaj prezentujemy protokół izolacji nadnerczy myszy, ich przetwarzania w celu zatopienia w parafinie i sekcji, oraz metodę barwienia immunofluorescencyjnego na odcinkach nadnerczy w celu identyfikacji typów komórek tworzących korę nadnerczy i rdzeń. Protokół ten jest standardem w naszym laboratorium do barwienia immunologicznego wieloma przeciwciałami rutynowo stosowanymi w naszych badaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody zostały wykonane zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami pod auspicjami Uniwersyteckiego Komitetu ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Michigan.

1. Przygotowanie do operacji

  1. W dniu poprzedzającym zabieg należy przygotować 4% paraformaldehydu (PFA)/sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). W przypadku zamrożonych porcji należy przystąpić do rozmrożenia i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: 4% PFA nie jest stabilny przez więcej niż 48 godz.
    UWAGA: PFA jest toksyczny, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz wyrzucić do odpowiedniego pojemnika.
  2. W dniu zabiegu należy przygotować narzędzia chirurgiczne, sterylizując nożyczki i kleszcze 70% etanolem (EtOH) i pozostawić do wyschnięcia na ręczniku papierowym.
  3. Umieść 24-dołkową płytkę wypełnioną 1x PBS (wystarczy 1 ml / studzienkę) w wiaderku z lodem.
    UWAGA: Nadnercza będą przechowywane w tym wielodołkowym naczyniu hodowlanym po operacji.

2. Rozwarstwienie nadnerczy

  1. Poddaj mysz eutanazji zgodnie ze standardowymi protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC). Wymagana jest drugorzędna metoda eutanazji w celu zapewnienia śmierci (na przykład dekapitacja).
    1. W przypadku eutanazji przez przedawkowanie izofluranu umieść mysz w komorze wypełnionej oparami izofluranu do momentu ustania oddychania, a następnie wyjmij mysz z komory, połóż ją na powierzchni i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
      UWAGA: Większość metod eutanazji powoduje stres u zwierzęcia i nie nadaje się do badań nad stresem, ponieważ mogą one dodać zmienną zakłócającą aktywację osi przysadka-nadnercza i uwalnianie katecholaminy rdzeniowej. W tym przypadku dekapitacja jest sugerowaną techniką, którą należy zastosować.
  2. Połóż mysz na wznak, wysterylizuj obszar nacięcia na brzuchu i bokach 70% EtOH.
    UWAGA: Podczas gdy golenie futra zwiększy sterylność, w przypadku tego konkretnego zastosowania nie jest to konieczne.
  3. Przetnij skórę na środku brzucha za pomocą nożyczek, oddziel skórę od otrzewnej, deskin mysz, ściskając skórę wokół nacięcia i ciągnąc ją w dwóch przeciwnych kierunkach (ogonowym i rostralnym). Następnie przetnij otrzewną, aż dotrze do tylnego lewego i prawego boku.
  4. Usuń mysie nadnercza, przecinając otaczającą tkankę tłuszczową i umieść ją na 24-dołkowej płytce wypełnionej 1x PBS i przechowywanej na lodzie.

3. Usuwanie tłuszczu w okolicy nadnerczy

  1. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść nadnercze na szklanej podstawie lub szalce Petriego na płytce stolika, ustaw źródło światła, wybierz powiększenie i dostosuj ostrość, aby uzyskać wyraźny widok na całe nadnercze.
    UWAGA: Zastosowane powiększenie może się różnić w zależności od osobistych preferencji. Całkowite powiększenie 30X z soczewką planiczną 1X, zoomem 3X i okularem 10X pozwala na wizualizację całego gruczołu z dobrym polem widzenia.
  2. Szybko usuń sąsiednie tkanki tłuszczowe za pomocą dwóch igieł 25 G, unikając odwodnienia nadnerczy. Jeśli stanie się to przed usunięciem całego tłuszczu, przenieś nadnercza z powrotem do studzienki zawierającej 1x PBS na 1-2 minuty, a następnie kontynuuj proces usuwania tłuszczu.
  3. Prać 2x po 2 minuty w 1x PBS.

