Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla bakterii magnetotaktycznych z rodzaju Magnetospirillum: szczepy MSR-1, AMB-1 i MS-1

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58536

⸱

17 października 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physics & Astronomy, McMaster University, 2School of Life Sciences, University of Nevada Las Vegas

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy procedurę uprawy kilku szczepów Magnetospirillum w dwóch różnych typach pożywek wzrostowych. Szczep Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 jest uprawiany zarówno w pożywkach półstałych w postaci płynnej, jak i gradientu stężeniaO2, podczas gdy szczep M. magneticum AMB-1 i szczep M. magnetotacticum MS-1 są uprawiane w płynnym podłożu.

Streszczenie

Bakterie magnetotaktyczne to Gram-ujemne, ruchliwe, głównie wodne prokariota, wszechobecne w siedliskach słodkowodnych i morskich. Charakteryzują się zdolnością do biomineralizacji magnetosomów, które są magnetycznymi kryształami magnetytu (Fe3O4) lub greigitu (Fe3S4) otoczonymi dwuwarstwową błoną lipidową w ich cytoplazmie. W przypadku większości znanych bakterii magnetotaktycznych magnetosomy są gromadzone w łańcuchy wewnątrz cytoplazmy, nadając w ten sposób komórkom stały magnetyczny moment dipolowy i powodując ich pasywne wyrównanie z zewnętrznymi polami magnetycznymi. Ze względu na te specyficzne cechy, bakterie magnetotaktyczne mają ogromny potencjał do zastosowań komercyjnych i medycznych. Jednak większość gatunków jest mikroaerofilna i ma specyficzne wymagania dotyczące stężeniaO2, co sprawia, że są trudniejsze do rutynowego wzrostu niż wiele innych bakterii, takich jak Escherichia coli. Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły hodowli trzech najszerzej badanych szczepów bakterii magnetotaktycznych, z których wszystkie należą do rodzaju Magnetospirillum. Metody te pozwalają na precyzyjną kontrolę stężeniaO2 udostępnianego bakteriom, w celu zapewnienia ich prawidłowego wzrostu i syntezy magnetosomów. Hodowla bakterii magnetotaktycznych do dalszych badań z wykorzystaniem tych procedur nie wymaga od eksperymentatora bycia ekspertem w dziedzinie mikrobiologii. Ogólne metody przedstawione w tym artykule mogą być również stosowane do izolowania i hodowli innych bakterii magnetotaktycznych, chociaż prawdopodobne jest, że skład chemiczny pożywki wzrostowej będzie musiał zostać zmodyfikowany.

Wprowadzenie

Bakterie magnetotaktyczne (MTB) reprezentują szeroki zakres Gram-ujemnych prokariontów wszechobecnych w słodkowodnych i morskich siedliskach wodnych1. Bakterie te mają zdolność do wytwarzania kryształów magnetycznych wykonanych z magnetytu (Fe3O4) lub greigitu (Fe3S4), które w większości przypadków są składane w łańcuchy wewnątrz komórek. Ten szczególny motyw strukturalny wynika z obecności kilku specyficznych białek działających zarówno w cytoplazmie bakterii, jak i na błonie lipidowej otaczającej każdy kryształ2. Każdy pojedynczy kryształ i otaczający go pęcherzyk błonowy nazywany jest magnetosomem i ma wielkość od około 30 do 50 nm u gatunków Magnetospirillum3. Ze względu na układ łańcuchowy magnetosomów, bakterie te posiadają stały magnetyczny moment dipolowy, który sprawia, że pasywnie dostosowują się do zewnętrznie przyłożonych pól magnetycznych. Dlatego bakterie te aktywnie pływają wzdłuż linii pola magnetycznego, działając jak samonapędzające się mikrokompasy, przypuszczalnie w celu skuteczniejszego lokalizowania najkorzystniejszych warunków (np. stężeniaO2) do wzrostu.

Interesującą właściwością MTB jest ich zdolność do regulowania zarówno chemii, jak i krystalografii kryształów magnetosomów. Większość szczepów wytwarza kryształy magnetytu lub greigitu o stosunkowo wysokiej czystości, chociaż niektóre biomineralizują oba minerały4. We wszystkich przypadkach bakterie są w stanie precyzyjnie kontrolować rozmiar i kształt swoich pojedynczych kryształów domeny magnetycznej. To wyjaśnia, dlaczego podejmuje się wiele badań, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób MTB przeprowadza ten proces biomineralizacji. Zrozumienie tego procesu może pozwolić naukowcom na stworzenie nanokryształów magnetycznych do wielu zastosowań komercyjnych i medycznych.