4. Przetwarzanie i osadzanie tkanek

  1. Utrwalić tkanki w 4% PFA/PBS w temperaturze 4 °C na platformie bujanej przez 2 godziny.
  2. Usuń 4% PFA i umyj chusteczki 1x PBS, 3x przez 15 minut każda w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i jest odpadem niebezpiecznym; Należy obchodzić się z nim ostrożnie pod kapturem chemicznym i wyrzucić do pojemnika na odpady niebezpieczne.
  3. Inkubować nadnercza w 50% EtOH w temperaturze 4 °C na platformie bujanej przez 2 godziny.
  4. Inkubować nadnercza w 70% EtOH w temperaturze 4 °C na platformie bujanej przez co najmniej 2 godziny
    UWAGA: Jeśli nie przystąpi się do przetwarzania tkanek w celu osadzenia, nadnercza mogą być przechowywane w 70% EtOH w temperaturze 4 °C. Unikanie długotrwałego przechowywania w 70% EtOH i przystąpienie do przetwarzania tkanek tak szybko, jak to możliwe, daje próbki lepszej jakości.
  5. Przygotuj nadnercze do przetwarzania tkanek, owijając je gazą i zamykając w kasecie do zatapiania tkanek. Umieść kasetę w słoiku wypełnionym 70% EtOH i przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do przeniesienia do procesora tkankowego. Włóż kasetę do procesora tkanek zaprogramowanego zgodnie z tabelą 1 i uruchom program.
  6. Przenieść kasetę do stacji zatapiania wypełnionej stopioną parafiną w temperaturze 65 °C. Jeśli stacja chłodząca nie jest dostępna, umieść obok niej zimną tacę chłodzącą.
  7. Oznacz formę do zatapiania i otwórz kasetę do zatapiania tkanek. Za pomocą kleszczy odwiń gazę i delikatnie umieść nadnercze w żądanej pozycji na środku podstawy w formie do zatapiania. Wlej stopioną parafinę na nadnercza. W razie potrzeby przytrzymaj nadnercze kleszczami, aby zabezpieczyć jego pozycję w formie, w przeciwnym razie może poruszać się wewnątrz formy.
  8. Delikatnie przenieś formę do zatapiania na tackę chłodzącą i poczekaj, aż parafina stwardnieje. Następnie, aby ułatwić sekcjonowanie, przechowuj formy do osadzania w chłodnym miejscu.

5. Cięcie za pomocą mikrotomu obrotowego

  1. Przed rozpoczęciem sprawdź, czy mikrotom jest czysty, zetrzyj wszystkie wyrzucone pozostałości parafiny, upewnij się, że nóż (lub ostrze) jest naostrzony, naoliwić mechanizm wewnętrzny i w razie potrzeby całkowicie schować uchwyt bloku.
  2. Oznaczyć serię szkiełek mikroskopowych (naładowanych dodatnio lub powlekanych w celu zapobieżenia utracie tkanek (patrz Tabela materiałów)), położyć je na szkiełku podstawowym ustawionym na temperaturę 37 °C i dozować trochę autoklawowanej ultraczystej wody typu 1 na wierzch każdego szkiełka.
  3. Ustawić grubość przekroju na 5 μm.
  4. Włóż ostrze mikrotomu do uchwytu ostrza, kontroluj kąt ostrza, upewnij się, że ostrze jest mocno zamocowane w uchwycie i sprawdź luz bloku parafinowego i uchwytu bloku.
  5. Ustaw uchwyt bloku w najwyższej pozycji i, jeśli to możliwe, zablokuj uchwyt roboczy, wyjmij blok parafinowy z formy i umieść go w uchwycie bloku, mocno zabezpieczając go zaciskiem. Kąt między linią środkową ostrza a czołową powierzchnią bloku powinien wynosić około 20°. W razie potrzeby wyreguluj blok parafinowy.
    UWAGA: Ostrze jest ostre.
  6. Jeśli jest wcześniej zablokowany, odblokuj pokrętło ręczne i opuść blok parafiny, aż jego powierzchnia zrówna się z krawędzią ostrza mikrotomu. Obracaj pokrętłem w stałym rytmie. Wykonaj wstępne przycinanie, aby usunąć parafinę i odsłonić nadnercza.
  7. Obracaj pokrętłem ręcznym i dziel aż do końca nadnerczy. Użyj mikroskopu jasnego pola lub mikroskopu preparacyjnego, aby sprawdzić obecność tkanki w skrawkach. Odłącz wstążkę od ostrza i za pomocą kolejnej pary kleszczy umieść ją na wodzie położonej na szkiełku samochodowym. Przydatne może być umieszczenie wstążki na powierzchni, ostrożne jej rozciągnięcie, a następnie zamontowanie na szkiełku.
  8. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na płycie grzejnej. Następnie połóż je płasko na wysuwanej tacy i piecz w temperaturze 37 °C przez noc lub dłużej, jeśli woda jest jeszcze dostępna. Po wyschnięciu przechowuj szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze pokojowej.
  9. Odłóż cały zużyty sprzęt i wyczyść mikrotom.

6. Immunofluorescencja

  1. Wybierz szkiełka do barwienia immunologicznego i umieść je w uchwycie na szkiełka.
  2. Na gorącym talerzu umieść zlewkę wypełnioną 0,01 M cytrynianem o pH 2,0 do wrzenia. Objętość bufora zależy od wielkości zlewki i musi być wystarczająca do przykrycia sekcji na szkiełkach podczas gotowania (należy wziąć pod uwagę pewne parowanie). Przykryj zlewkę folią aluminiową.
    UWAGA: Dostępne są inne metody pobierania antygenu (patrz Dyskusja).
  3. Odparafinować szkiełka w 100% ksylenie 2x po 5 min każda. Ponownie nawodnić szkiełka za pomocą następujących serii: 100% EtOH 2x przez 5 min, 70% EtOH 2x przez 5 min, woda ultraczysta typu 1 przez 5 min.
    UWAGA: Po odparafinowaniu ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia skrawków: skrawki tkanek należy zawsze przykryć lub roztworami do czasu zakończenia zabiegu lub uszkodzenia struktury tkanki.
  4. W celu pobrania antygenu umieścić szkiełka w metalowym uchwycie szkiełka i włożyć je do zlewki z wrzącym cytrynianem bez folii aluminiowej. Gotuj przez 10 minut.
  5. Wyjmij zlewkę z płyty grzejnej i pozwól jej ostygnąć przez 20 minut. Upewnij się, że nadnercza są nadal pokryte buforem.
  6. Przygotuj roztwór blokujący. W przypadku korzystania z dostępnego na rynku zestawu do barwienia stosowanego do uzyskania reprezentatywnych wyników (patrz Tabela materiałów), w probówce dodać 1,25 ml 1x PBS, 1 kroplę (równą około 45 μl) odczynnika blokującego Ig myszy i 5% normalnej surowicy koziej. Roztwór blokujący przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie podczas pracy.
    UWAGA: Użyta surowica zależy od gatunku gospodarza przeciwciała drugorzędowego. Tutaj zastosowano przeciwciała drugorzędowe wyhodowane u kóz. W przypadku innych przeciwciał konieczne może być stosowanie różnych stężeń w surowicy. Empirycznie określ prawidłowe stężenie w surowicy, testując kilka stężeń.
  7. Przełóż szkiełka do słoika Coplin zawierającego 1x PBS i umyj 3x 10 min każdy na bujaczku z delikatnym kołysaniem.
  8. Przygotuj nawilżoną komorę do barwienia.
  9. Delikatnie strząśnij PBS z jednego szkiełka; przetrzyj spód szkiełka niestrzępiącą się ściereczką, aby usunąć nadmiar PBS.
  10. Za pomocą specjalnego markera do szkiełek o właściwościach hydrofobowych narysuj okrąg otaczający każdy odcinek nadnerczy, upewniając się, że szklana powierzchnia jest sucha, aby uniknąć rozlania się roztworu tuszu na sekcję. W razie potrzeby ostrożnie wytrzyj powierzchnię do sucha. Umieść szkiełko w nawilżonej komorze.
  11. Szybko odpipetuj 50 μl (lub tyle, aby pokryć sekcje) roztworu blokującego na każdą sekcję. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wymagana objętość roztworu blokującego może się różnić; Ważne jest, aby sekcje były dobrze pokryte roztworem.
  12. Przygotuj roztwór rozcieńczalnika z dostępnego w handlu zestawu zawierającego 7,5 ml 1x PBS, 600 μl roztworu podstawowego koncentratu białkowego i 5% normalnej surowicy koziej (lub dowolnej innej surowicy i stężenia użytej w roztworze blokującym). Roztwór rozcieńczalnika przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie podczas pracy.
  13. Przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczając przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich stężeniach w roztworze rozcieńczalnika. W celu wspólnego barwienia dodaj porcję każdego przeciwciała do nowej probówki i delikatnie wymieszaj. Umieścić przeciwciała i roztwory przeciwciał na lodzie, aż będą gotowe do użycia.
    UWAGA: Tutaj zastosowaliśmy przeciwciało anty-SF1 wyhodowane u królika i przeciwciało anty-TH wyhodowane u myszy. Aby przygotować roztwory robocze przeciwciał, postępuj zgodnie z zaleceniami.