Istotną przeszkodą dla szeroko zakrojonych badań nad MTB była trudność w ich hodowli w laboratorium. Większość gatunków, w tym szczepy użyte w tej pracy, jest obowiązkowo mikroaerofilna, gdy jest uprawiana zO2 jako końcowym akceptorem elektronów. To wyjaśnia, dlaczego bakterie te najczęściej znajdują się w strefie przejściowej między warunkami tlenkowymi i beztlenowymi (interfejs tlenowo-beztlenowy, OAI). To wyraźnie pokazuje, że MTB mają dokładne wymagania dotyczące stężeniaO2, które oczywiście muszą być brane pod uwagę przy opracowywaniu pożywek wzrostowych dla tych organizmów. Co więcej, duża istniejąca różnorodność MTB oznacza, że różne szczepy będą potrzebowały różnych rodzajów gradientów chemicznych i składników odżywczych, aby osiągnąć optymalny wzrost.

W tej pracy opisujemy metody hodowli trzech najczęściej badanych MTB: Magnetospirillum magneticum (szczep AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) i M. gryphiswaldense (MSR-1). Gatunki te filogenetycznie należą do klasy Alphaproteobacteria w gromadzie Proteobacteria, są spiralne w morfologii i posiadają polarną wić na każdym końcu komórki. Udostępniamy protokoły uprawy szczepu MSR-1 zarówno w pożywkach półstałych o gradiencie stężeń cieczy, jak i O2, w oparciu o wcześniej opublikowane receptury pożywki5,6. Przedstawiamy również szczegółowy protokół uprawy szczepów AMB-1 i MS-1 w zmodyfikowanym pożywce Magnetic Spirillum Growth Medium (MGSM)7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Instalacja stacji N2

UWAGA: Wybierz wewnętrzną średnicę rurki tak, aby można ją było podłączyć do zbiornika gazu z minimalnym wyciekiem i aby butla plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml ściśle przylegała do tego wężyka. Ilustracja kompletnej stacji gazowania N2 znajduje się w Rysunek 1.

  1. Bezpiecznie zainstaluj zbiornik gazu N2 w pobliżu ławki, na której jest wystarczająco dużo miejsca, aby ustawić stację N2 (długość około 50 cm).
  2. Podłącz do zbiornika kawałek rurki wystarczająco długiej, aby dotrzeć do obszaru, w którym zostanie zbudowana stacja. W razie potrzeby nałóż taśmę teflonową na wyjściu ze zbiornika, aby uniknąć wycieków.
  3. Aby zbudować stację zdolną do bulgotania pięciu butelek podłoża w tym samym czasie, wytnij cztery kawałki rurki o długości około 5 cm.
  4. Zmontuj kawałki rurki w linii z trzema trójdrożnymi plastikowymi łącznikami w kształcie litery T. Podłącz jeden koniec tej linii do kawałka rurki na wyjściu zbiornika N2 przez dodatkową złączkę w kształcie litery T. Dodaj kolanko 90° na drugim końcu.
  5. Za pomocą taśmy przymocuj konstrukcję do poziomego metalowego pręta umieszczonego około 30 cm nad ławką.
  6. Podłącz pięć odcinków przewodów (o długości około 20 cm) do wolnych wyjść złączek zainstalowanych w kroku 1.4.
  7. Usunąć tłoki z pięciu plastikowych strzykawek o pojemności 1,0 ml i odciąć większy koniec tych strzykawek (tj. przeciwną stronę do igły), zachowując tylko część z podziałką. Napełnij te strzykawki bawełną, nie za mocno.
  8. Włożyć strzykawki do pionowych odcinków rurki o długości 20 cm i użyć wody z mydłem, aby upewnić się, że nie ma wycieków, gdy przepływaN2.
  9. Zdejmij nasadki z pięciu igieł 25 G (0,5 mm x 25 mm) i włóż te igły do 10-centymetrowych kawałków cienkiej rurki. Upewnij się, że igły ściśle przylegają do rurki.
    UWAGA: Na tym etapie istnieje ryzyko dźgnięcia nożem. Rób to powoli i ostrożnie.
  10. Podłączyć igły przygotowane w kroku 1.9 do strzykawek stacjiN2. Upewnij się, że N2 przepływa przez wszystkie pięć linii i utrzymuj stację w trybie czuwania.