    1. W przypadku roztworu roboczego SF1 w jednej probówce dodać 1 μl przeciwciała anty-SF1 do 999 μl roztworu rozcieńczalnika (końcowe stężenie 1,5 μg/ml). W przypadku roztworu roboczego TH w probówce dodać 1 μl przeciwciała anty-TH do 499 μl roztworu rozcieńczalnika (szacowane stężenie końcowe 2 - 6 μg/ml).
    2. W przypadku mieszaniny roboczej przeciwciał SF1 + TH, w świeżej probówce, odpipetować 250 μl roztworu roboczego SF1 i 250 μl roztworu roboczego TH. Delikatnie wymieszać, pipetując. Przechowywać na lodzie.
  14. Przełóż szkiełka do słoika Coplin zawierającego 1x PBS i umyj 3x po 5 min na bujaczku z delikatnym kołysaniem.
  15. Umieścić szkiełka z powrotem w wilgotnej komorze po wytarciu nadmiaru PBS, odpipetować mieszaninę roboczą przeciwciał SF1 + TH (lub inny roztwór przeciwciał pierwotnych) na każdą sekcję, zamknąć nawilżoną komorę i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
  16. Następnego dnia przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 1x PBS i myj 3x przez 15 min na bujaczku z delikatnym kołysaniem.
  17. Podczas mycia szkiełek należy przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciał w roztworze rozcieńczalnika o odpowiednim stężeniu. W przypadku współbarwienia dodaj równą ilość każdego wtórnego roztworu przeciwciała do nowej probówki. Delikatnie wymieszać, pipetując. Przechowywać na lodzie. Chroń probówki przed światłem i przechowuj na lodzie do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
    UWAGA: W tym przypadku stosowane przeciwciała drugorzędowe to 488 nm znakowane barwnikiem fluorescencyjnym przeciwciała anty-myszowe hodowane u kóz i 549 znakowane barwnikiem fluorescencyjnym przeciwciała anty-królicze hodowane u kóz. Roztwór przeciwciała drugorzędowego przygotowano przez dodanie 0,5 μl każdego przeciwciała drugorzędowego do 799 μl roztworu rozcieńczalnika (końcowe stężenia 1,2 μg/ml).
  18. Umieść szkiełka z powrotem w nawilżonej komorze po usunięciu nadmiaru PBS, szybko odpipetuj wtórny roztwór przeciwciała na odcinki nadnerczy, zamknij nawilżoną komorę i chroń przed światłem. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  19. Umyj szkiełka w słoiku Coplin z 1x PBS i pierz 3x przez 15 min na bujaczku z delikatnym kołysaniem, upewniając się, że chronisz je przed światłem.
  20. Przygotować roztwór 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do barwienia jądrowego: 1 μl DAPI (20 mg/mL) w 1 ml 1x PBS.
    UWAGA: Niebiesko-fluorescencyjną przeciwplamę jądrową można również uzyskać za pomocą barwnika Hoechst.
  21. Pipetować roztwór DAPI na odcinki nadnerczy, przykryć światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 minut.
  22. Umyj szkiełka w słoiku Coplin z 1x PBS i pierz 3x przez 5 min na bujaku z delikatnym kołysaniem, jednocześnie chroniąc zjeżdżalnie przed światłem.
  23. W miejscu osłoniętym przed bezpośrednim światłem położyć szklankę nakrywkową i odpipetować 60 μl lub około 3 krople środka mocującego odpowiedniego do immunofluorescencji wzdłuż powierzchni szkła nakrywkowego.
  24. Delikatnie przetrzyj tylną część szkiełka niestrzępiącą się chusteczką, ustaw szkiełko stroną do dołu w kierunku szkła nakrywkowego i równolegle do niego, tak aby sekcje chusteczki były skierowane w stronę szkła nakrywkowego ze środkiem montażowym. Lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe i upewnij się, że między szkiełkiem a szkłem nakrywkowym nie utknęły pęcherzyki powietrza.
    1. W razie potrzeby należy zastosować dalsze naciski, aby usunąć pęcherzyki powietrza i nadmiar środka montażowego.
  25. Odłożyć szkiełko w ciemnym pojemniku i utwardzać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny (lub czas wskazany w karcie informacyjnej zastosowanego środka montażowego), a następnie przystąpić do obrazowania.

7. Obrazowanie

UWAGA: Mikroskop fluorescencyjny podłączony do kamery jest wymagany do wykrywania i przechwytywania fluorescencji emitowanej przez tkanki po wzbudzeniu na określonych długościach fal. Choć jest to oczywiste, należy pamiętać, aby wybrać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorochromami, których widma wzbudzenia i emisji są kompatybilne z dostępnym sprzętem. Ustawienia obrazowania różnią się w zależności od mikroskopu i oprogramowania używanego do robienia zdjęć. Istnieje kilka podstawowych zasad, które mają zastosowanie do obrazowania odcinków nadnerczy, takich jak upewnienie się, że czas ekspozycji, ustawienia wzmocnienia aparatu i intensywność źródła światła są utrzymywane na stałym poziomie.

  1. Włącz źródło światła i aparat, uruchom oprogramowanie do obrazowania zgodnie ze wskazówkami producenta.
    UWAGA: Kolejność tych czynności może się różnić w zależności od używanego sprzętu.
  2. Przymocuj szkiełko na stoliku, otwórz migawkę i patrząc w okulary mikroskopu użyj kanału barwienia jądrowego (DAPI) i małego powiększenia (4X), aby zidentyfikować tkankę na szkiełku: skrawki nadnerczy są małe, a ich wizualizacja może zająć trochę czasu.
  3. Zmień powiększenie na większe (10x), ustaw ostrość i zamknij migawkę.
    UWAGA: Ważne jest, aby unikać niepotrzebnie długiej ekspozycji w świetle, która może spowodować fotowybielanie, powodując utratę sygnału.
  4. Za pomocą poleceń oprogramowania wybierz obiektyw (10X) i używany kanał (DAPI), dostosuj czas ekspozycji (1 s, można regulować, jeśli sygnał jest zbyt silny lub słaby). Jeśli to możliwe, ustaw binning dla obrazowania na żywo (nie akwizycji) na "2 X 2", wzmocnienie konwersji na "średnie", prędkość odczytu na "20 MHz". Jeśli używane oprogramowanie nie wyświetla podziałki liniowej na końcu obrazowania, wybierz opcję podziałki liniowej z menu i umieść pasek w żądanym miejscu.
  5. Otwórz migawkę, w razie potrzeby ponownie wyreguluj ostrość i przełącz kanały (FITC, TRITC, DAPI). Jeśli mikroskop nie jest zautomatyzowany, zrób zdjęcie nadnerczy w każdym kanale bez przesuwania stolika i upewnij się, że dostosowałeś wybór używanego kanału. Zamknij migawkę po zakończeniu.
    UWAGA: Zapisz zastosowane ustawienia na wypadek, gdyby oprogramowanie nie zapisało ich automatycznie.
  6. Zapisz zdjęcia.
    UWAGA: Scalone obrazy można często tworzyć za pomocą oprogramowania mikroskopu lub innych pakietów oprogramowania do edycji grafiki.
  7. Powtórz obrazowanie dla innych obszarów przekroju i/lub z większym powiększeniem.
    UWAGA: Powiększenie 20x często wymaga krótszego czasu naświetlania (tj. 800 ms).
  8. Po zakończeniu obrazowania wyłącz wszystkie urządzenia w odpowiedniej kolejności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia schemat całego protokołu opisanego powyżej. Nadnercza są pobierane od myszy, sąsiednia tkanka tłuszczowa jest usuwana pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie nadnercza są mocowane w 4% PFA. Po tym etapie nadnercza są przetwarzane i zatapiane w parafinie, a następnie dzielone za pomocą mikrotomu w celu pokrojenia narządu na cienkie plasterki, które są umieszczane na szkiełkach mikroskopowych. Po wysuszeniu skrawków przeprowadzana jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę izolacji nadnerczy myszy wraz z przygotowaniem i barwieniem pociętych nadnerczy myszy zatopionych w parafinie.