2. Przygotowanie podłoża wzrostowego

UWAGA: Możliwe jest dostosowanie ilości przygotowanego podłoża, jak wyjaśniono w krokach 2.1.2, 2.2.2 i 2.3.8. Ilość używanej wody i chemikaliów musi być tylko proporcjonalnie dostosowana. Rola wszystkich składników pożywki została opisana w tabeli uzupełniającej 1.

  1. Przygotowanie płynnej pożywki wzrostowej dla MSR-1
    1. Przygotuj 10 mM roztworu cytrynianu żelaza, dodając 0,245 g cytrynianu żelaza do 100 ml destylowanej wody dejonizowanej. Podgrzej i mieszaj do rozpuszczenia, aż do uzyskania klarownego roztworu o barwie od żółtej do pomarańczowej. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu standardowym (co najmniej 15 minut ekspozycji w temperaturze 121 °C), a następnie przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Wyrzuć roztwór cytrynianu żelaza, gdy osad stanie się oczywisty.
    2. Do zlewki zawierającej 1 l destylowanej wody dejonizowanej dodać kolejno, mieszając: 1,0 ml roztworu suplementu pierwiastków śladowych, 0,1 g KH2PO4, 0,15 g MgSO4,7 H2O, 2,38 g HEPES, 0,34 g NaNO3, 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 3,0 g peptonu sojowego, 4,35 ml mleczanu potasu (60% m/w roztworu) i 5 ml 10 ml roztworu podstawowego cytrynianu Fe(III).
      UWAGA: Dostosuj ilości proporcjonalnie, jeśli potrzebna jest mniejsza ilość podłoża wzrostowego. W przypadku stacji N2 zdolnej do bulgotania pięciu butelek w tym samym czasie, takiej jak ta wbudowana w Krok 1 niniejszego protokołu, należy przygotować 300 ml pożywki.
      UWAGA: Roztwory podstawowe minerałów śladowych i cytrynianu Fe(III) muszą być utrzymywane w sterylności. Aby uniknąć zanieczyszczenia, podczas ich używania należy stosować standardową technikę sterylną (otwierać pal nakrętki butelek za pomocą palnika Bunsena) i używać sterylnych końcówek pipet do dozowania. Roztwór mineralny przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
    3. Po dodaniu wszystkich substancji chemicznych dostosować pH do 7,0 za pomocą 1 M roztworu NaOH. Dozuj świeżo przygotowane podłoże do butelek z surowicą o pojemności 125 ml. Wlej 60 ml pożywki do każdej butelki.
    4. Wprowadzić bąbelki N2 do pożywki na 30 minut, aby usunąć rozpuszczonyO2, używając małego rurki podłączonej do stacji N2 opisanej w kroku 1. Umieść korek z kauczuku butylowego na górze każdej butelki, pozostawiając mały otwór, aby nadmiar gazu mógł wydostać się z butelki.
      UWAGA: Podczas bulgotania z N2 może tworzyć się piana. Dostosuj odpowiednio przepływ gazu, aby uniknąć wytwarzania piany.
    5. Zaciśnij każdą butelkę za pomocą przygotowanego korka i aluminiowej uszczelki. Aluminiowa uszczelka zapewnia, że butelka pozostaje szczelnie zamknięta przez pozostałą część protokołu.
    6. Odłącz igły i cienkie rurki od stacji N2 i zastąp je czystymi igłami (1 cal, ≤ 23G). Wyreguluj zawory zbiornika N2 tak, aby ze zbiornika wychodził delikatny, ciągły przepływ gazu (około 50 ml/min).
      Uwaga: Igły większe niż 23G mogą pozostawić trwałe, niemożliwe do uszczelnienia w korku.
    7. Włożyć jedną z igieł podłączonych do zbiornikaN2 do butelki z podłożem przez gumowy korek. Natychmiast włożyć kolejną czystą igłę do tej samej butelki. Powtórz ten krok dla pozostałych butelek i pozwól N2 płynąć przez około 30 minut, aby zastąpić powietrze w butelkach przez N2.
    8. Odłączyć jedną butelkę od stacjiN2, wyjmując odpowiednią igłę. Odczekać kilka sekund, aż ciśnienie w butelce z podłożem spadnie do ciśnienia atmosferycznego i wyjmij drugą igłę. Powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych butelek.
      UWAGA: Aby zapobiec ponownemu przedostaniu sięO2 do butelek z podłożem wzrostowym po kroku 2.1.4, wykonaj kroki 2.1.4 - 2.1.8 w krótkich odstępach czasu. Jeśli nie można podłączyć wszystkich butelek do stacji N2 w tym samym czasie, należy wykonać kroki 2.1.4-2.1.8 dla pierwszego zestawu butelek, a następnie powtórzyć te kroki dla pozostałych butelek.
    9. Autoklaw butelek. Pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej przez noc, a następnie przechowuj je w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotowanie płynnej pożywki wzrostowej dla AMB-1 i MS-1
    1. Przygotować 10 mM roztwór chinianu żelaza. Najpierw rozpuścić 0,19 g kwasu chinowego w 100 ml destylowanej wody dejonizowanej, następnie dodać 0,27 g FeCl3,6H 2O. Mieszać do rozpuszczenia, aż do uzyskania ciemnoczerwonego, klarownego roztworu. Roztwór należy sterylizować w autoklawie, stosując standardowy cykl (co najmniej 15 minut ekspozycji w temperaturze 121 °C).
      UWAGA: Roztwór chinianu żelaza należy przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności jako sterylny roztwór podstawowy. Wyrzuć roztwór, gdy osad stanie się oczywisty.
    2. Do zlewki zawierającej 1 l destylowanej wody dejonizowanej dodać kolejno, mieszając: 10,0 ml roztworu suplementu witaminowego, 5,0 ml roztworu suplementu minerałów śladowych, 0,68 g KH2PO4, 0,848 g bursztynianu sodu dwuzasadowego sześciowodnego, 0,575 g dwuwodnego winianu di-sodu, 0,083 g trójwodnego octanu sodu, 0,45 ml 0,1% wodnej rezazuryny, 0,17 g NaNO3, 0,04 g kwasu askorbinowego i 3,0 ml 10 mM roztworu podstawowego chinianu Fe(III).
      UWAGA: Dostosuj ilości proporcjonalnie, jeśli potrzebna jest mniejsza ilość podłoża wzrostowego. W przypadku stacji N2 zdolnej do bulgotania pięciu butelek w tym samym czasie, takiej jak ta wbudowana w Krok 1 niniejszego protokołu, należy przygotować 300 ml pożywki.
      UWAGA: Roztwory podstawowe witamin, minerałów śladowych i chinianu Fe(III) muszą być utrzymywane w sterylnej charakterystyce. Aby uniknąć zanieczyszczenia, podczas dozowania należy używać standardowej sterylnej techniki i sterylnych końcówek pipet. Roztwory mineralne i witaminowe przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
    3. Po dodaniu wszystkich substancji chemicznych dostosować pH do 6,75 za pomocą 1 M roztworu NaOH.
    4. Zapoznaj się z krokami 2.1.3-2.1.9, aby zapoznać się z pozostałą częścią protokołu.
  3. Przygotowanie półstałej pożywki wzrostowej dla MSR-1
    1. Przygotować 0,5 M buforowy roztwór fosforanowy o pH 7,0, rozpuszczając 3,362 gK2HPO4 i 4,178 g KH2PO4 w 100 ml destylowanej wody dejonizowanej. Sprawdź, czy pH wynosi 7,0 i w razie potrzeby nieznacznie dostosuj pH za pomocą KH,2, PO, 4 lub NaOH. Roztwór należy przechowywać w szczelnie zamkniętej szklanej butelce (lepiej niż plastikowej, aby uniknąć wymiany tlenu).
    2. Przygotować 100 ml 0,02 M roztworu solnego. Dodać 0,2 g FeCl 2,4H2 O do tegoroztworu i mieszać do rozpuszczenia w celu otrzymania 10 mM roztworu chlorku żelaza. Roztwór należy przechowywać w ciemności w szczelnie zamkniętej szklanej butelce.
    3. Przygotować 0,8 M roztwór wodorowęglanu sodu, rozpuszczając 6,72 gNaHCO3 w 100 ml destylowanej wody dejonizowanej. Roztwór należy przechowywać w szczelnie zamkniętej szklanej butelce.
    4. Roztwory przygotowane w krokach 2.2.1-2.2.3 należy sterylizować w autoklawie, stosując standardowy cykl (co najmniej 15 minut ekspozycji w temperaturze 121 °C). Przechowywać je w postaci sterylnych roztworów podstawowych w ciemności.
    5. W zlewce zawierającej 1 l destylowanej wody dejonizowanej dodać kolejno, mieszając: 5 ml śladowego roztworu suplementu mineralnego, 0,2 ml 1% wodnego roztworu resazuryny, 0,4 g NaCl, 0,3 g NH4Cl, 0,1 g MgSO 4,7H2O, 0,05 g CaCl 2,2H 2O, 1 g bursztynianu sodu, 0,5 g octanu sodu, 0,2 g ekstraktu drożdżowego i 1,6 g agaru.
    6. Przykryj zlewkę folią aluminiową i wlej do autoklawu roztwór przygotowany w kroku 2.3.5.
    7. Tuż przed zakończeniem cyklu autoklawu należy przygotować świeży 4% roztwór L-cysteiny·HCl·H·H2O, rozpuszczając 0,8 g L-cysteiny·HCl·H2O w 20 ml destylowanej wody dejonizowanej. Zneutralizować roztwór do pH 7,0 za pomocą 5 M roztworu NaOH.
      UWAGA: ważne jest, aby roztwór cysteiny był przygotowany na świeżo, aby uniknąć utleniania cysteiny. Roztwór mineralny przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
    8. Po sterylizacji w autoklawie pozostawić podłoże do ostygnięcia do temperatury 50–60 °C i umieścić zlewkę pod płomieniem palnika Bunsena. Usuń folię aluminiową i szybko dodaj kolejno, delikatnie mieszając: 0,5 ml roztworu witaminy, 2,8 ml sterylnego roztworu buforowego fosforanu, 3 ml sterylnego roztworu podstawowego chlorku żelaza, 1,8 ml sterylnego roztworu podstawowego wodorowęglanu sodu i 10 ml sterylizowanego przez filtr roztworu cysteiny.
      UWAGA: Dostosuj ilości proporcjonalnie, jeśli potrzebna jest mniejsza ilość podłoża wzrostowego. Zwykle wygodnie jest przygotować partię 120 ml pożywki.
      UWAGA: Wszystkie roztwory muszą pozostać sterylne do wykorzystania w przyszłości. Wykonaj krok 2.3.8 przy użyciu standardowej techniki sterylnej i sterylnych końcówek pipet podczas dozowania.
    9. Po dodaniu wszystkich chemikaliów przenieś ciepłe podłoże do sterylnych probówek Hungate o pojemności 16 ml. Przenieść 12 ml pożywki do każdej probówki i zamknąć probówki.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, wykonaj krok 2.3.9 pod płomieniem palnika Bunsena. Wykonać tę czynność przed zestaleniem się agaru, gdy podłoże ma temperaturę 40 °C lub wyższą.
    10. Pozostaw probówki w spokoju przez kilka godzin, aż agar zestali się, a OAI stanie się widoczny, materializując się jako różowy do bezbarwnego interfejsu, około 1 do 3 cm poniżej powierzchni podłoża.
      UWAGA: Pożywka powinna powoli stawać się bezbarwna w probówce. Ilość czasu potrzebna do tego przejścia jest zmienna i zależy od ilościO2 początkowo rozpuszczonego w pożywce.

3. Inokulacja MTB

UWAGA: Kultury szczepów AMB-1, MS-1 i MSR-1 można uzyskać komercyjnie (Tabela materiałów).

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w sterylnych warunkach, pod płomieniem palnika Bunsena.

  1. Inokulacja szczepów MSR-1, AMB-1 i MS-1 w płynnym pożywce
    1. Zamknij pustą butelkę serum o pojemności 125 ml korkiem z kauczuku butylowego i aluminiową uszczelką zaciskaną. Wprowadzić dwie igły do butelki przez korek i podłączyć strzykawkę przygotowaną w sposób opisany w kroku 1.7 do jednej z nich. Podłączyć strzykawkę do butli o średnicyO2 za pomocą tego samego typu rurki, co rurka używana w stacjiN2.
    2. PozwólO2 przepływać przez butelkę przez około 30 minut, aby upewnić się, że całe powietrze w butelce zostało zastąpione przezO2. Usuń obie igły, pozwalając na lekkie nadciśnienie w butelce, a następnie w autoklawie. Przed użyciem pozostaw butelkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, wykonaj kroki 3.1.1 i 3.1.2 podczas przygotowywania pożywki i autoklawuj butelkę wraz z pożywką lub roztworami podstawowymi.
    3. Wysterylizuj górne części korków zarówno butelki ze świeżą pożywką, jak i butelkiO2, nakładając na nie kilka kropelek 70% roztworu etanolu i przepuszczając je przez płomień palnika Bunsena.
    4. Za pomocą sterylnej strzykawki i igły pobrać 1 mlO2 z butelkiO2 i przenieść do butelki ze świeżą pożywką. Na tym etapie należy upewnić się, że igła ściśle przylega do strzykawki, aby uniknąć przedostania się powietrza do strzykawki.
    5. W przypadku użycia inokulum z innej kultury wyhodowanej w szklanej butelce, wysterylizuj korki zarówno butelki ze świeżą pożywką, jak i starszej butelki hodowlanej, nakładając na nie kilka kropelek 70% roztworu etanolu i przepuszczając je przez płomień palnika Bunsena. Jeśli używasz inokulum z probówki z zamrożoną kulturą, po prostu pozwól mu rozgrzać się do temperatury pokojowej z probówką zamkniętą pod płomieniem palnika Bunsena.
    6. W przypadku stosowania inokulum z innej kultury wyhodowanej w szklanej butelce, należy zaszczepić 1 ml starszej kultury w świeżej pożywce. W przypadku stosowania inokulatu z zamrożonego wywaru, należy zaszczepić tylko 0,1 ml w celu rozcieńczenia glicerolu lub dimetylosulfotlenku (DMSO) stosowanego w procesie zamrażania. W obu przypadkach należy użyć sterylnej igły i sterylnej strzykawki.
    7. Inkubować kulturę w temperaturze 32 °C i po 4-7 dniach zaszczepić ją w świeżej pożywce.
  2. Inokulacja MSR-1 w półstałym podłożu o gradiencieO2
    1. Sprawdź, czy tubka ze świeżym podłożem wykazuje dobrze zdefiniowany OAI, zmaterializowany przez różowy do bezbarwnego interfejs.
    2. Jeśli inokulum pochodzi z innej półstałej kultury o gradiencie stężeńO2, należy zebrać bakterie, pipetując 50 μl kultury za pomocą sterylnej końcówki pipety umieszczonej na opasce utworzonej przez bakterie. Powoli zaszczepiaj te bakterie w OAI w świeżej pożywce (różowy/bezbarwny interfejs), unikając zakłócania interfejsu. Jeśli inokulum pochodzi z zamrożonej hodowli, należy postępować w ten sam sposób ze 100 μl inokulum.
    3. Zamknąć probówkę i pozwolić bakteriom rozwijać się w temperaturze od 25 °C do 30 °C. Przenieść do świeżej pożywki, stosując tę samą procedurę, zanim pasmo bakterii dotrze do powierzchni pożywki.

4. Obserwacja bakterii

  1. Wysterylizuj korek butelki hodowlanej, nakładając na nią 70% roztwór etanolu i przepuszczając go przez płomień palnika Bunsena. W przypadku podłoża półstałego otwórz rurkę pod płomieniem palnika Bunsena. Użyj sterylnej igły i sterylnej strzykawki, aby usunąć bakterie.
  2. Użyj metody wiszącego kropli8, aby upewnić się, że bakterie są zarówno magnetyczne, jak i ruchliwe.
    UWAGA: Mikroskopia z kontrastem fazowym daje świetne wyniki, ale nie jest obowiązkowa. Odpowiednie są powiększenia od 10X do 60X.
  3. Użyj transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), aby szczegółowo obserwować strukturę komórki i magnetosomy8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowe przygotowanie pożywek można ocenić w następujący sposób. Na koniec procesu powinny powstać przejrzyste roztwory (t.j. wolne od jakichkolwiek osadów) (dotyczy to zarówno pożywek płynnych, jak i półstałej pożywki z gradientem O2). Zdjęcie przedstawiające oczekiwany wygląd płynnej pożywki MSR-1 przed inokulacją znajduje się na Rysunku 2a. Poprawnie przygotowaną półstałą pożywkę z gradientem stężeń O2 rozpoznaje się po po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Specyficzne wymagania dotyczące stężeniaO2 MTB sprawiają, że ich uprawa w laboratorium jest nietrywialna. Kluczowym etapem protokołu dla pożywki ciekłej jest wstępne usunięcie całegoO2 z pożywki w celu kontrolowania końcowego stężenia poprzez dodanie określonej objętościO2 tuż przed inokulacją. Wykazano, że MSR-1 rośnie w prawie całkowicie tlenowych warunkach, jednak magnetyzm komórek jest drastycznie zmniejszony. Wyniki tego samego badania wykazały, że szczepy AMB-1 i MS-1 nie rosną w wa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Richardowi B. Frankelowi za pomoc w tworzeniu kultur MTB, Adamowi P. Hitchcockowi i Xiaohui Zhu za wsparcie podczas tworzenia kultur MTB na Uniwersytecie McMaster, oraz Marci Reid za szkolenie i dostęp do urządzenia do mikroskopii elektronowej (McMaster University, Wydział Nauk o Zdrowiu). Prace te były wspierane przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) oraz amerykańską Narodową Fundację Nauki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AMB-1Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)ATCC 700264
MS-1ATCCATCC 31632 
MSR-1Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)DSM 6361
Cytrynian żelazaSigma-AldrichF3388-250G
Suplement minerałów śladowychATCCMD-TMS
KH2PO4EMDPX1565-1
MgSO4.7 H2OEMDMX0070-1
HEPESBioShop Canada IncHEP001.250
NaNO3Sigma-AldrichS5506-250G
Ekstrakt drożdżowyFischer scientificDF210929
PeptonFischer scientificDF0436-17-5
Roztwór L-mleczanu potasu (60%)Sigma-Aldrich60389-250ML-F
KWAS D-(-)-CHINOWYSigma-Aldrich138622
FeCl3.6H2OFischer scientificI88-100
Suplement witaminowyATCCMD-VS
Bursztynian sodu sześciowodnyFischer scientificS413-500
L-winian sodu dwuwodny dwuzasadowySigma-Aldrich228729-100G
Trójwodny octan soduEMDSX0255-1
ResazurinDifco0704-13
Kwas askorbinowySigma-AldrichA4544-25G
K2HPO4Caledon6620-1-65
FeCl2 .4H2OSigma-Aldrich44939-250G
Wodorowęglan soduEMDSX0320-1
NaClCaledon7560-1
NH4ClEMD1011450500
CaCl2.2 H2OEMD1023820500
Agar ABio Basic Canada IncFB0010
L-cysteina.HCl.H2OSigma-AldrichC7880-100G
Strzykawki 1,0 mlFischer scientificB309659
25G  x 1 igłyBD305125
125 ml butelki z surowicąWheaton223748
20 mm aluminiowe uszczelkiWheaton224223-01
20mm E-ZWheatonW225303
Bellco Glass, Inc.2048-11800
Rurki HungateChemglass (VWR)CLS-4208-01
Korek przegrody, 13mm, HungateBellco Glass, Inc.2047-11600
Rurki do hodowli szkłaCorning (VWR)9826-16X
Kwas solny 36,5-38%, BioodczynnikSigma-AldrichH1758-100ML11,6 - 12 N
Zatyczki z gumy butylowej

Bibliografia

  1. Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
  2. Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621(2016).
  3. Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
  4. Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
  5. Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
  6. Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
  7. Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
  8. Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  9. Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344(2013).
  10. Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
  11. Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
  12. Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064(2013).
  13. Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203(2016).
  14. Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
  15. Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110(2006).
  16. Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
  17. Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
  18. Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193(2014).
  19. Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
  20. Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440(2012).
  21. Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
  22. Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protokół kontroli poziomu tlenukonfiguracja stacji azotowejprzygotowanie pożywki wzrostowejinokulacja pożywki półstałejtest wiszącej kroplitworzenie magnetosomównawigacja magnetycznahodowla mikroaerofilna
Hodowla bakterii magnetotaktycznych z rodzaju Magnetospirillum: szczepy MSR-1, AMB-1 i MS-1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.