W porównaniu z innymi testowanymi przez nas protokołami, ten protokół immunofluorescencji okazał się odpowiedni dla większości przeciwciał stosowanych w naszym laboratorium. Jednak w niektórych przypadkach może to wymagać pewnych korekt w celu poprawy wyników barwienia. Jedną ze zmiennych, którą można łatwo modyfikować i testować, jest długość utrwalenia. W...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Mohamadowi Zubairowi za pomocne sugestie i pomoc techniczną w ustanowieniu tego protokołu. Praca ta była wspierana przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health Research Grant 2R01-DK062027 (do G.D.H).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejNest Biotechnology Co.0412B
Igły jednorazowe 25 G x 5/8"Exel International26403
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich P6148
Paraplast plus McCormik 39502004 naukowyParafina do zatapiania tkanek
Kasety do biopsji Shandon II z dołączoną pokrywkąThermo scientific1001097Kasety do przetwarzania tkanek
Wysokoprofilowe ostrza mikrotomuAccu-Edge4685Jednorazowe ostrza ze stali nierdzewnej
Jednorazowe formy do zatapiania tkanek z tworzywa sztucznegoPolysciences Inc.18986Ścięte, 22 mm kwadratowe górne zwężające się do 12 mm dolnych
Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusFisherbrand12-550-1575 mm x 25 mm x 1 mm
XyleneFisher ChemicalX5P1GAL 
200-procentowy etanolDecon Labs, Inc.
Podkładki z gazy Certi-Pad Certyfikowane bezpieczeństwo Mfg, Inc231-2103" x 3. Sterylne gaziki bez lateksu
zestaw M.O.M Laboratoria wektoroweBMK-2202Do wykrywania mysich przeciwciał pierwszorzędowych na tkance myszy
KimWipes Kimtech34155Chusteczki 4,4 cala x 8,4 cala
Super PAP PENInvitrogen 00-8899Pióro do rysowania na szkiełkach
Szkło nakrywkowe mikroskopu Fisherbrand12-544-DRozmiar: 22 x 50 x 1,5
DAPISigmaD9542 (Przygotowane w bulionie 20 mg/ml)
Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong GoldSondy molekularneP36930Środek montażowy do immunofluorescencji
X-cite seria 120QLumen DynamicsŹródło światła
Coolsnap MyoPhotometrics
Camera Optiphot-2 Mikroskop Nikon
Mikrotom Amerykański Optical
Tissue EmbedderLeicaEG1150 H 
Procesor tkankowy LeicaASP300S
Normalna surowica koziaSigmaG9023
Mysie przeciwciało pierwotne anty-THMilliporeMAB318
Królicze przeciwciało anty-SF1Ab proteintech group (PTGlabs)  wykonane na zamówienieprzeciwciało pierwotne
Alexa-488 Mysz IgG  hodowana kozaJackson ImmunoResearch115-545-003 Przeciwciało drugorzędowe
Dylight-549 Królik IgG hodowana kozaJackson ImmunoResearch111-505-003Przeciwciało drugorzędowe
Kwas cytrynianowy bezwodnyFisher ChemicalA940-500
NIS-Elements Badania podstawowe Oprogramowanie firmy Nikondo obrazowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  4. Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
  5. Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
  6. Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53(1948).
  7. Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
  8. Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
  9. Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27(2015).
  10. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
  11. Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
  12. Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
  13. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  14. Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
  15. Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
  16. Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
  17. Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
  18. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  19. Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
  20. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28(2017).
  21. Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207(2011).
  22. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  23. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja nadnerczybarwienie immunofluorescencyjneutrwalanie tkanekzatapianie w parafinieods anianie antygen winkubacja z przeciwcia em pierwszorz dowymznakowanie przeciwcia em drugorz dowymbarwienie j der DAPInak adanie medium monta owegomikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły