Artykuł metodologiczny

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58537

⸱

2 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Streszczenie

Białka nitkowate, takie jak wimentyna, zapewniają organizację w komórkach, tworząc strukturalne rusztowanie z miejscami, które wiążą białka zawierające powtórzenia plakinowe. W tym miejscu opisano protokół wykrywania i pomiaru takich oddziaływań przy użyciu domeny powtórzeń kulistych plakiny envoplakiny i spiralnej cewki wimentyny. Stanowi to podstawę do określenia, czy białko wiąże wimentynę (lub podobne białka nitkowate) oraz do pomiaru powinowactwa oddziaływania. Białko globularne, będące przedmiotem zainteresowania, znakuje się 15N i miareczkuje białkiem wimentyny w roztworze. Dwuwymiarowe widmo NMR jest pozyskiwane w celu wykrywania interakcji poprzez obserwację zmian w kształcie piku lub przesunięć chemicznych oraz w celu wyjaśnienia wpływu warunków roztworu, w tym poziomów soli, które wpływają na strukturę wimentyny czwartorzędowej. Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże nitkowaty ligand, oddziaływanie wiązania określa się ilościowo za pomocą MST przy użyciu oczyszczonych białek. Podejście to jest prostym sposobem na określenie, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże włókno i na ocenę, w jaki sposób zmiany, takie jak mutacje lub warunki roztworu, wpływają na interakcję.

Wprowadzenie

Interakcje między białkami pozwalają na tworzenie molekularnych maszyn, które tworzą porządek w komórkach. Indywidualne interakcje są często słabe, ale zwykle przyczyniają się do powstawania wielowartościowych kompleksów, które mogą współpracować i dynamicznie regulować. Czułe testy, które zapewniają rozdzielczość atomową i informacje ilościowe o takich złożonych interakcjach, są potrzebne do wydedukowania mechanizmów i zaprojektowania interwencji, takich jak cząsteczki podobne do leków. Spektroskopia NMR jest skuteczną metodą uzyskiwania takich informacji o interakcjach białkowych, a także służy do szybkiego badania przesiewowego ligandów, w tym tych, które słabo się wiążą1. Stosowane metody NMR można podzielić na te, które obserwują białka lub obserwują ligandy. W tym artykule zastosowano pierwsze podejście, w którym uzyskuje się widmo białka znakowanego stabilnym izotopem, które jest stosunkowo małe (zwykle poniżej 20 kDa), a nieznakowany ligand jest miareczkowany. Pozwala to na mapowanie oznakowanych pozostałości biorących udział w interakcji w korzystnych przypadkach. Gdy kompleks się uformuje, zachodzą zmiany w środowisku chemicznym oddziałujących reszt, które objawiają się zmianami w przesunięciu chemicznym i kształcie ich sygnałów NMR. Zakres tych zmian koreluje ze stopniem zaangażowania tych grup w interakcję. Perturbacje przesunięcia chemicznego (CSP) można zmierzyć, porównując serię widm NMR białka zebranych pod nieobecność i obecność różnych ilości liganda. W przypadku większych ligandów lub złożonych oddziaływań można zmierzyć zmianę kształtu lub intensywności piku w celu wydedukowania oddziaływań.

Najczęstszym eksperymentem 2D używanym do wykrywania oddziaływań ligandów jest eksperyment z 15N-heterojądrowymi pojedynczymi korelacjami kwantowymi (HSQC)2. Wymaga to, aby jedno białko było równomiernie znakowane 15N, co zwykle osiąga się poprzez ekspresję ich jako wersji znakowanych powinowactwem w kulturach bakterii E. coli hodowanych w 15pożywkach wzbogaconych w N. Wiązanie jest widoczne, gdy widma HSQC zebrane podczas miareczkowania nakładają się na siebie, ujawniając zmiany pików dla podzbioru reszt biorących udział w tworzeniu kompleksu. Interakcja może zachodzić w reżimie szybkiej wymiany, w którym sygnały stanu wolnego i nasyconego ligandem zapadają się w jeden uśredniony pik populacji. Alternatywnie, w przypadku powolnej wymiany między stanami, oba sygnały są obserwowane za pomocą całek, które reprezentują ich względne ilości. Podczas gdy analiza kształtu linii NMR może być wykorzystana do oszacowania powinowactwa wiązania w niektórych przypadkach, metody takie jak MST okazały się również wygodne i zapewniają krzyżową walidację rzeczywistych interakcji.

Podany przykład dotyczy dwóch białek znajdujących się w desmosomach. Pośredniczą w połączeniach między powierzchniami komórek a cytoszkieletem i pośredniczą w wielowartościowych interakcjach między maszynami adhezyjnymi komórek a włóknami pośrednimi, aby utrzymać integralność tkanek skóry i serca oraz wytrzymać siły ścinające. Choroby mogą wystąpić, gdy białka desmosomalne, takie jak desmoplakina lub wimentyna, są zagrożone przez mutacje lub autoprzeciwciała, co prowadzi do destabilizacji połączeń komórka-komórka, a zatem ich interakcje mają kluczowe znaczenie3. Strukturalne podstawy wiązania ligandów przez białka desmosomalne można scharakteryzować za pomocą spektroskopii NMR, podczas gdy interakcje można określić ilościowo za pomocą MST. Metody przedstawione w niniejszym dokumencie zostały wykorzystane do scharakteryzowania interakcji między domenami powtórzeń plakiny (PRD), które często występują jako zestawy tandemowe, które oferują podstawowe rowki, a wimentyną, pośrednim włóknem, które oddziałuje przez kwaśną powierzchnię oferowaną przez jego spiralny wiązkę4. Kompleksy te powstają na błonie komórkowej, gdzie zakotwiczają się w pośrednich włóknach cytoszkieletu komórkowego do desmosomów, które łączą się z sąsiednimi komórkami, tworząc w ten sposób sieć wiązań adhezyjnych, które promieniują przez tkankę.

Protokół

1. Ekspresja białka rekombinowanego

  1. Ekspresja envoplakiny PRD (E-PRD) i wimentyny 99-249 (VimRod)
    1. Przekształć komórki E. coli BL21(DE3) w plazmid zawierający pożądany gen. Rozłóż komórki na płytkach agarowych zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
    2. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep 20 ml bulionu Terrific (TB) zawierającego 100 μg/ml ampicyliny, aby wybrać plazmid. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min) przez noc.
    3. Przenieś całą 20 ml kultury do 1 l gruźlicy zawierającej 50 μg/ml ampicyliny. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy prędkości 180 obr./min, aż OD600 = 0,6-0,8.
    4. Obniżyć temperaturę do 18 °C i indukować ekspresję białka przez dodanie izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM. Kontynuować inkubację w temperaturze 18 °C z wytrząsaniem z prędkością 160 obr./min przez noc, aby umożliwić ekspresję białka.
    5. Zebrać komórki, odwirowując kulturę przy 8 000 x g przez 15 minut. Zdekantować i odrzucić supernatant.
    6. Umyć zebrane komórki, ponownie zawieszając osad komórkowy w około 40 ml buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS: 20 mM bufor fosforanowy, pH 7,4, 120 mM NaCl). Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować ponownie przy 8 000 x g przez 15 minut.
    7. Zdekantować i odrzucić supernatant. Albo natychmiast rozpocznij protokół oczyszczania, albo zamroź granulki komórek w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  2. Ekspresja białka znakowanego izotopowo
    1. Przekształć komórki E. coli BL21(DE3) i przygotować 20 ml kultury starterowej, jak w 1.1.1-1.1.2.
    2. Przenieś całą 20 ml kultury do 1 l wzbogaconej gruźlicy zawierającej dodatkowe 4,0 g tryptonu, 5,0 g NaCl i 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 160 obr./min, aż OD600 = 1,6-1,9.
    3. Zebrać 1 l kultury przez odwirowanie przy 8000 x g przez 15 minut. Zdekantować i wyrzucić supernatant.
    4. Przemyć osad komórkowy przez delikatne ponowne zawieszenie w około 40 ml PBS i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml.
    5. Ponownie odwirować przy 8 000 x g przez 15 minut. Zdekantować i wyrzucić supernatant.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 20 ml pożywki o minimalnej ilości M9 (Tabela 1) i przenieść do pozostałej części 950 ml pożywki minimalnej M9 zawierającej 100 μg/ml ampicyliny.
    7. Dodać 50 ml wysterylizowanej przez filtr mieszanki składników odżywczych (tabele 2 i 3).
    8. Aklimatyzować kulturę do temperatury 18 °C przez 30 minut przed dodaniem IPTG do końcowego stężenia 1 mM.
    9. Inkubować przez noc w temperaturze 18 °C z wytrząsaniem przy prędkości 160 obr./min.
    10. Pobrać komórki jak w sekcji 1.1.4-1.1.6.

2. Unieruchomiona chromatografia powinowactwa do metali (IMAC) Oczyszczanie VimRod i E-PRD

  1. Oczyszczanie VimRod oznaczonego His6
    1. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml/g PBS zawierającym koktajl inhibitorów proteazy pozbawiony EDTA. Homogenizuj za pomocą 12 pociągnięć w homogenizatorze tkankowym Dounce, aby poprawić lizę komórek w następnym kroku.
    2. Na lodzie sonikować zawiesinę komórek impulsem 1 s wł./1 s wyłączenia, amplituda 80%, w sumie 1,5 min. Powtórz sonikację jeszcze dwa razy, delikatnie wirując na lodzie między cyklami, aby zapobiec przegrzaniu.
    3. Odwirować próbkę o masie 75 000 x g przez 45 minut. Zdekantować i przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego (0,45 μm).
    4. Zrównoważyć 5 ml kolumny IMAC z 5 objętościami kolumny (CV) buforu wiążącego (20 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazolu) przy natężeniu przepływu 1 ml/min przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC).
    5. Załadować przefiltrowany supernatant do kolumny z natężeniem przepływu 0,5 ml/min.
    6. Przepłukać kolumnę 5 CV buforu do przemywania (20 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, 50 mM imidazolu) przy natężeniu przepływu 1 ml/min.
    7. Eluować białko za pomocą 3 CV buforu elucyjnego (20 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, 350 mM imidazolu) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min. Zebrać 1,5 ml frakcji. Jeśli to możliwe, wybierz tryb elucji w górę, aby zwiększyć stężenie eluowanego białka.
    8. Zidentyfikuj frakcje z chromatogramu FPLC, które zawierają interesujące Cię białko za pomocą SDS-PAGE i użyj standardowych metod do pomiaru stężenia białka5.
    9. Zebrać i zagęścić frakcje elucyjne zawierające największe ilości białka za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji (MWCO 3 kDa, 5 ml) do 2 ml. Odwirować przy 21 000 x g w celu usunięcia osadu i przepuścić przez filtr 0,22 μm.
    10. Zrównoważyć kolumnę do chromatografii wykluczającej (S) o pojemności 120 ml z 2 CV buforu S (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, 0,5 mM TCEP) przy natężeniu przepływu 1 ml/min przy użyciu FPLC.
    11. Wstrzyknąć skoncentrowane białko z 2.1.9 do kolumny i eluować 1 CV buforu S przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min, zbierając frakcje 1 ml.
    12. Zidentyfikuj frakcje zawierające białko będące przedmiotem zainteresowania, tak jak poprzednio.
    13. Połącz frakcje zawierające największe ilości białka.
    14. Przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego stosowania lub dodać glicerol do 20% i przechowywać w temperaturze -80 °C w małych porcjach.
  2. Oczyszczanie białka E-PRD z usuniętym znacznikiem His6
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami w 2.1.1-2.1.8, aby oczyścić białko E-PRD znakowane His6. Zebrać frakcje pików i określić stężenie białka.
    2. Dodać proteazę wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) (1 mg/ml) w stężeniu 2 μl/mg białka zbiorczego. Przenieść do rurki dializacyjnej (6 kDa) i dializować w buforze S przez noc w temperaturze 4 °C. Ten krok umożliwia rozszczepienie znacznika His6 i usunięcie imidazolu, który będzie zakłócał wiązanie z żywicą Ni-NTA w następnym kroku.
    3. Zrównoważyć 5 ml żywicy Ni-NTA w kolumnie grawitacyjnej z 3 CV buforu S. Odcedź nadmiar buforu z żywicy.
    4. Wlej rozszczepione białko E-PRD na żywicę i inkubuj przez 1 godzinę na platformie kołyszącej, aby umożliwić związanie się rozszczepionego E-PRD znakowanego His6 i rozszczepionego znacznika His6. Proteaza TEV jest również znakowana His6 i będzie wiązać żywicę. Zbierz przepływ, który zawiera E-PRD bez znaczników. Przemyj żywicę buforem S o pojemności 2 CV, aby upewnić się, że cały E-PRD został odzyskany.
    5. Zagęścić E-PRD w przepływie do 2 ml za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji (MWCO 3 kDa, 5 ml). Odwirować przy 21 000 x g w celu usunięcia osadu i przepuścić przez filtr 0,22 μm.
    6. Zrównoważyć kolumnę S o pojemności 120 ml z 2 CV buforu S (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, 0,5 mM TCEP dla MST lub 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 dla NMR) przy natężeniu przepływu 1 ml / min przy użyciu FPLC.
    7. Wstrzyknąć skoncentrowane białko E-PRD z 2.2.5 do kolumny i eluować 1 CV buforu S z szybkością przepływu 0,5 ml/min, zbierając frakcje 1 ml.
    8. Zidentyfikuj frakcje zawierające białko będące przedmiotem zainteresowania, tak jak poprzednio.
    9. Połącz frakcje zawierające największe ilości białka.
    10. Przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego stosowania lub dodać glicerol do 20% i przechowywać w temperaturze -80 °C w małych porcjach.

3. Metody NMR

  1. Przygotowanie próbki NMR
    1. Oczyść 15N znakowanego białkiem typu dzikiego lub R1914E E-PRD zgodnie z wcześniejszym opisem, używając 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 jako buforu S dla kroku 2.2.6. Roztwory białkowe zwykle wahają się od 0,3 do 1 mM przy objętościach około 1 ml.
      UWAGA: Białko można zagęścić do >100 μM za pomocą odśrodkowego urządzenia ultrafiltracyjnego MWCO o stężeniu 3 kDa, 5 ml, aby doprowadzić stężenie do odpowiedniego zakresu do przygotowania próbki.
    2. Oczyścić próbkę nieznakowanego białka VimRod przy użyciu 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 jako buforu S dla kroku 2.1.10.
    3. W końcowej objętości 500 μl dodać białko E-PRD typu dzikiego lub zmutowanego do końcowego stężenia 100 μM, tlenek deuteru (D2O) do końcowego stężenia 10% (v/v) i DSS (kwas 4,4-dimetylo-4-silapentano-1-sulfonowy) do końcowego stężenia 20 μM. Doprowadzić objętość próbki do 500 μL za pomocą 20 mM Tris-HCl, 1 mM naziemna telewizja cyfrowa, pH 7. Przygotowanie reprezentatywnej próbki opisano w tabeli 4.
      UWAGA: Rezonans 0 ppm DSS jest używany do kalibracji przesunięć chemicznych 1H, jak również do pośredniego odniesienia do 15N przesunięć chemicznych białka6. D2O jest używany do sygnału blokady deuteru, aby spektrometr działał przy stałym polu magnetycznym netto.
    4. Uzupełnić drugą próbkę E-PRD,D2Oi DSS, jak w poprzednim kroku, i dodać VimRod do końcowego stężenia 50 μM, a następnie zwiększyć objętość do 500 μL.
    5. Przenieś próbki o objętości 500 μl do probówek NMR o szerokości 5 mm na potrzeby eksperymentu.
  2. Konfiguracja eksperymentalna NMR
    1. Włącz przepływ powietrza za pomocą polecenia wyrzutu "ej"; spowoduje to podniesienie próbki z magnesu. Teraz umieść próbkę w kołpaku na magnesie przy otworze i włóż za pomocą polecenia "ij". Poczekaj, aż próbka osiądzie w magnesie, zanim przejdziesz dalej.
      2. Utwórz nowy zestaw danych za pomocą polecenia "edc" i załaduj standardowe parametry 1 H NMR, wybierając eksperyment "ZGPR" (Rysunek 1).
    2. Wypełnij pola NAZWA, EXPNO (numer eksperymentu) i PROCNO (numer folderu przetwarzanych danych). Wybierz rozpuszczalnik w polu "Ustaw rozpuszczalnik" i kliknij "Wykonaj "getprosol", aby odczytać standardowe parametry głowicy sondy i rozpuszczalnika (prosol).
    3. Zablokować próbkę w deuterowanym rozpuszczalniku, tj. D2O, za pomocą polecenia "zablokować" i poczekać, aż zakończy zamiatanie i osiągnie blokadę.
    4. Skoryguj częstotliwość rezonansową magnesu, dostrajając próbkę za pomocą automatycznego polecenia strojenia "atma". Monitoruj krzywą chybotania, aż do zakończenia automatycznego strojenia.
    5. Podkładka pod pole magnetyczne za pomocą TOPSHIM (polecenie "topshim"). Shimming to proces regulacji pola magnetycznego w celu uzyskania jednorodności wokół próbki. Dobrą praktyką jest przechowywanie wartości podkładek za pomocą polecenia "wsh" i odczytywanie ich za pomocą "rsh" przed topshim, jeśli używasz tych samych lub podobnych próbek.
    6. Dostosuj wzmocnienie odbiornika za pomocą polecenia "rga", aby uzyskać maksymalny stosunek sygnału do szumu.
    7. Umieść środek widma na przesunięciu rezonansu wody (o1) i ustaw impuls protonowy 90 stopni (p1) na dużą moc za pomocą "calibo1p1".
    8. Zbierz widmo protonów za pomocą polecenia zero go "zg" i proces z "efp", który obejmuje mnożenie wykładnicze ("em"), rozpad indukcji swobodnej (FID) obejmujący poszerzenie linii, transformację Fouriera FID "ft" i "pk" w celu zastosowania korekcji fazy.
    9. Zastosuj automatyczną korekcję fazy "apk" i automatyczną korektę linii bazowej "absn" przy użyciu opcji wielomianu bez całkowania.
    10. Utwórz nowy zestaw danych (jak w 3.2.2) dla eksperymentu SOFAST HMBC, wybierając opcję "SFHMQC3GPPH" w eksperymencie.
    11. Skopiuj zoptymalizowane P1 i O1 z widma protonów i wypełnij impulsy zależne od P1 za pomocą polecenia "getprosol 1H p1 plw1", gdzie p1 to zoptymalizowana wartość P1, a plw1 to poziom mocy dla P1.
    12. Zoptymalizuj stałą CNST54, aby ustawić przesunięcie dla amidowego przesunięcia chemicznego i CNST55, aby zdefiniować szerokość pasma w celu objęcia obszarów widmowych będących przedmiotem zainteresowania, co pozwala na optymalizację wzmocnienia odbiornika (Rysunek 2). Aby wybrać te parametry, wyodrębnij pierwszy FID (rozpad swobodnej indukcji) z widma dwuwymiarowego i poszukaj obserwowanego sygnału, aby je zdefiniować. Ponadto zmieniaj opóźnienie relaksacji (D1), liczbę skanów (NS) i skanowania fikcyjne (DS), aby uzyskać akceptowalną czułość sygnału za pomocą polecenia "gs", które umożliwia go i skanowanie w celu monitorowania jakości danych w czasie rzeczywistym.
    13. Zapisz widma za pomocą Zero Go "zg".
  3. Przetwarzanie danych NMR
      Ustaw parametry przetwarzania na wielkość bezpośrednich wymiarów F2 (1 H) i pośrednich F1 (15N) widma za pomocą "SI F2=2048, F1=512" z opcjonalną predykcją liniową w wymiarze pośrednim (Rysunek 3).
    2. Wybierz "QSINE" jako funkcję Window i wprowadź przesunięcie dzwonka sinusoidalnego (SSB) o wartości 2, aby przetworzyć widmo dwuwymiarowe.
    3. Wprowadź polecenie "xfb", aby przetworzyć dane w obu kierunkach za pomocą funkcji okna i transformacji Fouriera.
    4. Użyj polecenia "apk2d", aby przeprowadzić automatyczną korekcję fazy w obu kierunkach. Jeśli proces automatyczny nie osiągnie zadowalającego poziomu korekcji fazy, należy wyodrębnić FID za pomocą polecenia "rser", obliczyć wartości faz z przetwarzania 1D i zastosować je do danych 2D.
    5. Skoryguj linię bazową za pomocą funkcji automatycznej korekcji linii bazowej "abs2" dla danych 2D. Spowoduje to zastosowanie funkcji wielomianowej między wartościami ppm zdefiniowanymi w parametrach przetwarzania i wytworzy widmo 2D do dalszej analizy.
    6. Jeśli planujesz wykonanie przetwarzania szeregowego w celu porównania danych oddziaływania z inną cząsteczką, zapisz parametry przetwarzania za pomocą polecenia "wpar" i przywołaj je za pomocą "rpar". W ten sposób wszystkie zbiory danych będą przetwarzane z tymi samymi parametrami i nie zostaną wprowadzone różnice ze względu na różnice w przetwarzaniu.
  4. Analiza danych NMR
    1. Wprowadź polecenie "pp", aby rozpocząć proces pobierania szczytów.
    2. Zdefiniuj zakres ppm i minimalną intensywność/maksymalną liczbę pików na podstawie oczekiwanych szczytów (Rysunek 4). Kliknij OK i zweryfikuj wyniki poprzez oględziny. W razie potrzeby uruchom proces ponownie, aż wyniki będą zadowalające na podstawie jakości widm.
    3. Wygeneruj listę szczytów za pomocą polecenia "pp".
      UWAGA: Ta lista szczytów domyślnie zawiera informacje o wysokości/intensywności piku danych i może być eksportowana do kolejnych widm i może być odczytywana przez inne programy.
    4. Obserwuj zmiany w intensywności pików lub ruch w przesunięciach chemicznych w widmach HSQC białek, które wskazują na interakcję z inną cząsteczką. Jeśli oddziałująca cząsteczka jest duża, spodziewaj się zmniejszenia intensywności pików wraz z zanikiem niektórych pików.
    5. Zaimportuj listę pików do następnego zestawu danych, klikając na zakładkę "szczyty" i wybierając "importuj" prawym przyciskiem myszy w oknie pików.
    6. Wizualizuj piki w całym widmie i w razie potrzeby przesuwaj je w nowe pozycje. Kliknij "resetuj intensywności" dla "pełnej tabeli", aby wygenerować listę szczytów dla widma z intensywnościami (Rysunek 5). Ta lista szczytów przeniesie informacje o pozycji z zapisanej listy szczytów.
    7. Eksportuj listy szczytów z różnych zestawów danych do arkusza kalkulacyjnego lub innego programu matematycznego w celu analizy, wybierając funkcję "Eksportuj".
    8. Obliczyć zmianę intensywności pików za pomocą funkcji "natężenie piku w widmie zespolonym/natężenie piku w widmie białkowym" dla każdego piku. Wartości można przekonwertować na zmianę procentową przez pomnożenie przez 100. Należy zauważyć, że objętości pików są również przydatne, chociaż intensywności pików są łatwiejsze do zmierzenia dla pików, które są umieszczone blisko siebie, jak to zwykle ma miejsce w przypadku białek o dużej gęstości i stosunkowo szerokich pikach.

4. Termoforeza w mikroskali (MST)

  1. Przygotowanie białka ligandowego E-PRD
    1. Wymienić ligand na bufor kompatybilny z MST, dializując do 800 μl białka w minijednostce dializacyjnej o masie 3,5 kDa zawieszonej w 1 l 20 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl, powoli mieszając w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Zagęścić ligand za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji (3 kDa MWCO) przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść skoncentrowane białko do czystej probówki.
    3. Odwirować ligand przy 21 000 x g przez 10 minut i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki w celu usunięcia wytrąconego białka. Oznaczyć stężenie liganda, stosując absorbancję przy 280 nm i współczynnik ekstynkcji liganda. Dodaj 10% Tween-20, aby uzyskać końcowe stężenie 0,015%. Tween-20 dodaje się do buforu testowego, aby zapobiec adsorpcji na naczyniach włosowatych. Końcowy bufor testowy, który jest używany do eksperymentów MST, to 20 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl, 0,015% Tween-20.
  2. Przygotowanie znakowanego barwnikiem białka docelowego VimRod
    1. Odtworzyć barwnik RED-tris-NTA, dodając 50 μL 1x PBS-T dostarczanego z RED-tris-NTA, aby uzyskać stężenie 5 μM. Dozować 2 μl porcji do probówek o pojemności 200 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Rozcieńczyć białko docelowe do 0,34 μM buforem do oznaczania. Dodać 58 μl tarczy do 2 μl podwielokrotności barwnika RED-tris-NTA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie znakowanej barwnikiem tarczy wynosi 0,33 μM. Odwirować znakowaną tarczę przy 21 000 x g przez 10 minut i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, aby usunąć wszelkie osady. Barwnik RED-tris-NTA wiąże się z białkami poprzez znacznik His6 i ma stałą dysocjacji wiązania (KD) w zakresie sub-nanomolowym. Jest on skutecznie w 100% związany z białkiem docelowym, więc nie jest wymagane dalsze oczyszczanie.
    3. Włącz przyrząd MST i otwórz oprogramowanie sterujące. Wybierz ustawienie Czerwony dla barwnika RED-tris-NTA. Włączyć regulator temperatury na 25 °C.
    4. Wybierz test wstępny, aby sprawdzić poprawność etykietowania obiektu docelowego i sprawdzić agregację lub adsorpcję w kuwetach. Ocena tych parametrów jest dostarczana automatycznie.
    5. Zmieszać 17 μl buforu do oznaczania i 3 μl białka docelowego i wymieszać pipetując. Wypełnij dwie standardowe kapilary, zanurzając je w rozcieńczonym celu i wciągając płyn do środka kapilary. Umieść kapilary w tacce i w instrumentach. Rozpocznij pomiar.
    6. Przejrzyj wyniki, szukając wystarczającego poziomu fluorescencji i braku oznak adsorpcji (zniekształcenia w kształcie linii kapilarnej) lub agregacji (zniekształcenia w śladzie MST), które zostaną oznaczone w analizie oprogramowania. Jeśli wyniki są pozytywne, przejdź do etapów liganda, jeśli nie, należy wypróbować inny bufor lub ilość Tween-20 może zostać zwiększona do 0,05% lub więcej.
  3. Przygotowanie liganda E-PRD do podwójnej serii rozcieńczeń
    1. Przygotować serię rozcieńczeń, oznaczając 16 probówek o pojemności 200 μl od 1 do 16.
    2. Dodać 17 μl liganda o stężeniu 1,17 razy większym niż maksymalne stężenie liganda pożądane w probówce1. Objętość ta jest dwukrotnie większa niż potrzebna ilość (8,5 μl), ponieważ podwielokrotność zostanie następnie przeniesiona do następnej probówki w serii. Ostateczna objętość testu wynosi 10 μL, więc 8,5 μL o 1,17-krotnym stężeniu liganda zostanie rozcieńczone do 1x przez dodanie 1,5 μl docelowego białka, VimRod. To maksymalne wybrane stężenie powinno być co najmniej 20-krotnie większe od szacowanej wartościKD.
    3. Dodać 8,5 μl buforu do testu do probówek2-16 za pomocą nowej końcówki pipety dla każdej podwielokrotności. Ponowne użycie końcówek do pipet może mieć wpływ na dokładność (porady dotyczące dokładnego pipetowania można znaleźć w instrukcjach producenta). Przenieść 8,5 μl liganda z probówki1 do probówki2, powoli uwalniając roztwór do buforu testowego bez generowania pęcherzyków. Wymieszać ligand i bufor, pipetując w górę i w dół co najmniej 6 razy, ponownie bez wytwarzania pęcherzyków. E-PRD w najbardziej skoncentrowanej probówce wynosił 1,5 mM, a znakowany VimRod był obecny w końcowym stężeniu 50 nM.
    4. Przenieść 8,5 μl liganda z probówki2 do probówki3 i wymieszać z buforem do oznaczania. Powtarzać seryjne rozcieńczanie aż do momentu, gdy do wszystkich probówek zostanie dodany ligand. Wyrzucić 8,5 μl z probówki 16 tak, aby wszystkie probówki zawierały 8,5 μl liganda w serii dwukrotnych rozcieńczeń.
  4. Przygotowanie Reakcji Wiązania i eksperymentu MST
    1. Dodaj 1,5 μl znakowanego białka docelowego do każdej z probówek i delikatnie mieszaj, pipetując w górę i w dół, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować przez 15 minut.
    2. Wybierz tryb ekspercki dla testu wiązania i wprowadź parametry dla serii seryjnych rozcieńczeń. Upewnij się, że regulacja temperatury jest ustawiona na 25 °C, moc wzbudzenia jest ustawiona na 40%, a moc MST na średnią. Parametry te muszą być zoptymalizowane pod kątem innych badanych partnerów wiążących.
    3. Napełnij naczynia włosowate reakcjami wiązania i umieść w tacce kapilarnej. Załaduj tackę do przyrządu, poczekaj, aż temperatura powróci do 25 °C i rozpocznij pomiar.
  5. analiza danych
    1. Otwórz plik testu wiązania w oprogramowaniu do analizy powinowactwa. Przejrzyj skany naczyń włosowatych; Poziomy fluorescencji nie powinny różnić się o więcej niż 10% od średniej, nie należy wykrywać agregacji ani adsorpcji, jak opisano w punkcie 3.6.
    2. Wybierz analizę MST w prawym panelu i przeciągnij dane testowe do zestawu analiz. Jeśli istnieje wiele serii tego samego testu wiązania liganda docelowego w identycznych warunkach, można je połączyć, wrzucając ten sam zestaw. Alternatywnie, każdy przebieg może być wrzucony do analizy niezależnie.
    3. Przejdź do zakładki Dopasowanie odpowiedzi na dawkę, aby wyświetlić dane na wykresie. Wybierz model KD, jeśli oczekiwane jest pojedyncze miejsce powiązania. Model Hill jest również opcją dla wielu witryn powiązań z zachowaniem współpracy. Punkty odstające, które nie przeszły kontroli jakości, mogą zostać usunięte z dopasowania na tym etapie. Zestawy scalane z wieloma testami zostaną uśrednione, a błędy obliczone jako odchylenie standardowe.
    4. Otwórz ostatnią kartę i porównaj wyniki między wszystkimi wykresami na jednym wykresie. Pobierz wyniki dopasowania dla każdej krzywej z wygenerowanej tabeli. W razie potrzeby wyeksportuj dane lub dopasowane krzywe do innego oprogramowania do prezentacji lub analizy.

Wyniki

Domena E-PRD (resztki 182-2014 sklonowane do pProEX-HTC) ludzkiego genu envoplakiny oraz domena VimRod (resztki 99-249 sklonowane do pET21a) ludzkiej vimentyny4 zostały wyekspresjonowane z tagami His6 i oczyszczone. Rycina 6 oraz Rycina 7 przedstawiają stopnie czystości białek VimRod (18,8 kDa) i E-PRD (21,8 kDa) uzyskane za pomocą tej metody oczyszczania białek. Usunięcie tagu His6 z konstrukcji E-PRD jest niezbędne do eksperymentów MST, ponieważ białko VimRod jest znakowane barwnikiem wiążącym tag His6, a każde białko E-PRD zachowujące tag His6 mogłoby konkurować o wiązanie tego barwnika. Druga kolumna IMAC po odcięciu tagu za pomocą proteazy TEV usuwa proteazę TEV, odcięty tag oraz wszelkie pozostałe, nieodcięte białka His6-E-PRD. Końcowym etapem doczyszczania jest chromatografia wykluczania żelowego. Mimo że oba białka mają podobną wielkość, VimRod eluuje z kolumny przy 51 mL, podczas gdy pik elucji E-PRD jest wyśrodkowany przy 72 mL, gdzie spodziewany byłby monomer białka tej wielkości. Pozorny wzrost wielkości VimRod wynika prawdopodobnie z jego charakterystyki jako białka w kształcie długiego włóknistego pręta, ponieważ eksperymenty z użyciem ultracentryfugi analitycznej wykazały, że VimRod występuje w formie monomeru4. Niższe wydajności białka uzyskuje się z kultur hodowanych w pożywce M9 niż z bogatego podłoża, co wynika z mniejszej ilości komórek produkowanych w pożywce minimalnej. Początkowy wzrost większych kultur startowych dla preparatów M9 w TB pozwala na zwiększenie wydajności komórek przy zachowaniu stopnia znakowania 15N niezbędnego dla eksperymentów NMR.

Widma 15N-1H HSQC zarejestrowano dla typu dzikiego oraz mutantu R1914E białka E-PRD w obecności lub w nieobecności VimRod (Rysunek 8A-8D). Widmo E-PRD na Rysunku 8A wykazuje oczekiwaną liczbę dobrze rozdzielonych sygnałów, co świadczy o prawidłowym sfałdowaniu białka. W obecności VimRod (Rysunek 8B) widmo wykazuje znaczne poszerzenie linii i zanikanie sygnałów, co odpowiada wiązaniu się E-PRD z VimRod. Wiązanie to zostaje zniesione w wyniku mutacji R1914E, co potwierdza porównanie Rysunku 8C i 8D. Po dodaniu VimRod do mutantu R1914E w widmie zaobserwowano niewielkie zmiany, co wskazuje na brak wiązania między tym mutantem E-PRD a VimRod. Intensywności sygnałów E-PRD w obecności i nieobecności VimRod zostały porównane i przedstawione jako względne intensywności sygnałów na Rysunku 8E, co wskazuje zakres poszerzenia sygnałów w kompleksie E-PRD. Mutant R1914E białka E-PRD (nie pokazano) zachował około 97% sygnałów o intensywności 20% lub wyższej w obecności VimRod, w porównaniu do około 20% dla typu dzikiego (Rysunek 8E). Reprezentuje to punktową mutację prowadzącą do utraty funkcji; przebadano również dodatkowe mutanty o efektach pośrednich4.

W celu walidacji i ilościowego oznaczenia wiązania VimRod i E-PRD przeprowadzono analizę MST, wykorzystując His6-VimRod znakowany fluorescencyjnym barwnikiem RED-tris-NTA jako cel, zmieszany z malejącymi stężeniami liganda E-PRD w zakresie od 1,28 mM do 39,1 nM. Wykonano trzy miareczkowania wiązania, a wyniki uśredniono i przedstawiono na Rysunku 9. Dane dopasowano do standardowego modelu wiązania liganda w jednym miejscu, co pozwoliło wyznaczyć wartość KD wynoszącą 25,7 ± 2,1 μM. Ocena wiązania pomiędzy VimRod i E-PRD metodą rezonansu plazmonowego powierzchni dała podobną wartość KD równą 19,1 ± 1,3 μM4.

Konfiguracja NMR z parametrami do akwizycji widm protonowych; rozpuszczalnik H2O+D2O, konfiguracja eksperymentu.
Rysunek 1: Zrzut ekranu z konfiguracji eksperymentu NMR. Wyświetlone okno służy do konfiguracji standardowego eksperymentu w celu zebrania zestawu danych HSQC. Parametry eksperymentu są odczytywane obok pola Experiment. Przedstawiony eksperyment ZGPR zostaje wybrany jako eksperyment początkowy, aby załadować standardowe parametry protonów zależne od rozpuszczalnika. Okno Title służy do wprowadzenia szczegółów eksperymentu w celu archiwizacji danych. Aby uzyskać widmo HSQC, eksperyment ZGPR zastępuje się eksperymentem SFHMQC3GPPH. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Konfiguracja parametrów spektroskopii NMR; przesunięcie chemiczne H(N), szerokość pasma, opóźnienie relaksacyjne, skany wstępne.
Rysunek 2: Dostrajanie parametrów eksperymentu NMR. Wyświetlone okno służy do wprowadzania podstawowych parametrów sekwencji impulsów NMR w celu optymalizacji sygnału. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ustawienia spektroskopii NMR dla analizy widma, obejmujące korekcję okna, fazy i linii bazowej.
Rycina 3: Przetwarzanie danych NMR. Przedstawiono parametry wykorzystywane do przetwarzania każdego z dwóch wymiarów widma NMR, przy czym strzałkami wskazano te, które są zazwyczaj dostrajane. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Konfiguracja wyznaczania maksimów w interfejsie oprogramowania NMR; parametry analizy pików widma i eksportu danych.
Rycina 4: Parametry wyznaczania maksimów sygnałów w widmach NMR. Parametry wykorzystywane do wyboru sygnałów NMR w przetworzonym widmie NMR przedstawiono wraz z wartościami typowymi. Należy dostosować zakres ppm, intensywność oraz liczbę sygnałów w celu optymalizacji widm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Tabela danych widma NMR zawierająca piki, częstotliwości i intensywności; zawiera menu do powiększania widma.
Rycina 5: Reprezentatywna lista pików z intensywnościami. Każdemu wybranemu piku w widmie NMR przypisuje się numer, a jego 1H i 15Wyświetlane są przesunięcia chemiczne i intensywność sygnałów. Tą listą pików można następnie posłużyć się do porównania widm uzyskanych w obecności lub w nieobecności partnera oddziaływania. Aby wyświetlić większą wersję tej ilustracji, należy kliknąć tutaj.

Oczyszczanie białek: chromatogramy filtracji żelowej, objętości elucji, analiza frakcji metodą SDS-PAGE.
Rycina 6: Oczyszczanie białka VimRod z oczkiem His6 za pomocą IMAC i S. A. Chromatogram elucji z kolumny IMAC wykazuje jeden główny pik białka VimRod. B. Chromatogram elucji z kolumny S wykazuje jeden główny pik. C. Elektroforeza SDS-PAGE frakcji zebranych w trakcie oczyszczania: standardy masy cząsteczkowej z masą podaną w kDa po lewej stronie żelu (M), lizat komórkowy (1), przepływ z kolumny IMAC (2), płukanie (3), połączone elucje (E1), połączone elucje z kolumny S (E2). Prążki widoczne przy wyższych masach cząsteczkowych w ścieżkach E1 i E2 są oligomerami czystego białka VimRod, co potwierdzono za pomocą western blotu (dane nie przedstawiono). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Oczyszczanie białek; SDS-PAGE, wykres chromatograficzny, wynik elektroforezy żelowej; masy cząsteczkowe.
Rysunek 7: Oczyszczanie E-PRD za pomocą IMAC i S. A. SDS-PAGE oczyszczania metodą IMAC przedstawiające standardy masy cząsteczkowej z masami podanymi w kDa po lewej stronie żelu (M), eluat z pierwszej kolumny IMAC (E1), produkty cięcia TEV (+TEV) oraz przepływ z drugiej kolumny IMAC (FT). B. Chromatogram z kolumny S wykazuje jeden główny pik. C. SDS-PAGE standardów masy cząsteczkowej (M) oraz frakcji z piku S. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

spektroskopia NMR; dwuwymiarowa korelacja przesunięć chemicznych protonów 1H-15N HSQC; cztery wykresy, jeden wykres słupkowy.
Rysunek 8: Widma HSQC typu dzikiego i mutanta R1914E E-PRD w obecności i przy braku VimRod. Widma HSQC wykazują dziki typ E-PRD (100 µM) w 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7 w obecności (A) lub w obecności 50 µM VimRod (B). Panele C i D przedstawiają widma HSQC mutanta R1914E (100µM) w obecności lub przy braku 50 µM odpowiednio VimRod. Na panelu E względne 1H-15Intensywności N pików E-PRD z wiązaniem VimRod lub bez niego przedstawiono jako funkcję numeru piku, który jest przypisany arbitralnie i nie opiera się na pozycji w sekwencji. Wartości te mogą służyć do zdefiniowania progu istotności dla redukcji intensywności piku po dodaniu liganda. W przypadku dostępności przypisań często można zauważyć, że wartości istotne odpowiadają obszarowi wiązania. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres krzywej zależności dawka-odpowiedź, ΔFnorm względem [PRD], ilustrujący analizę oddziaływań biochemicznych.
Rysunek 9: Wiązanie E-PRD do VimRod. E-PRD rozcieńczono w serii rozcieńczeń dwukrotnych w zakresie od 1,28 mM do 39,1 nM i inkubowano z oznakowanym VimRod przed przeprowadzeniem analizy MST. Dane z trzech niezależnych analiz zostały połączone. Dane dopasowano do KD model dostarczający KD z 25.7 μM z KD poziom ufności ± 2.1 μM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

OdczynnikIlość
Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)6,0 g
Fosforan potasu jednowodny (bezwodny)3,0 g
Chlorek sodu0,5 g
H2ODo 950 ml

Tabela 1. Pożywka M9 do znakowania izotopowego.

OdczynnikIlość
15NH4Cl1.0 g
Glukoza (lub glukoza 13C)2.0 g
1 M MgSO42 mL
50 mM CaCl24 mL
20 mg/mL tiamina1.0 mL
3 mM FeCl340 µL
Metal Mix (Tabela 3)50 µL
H2Odo 50 mL

Tabela 2. Mieszanka składników odżywczych do suplementacji pożywek M9.

OdczynnikIlość
4 mM ZnSO44323 mg
1 mM MnSO4475,5 mg
4,7 mM H3BO3145 mg
0,7 mM CuSO445,9 mg
H2ODo 50 ml

Tabela 3. Suplement mieszanki metali do wzbogacania pożywki MT Nutrient Mix.

Próbka1 mM E-PRD w buforze A1 (µL)1 mM VimRod w buforze A (µL)Bufor A (µL)200 µM DSS w D2O (µL)Bufor B2 (µL)Objętość całkowita (µL)
Samodzielna metoda e-PRD5005050350500
E-PRD + VimRod5050050350500
1Bufor A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2Bufor B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7

Tabela 4. Przygotowanie próbek do NMR.

Dyskusja

Eksperyment NMR 2D 15N-resolution jest jedną z najczęściej stosowanych metod pokazujących, jak oddziałują dwie cząsteczki. Jest to najbardziej bogata w informacje metoda, która pozwala na ciągłe monitorowanie sygnałów obu partnerów przez cały czas trwania eksperymentu miareczkowania w stanie roztworu. Chociaż metoda ta jest typowo jakościowa w przypadku dużych kompleksów, może być również stosowana w korzystnych przypadkach do pomiaru powinowactwa wiązań, w których sygnały NMR mogą być śledzone w widmach o wysokiej rozdzielczości. Tam, gdzie można wygodnie dokonać przypisań, na przykład w przypadku wielu białek o wielkości poniżej 20 kDa, można również zmapować miejsca wiązania. Testy uzupełniające, takie jak MST, dostarczają ilościowych informacji na temat interakcji w roztworze i wymagają mniejszej ilości białka w stanach nieznakowanych. Porównanie danych dotyczących wiązania mutantów jest przydatne do zapewnienia kontroli w celu zapewnienia, że interakcje udowodnione przez poszerzenie linii NMR są autentyczne, a nie artefaktami, na przykład agregacji lub zmianami lepkości.

Ekspresja białka

Usprawnienie procesu ekspresji zmniejsza ilość pracochłonnej produkcji białka. Częścią tego procesu optymalizacji jest identyfikacja odpowiedniego szczepu E. coli do rekombinowanej ekspresji białka. Preferencja szczepu zależy od takich elementów, jak charakter używanego wektora, a w szczególności ostateczna stabilność rekombinowanego białka, które ulega ekspresji7. Ryzyko degradacji białka heterologicznego przez endogenne proteazy E. coli można zmniejszyć, stosując E. coli z niedoborem proteazy, takie jak szczep BL21. W przypadku genów zawierających rzadkie kodony preferowany może być szczep taki jak BL21-CodonPlus (DE3)RIPL. Szczep ten łączy w sobie niedobór proteazy szczepu BL21 z dodatkowymi endogennymi kopiami rzadkich kodonów tRNA dla argininy, izoleucyny, proliny i leucyny. Alternatywnie, rzadkich kodonów, które mogą zagrozić nadekspresji, można uniknąć, zamawiając konstrukcję zoptymalizowaną pod kątem kodonów ze źródła komercyjnego. Dostępnych jest wiele szczepów E. coli do rekombinowanej ekspresji genów, z których każdy jest zoptymalizowany pod kątem obejścia określonego problemu podczas ekspresji7. W przypadku tego badania standardowy szczep BL21(DE3) z niedoborem proteazy wytworzył odpowiednie ilości rozpuszczalnego białka do późniejszego oczyszczenia i analizy.

Oczyszczanie białek

Protokół oczyszczania danego białka jest często unikalny w tym sensie, że każde białko pozostaje stabilne i rozpuszczalne w różnych warunkach, takich jak temperatura, stężenie soli lub pH. Ogólna skuteczność oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa jest również wrażliwa na stężenie substancji eluujących, takich jak imidazol, na różnych etapach procesu oczyszczania. W tej pracy krytycznymi warunkami buforowymi dla IMAC były pH dla E-PRD i stężenie imidazolu dla VimRod. Wymagane było pH 7,5, aby uniknąć wytrącania się E-PRD po wstępnej elucji z kolumny IMAC. W przypadku oczyszczania VimRod za pomocą IMAC stwierdzono, że zwiększenie stężenia imidazolu z 30 do 50 mM podczas etapu płukania kolumny spowodowało znaczną poprawę czystości końcowych frakcji elucyjnych. Na etapie elucji stwierdzono również, że zwiększenie stężenia imidazolu z 250 do 350 mM poprawia wydajność końcowej elucji. Początkowe próby elucji białka przy użyciu 250 mM imidazolu doprowadziły do niepełnej elucji VimRodu, co ujawnił końcowy pasek imidazolu 1 M kolumny (dane nie pokazane). Zwiększenie stężenia imidazolu do 350 mM dla elucji było wystarczające do odzyskania całego białka związanego z kolumną. S może służyć dwóm celom, ponieważ działa jako etap polerowania do oczyszczania białka, jednocześnie wykonując wymianę buforu. Wymiana buforu jest krytycznym etapem późniejszej analizy wiązania, ponieważ usuwa imidazol używany do elucji białka znakowanego His6. Jest to również okazja do zmiany warunków, takich jak stężenie soli lub pH, które mogą mieć wpływ na skuteczność niektórych dalszych technik lub testów. Przesunięcie termiczne białka (PTS) może być wykorzystane do identyfikacji optymalnych do dalszych testów, szczególnie w przypadku tych, które wymagają stabilnego białka przez dłuższy czas w temperaturze pokojowej 8,9.

Analiza powiązań

Świeżo przygotowane białko ma kluczowe znaczenie dla dokładnych testów wiązania, chociaż można również użyć zamrożonego białka, o ile wyniki są porównywane. Białka nitkowate, takie jak wimentyna, multimeryzują w sposób zależny od soli i pH, a zatem warunki roztworu muszą być zoptymalizowane, a stan oligomeryczny oszacowany za pomocą metody takiej jak SEC10,11, dynamiczne rozpraszanie światła 12 lub ultrawirowanie analityczne13,14,15. Spektroskopia NMR dobrze nadaje się do pomiaru oddziaływań ligandów małych białek w rozdzielczości atomowej. Jednakże, gdy białko oddziałuje z większą cząsteczką, następuje wolniejsze bębnienie, a to powoduje utratę sygnałów, które mogą potwierdzić wiązanie, chociaż niekoniecznie pozwalają na mapowanie miejsc wiązania, co również wymagałoby przypisania co najmniej rezonansów szkieletowych. W tym scenariuszu eksperymenty NMR nie pozwalają na identyfikację miejsca interakcji. W związku z tym stosuje się mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w celu identyfikacji krytycznych reszt potrzebnych do wiązania. Takie mutanty nie wykazują zatem utraty sygnału. W tym protokole zmutowana forma z podstawieniem w pozycji 1914 zachowuje szczytową intensywność w obecności VimRodu, a zatem potwierdza zakłócenie interakcji E-PRD i VimRod. Przypisanie rezonansów szkieletowych i łańcucha bocznego dodałoby wartości temu podejściu, zwłaszcza że struktura swobodnego E-PRD została rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej4. Przyszłe zastosowania NMR obejmują charakterystykę złożonych oddziaływań między większymi cząsteczkami i skorzystają z magnesów o ultrawysokim polu oraz wykorzystania innych obserwowalnych grup, takich jak 13znakowanych C i trifluorometylogrupowych jako reporterów.

MST ma wiele zalet w badaniu interakcji wiążących16. Elementy wiążące są dowolne w roztworze i nie są unieruchomione. Analiza jakości próbek jest wbudowana w oprogramowanie z raportowaniem kontroli jakości agregacji, adsorpcji do kapilar lub niewystarczającego znakowania fluorescencyjnego cząsteczki docelowej. Zwykle stosuje się niewielkie ilości celu, stężenie znakowanego celu wynosi zwykle między 20-50 nM w objętości 10-20 μl/reakcji. Protokół ten wykorzystuje bardzo małe objętości reakcji (10 μl), aby zmaksymalizować stężenie liganda, które można osiągnąć w miareczkowaniu, co pozwala na scharakteryzowanie słabych oddziaływań wiążących. Wymaga to dokładnego pipetowania i zachowania ostrożności, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków podczas dokładnego mieszania. Odpowiednie wymieszanie ma kluczowe znaczenie dla dokładnych, spójnych pomiarów fluorescencji wzdłuż zestawu seryjnych rozcieńczeń. Ilość Tween-20 w eksperymentach MST została zmniejszona ze standardowego 0,05% do 0,015%, aby zmniejszyć tendencję do tworzenia pęcherzyków i poprawić mieszanie.

Barwnik RED-Tris-NTA zapewnia szybki, łatwy i wygodny sposób fluorescencyjnego znakowania dowolnego białka, które ma znacznik He. Etykietowanie jest skutecznie zakończone w zaledwie 30 minut i jest bardzo szczelne, dzięki czemu nie jest konieczna procedura usuwania barwnika. Nie dokonuje się żadnych modyfikacji reszt aminokwasowych w białku, które mogłyby zmienić właściwości wiązania ligandów. Zastrzeżenie polega na tym, że tylko białko, które ma być znakowane, powinno mieć znacznik His6. Wymagało to rozszczepienia znacznika z białka liganda, E-PRD, oraz usunięcia znacznika i nienaruszonego E-PRD za pomocą drugiego kroku kolumny IMAC. Jeśli to możliwe, białko liganda powinno być przygotowane bez użycia znacznika He. Alternatywnie, białka mogą być kowalencyjnie znakowane fluoroforem poprzez sprzężenie aminowe z resztą lizyny lub sprzężenie tiolowe z resztą cysteiny. Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z takich systemów, ponieważ kowalencyjne przyłączenie fluoroforu może wpływać na oddziaływania wiązania elektrostatycznego lub biegunowego w oparciu o reszty lizyny lub cysteiny. Kwantyfikacja powinowactwa wiązania między VimRod i E-PRD przez MST była niezwykle wrażliwa na stężenie soli. Problem ten został złagodzony przez początkową dializę zarówno celu, jak i liganda w tej samej partii buforu testowego. Niemniej jednak nasycenie krzywej wiązania MST nie mogło zostać osiągnięte podczas wykonywania testu MST w obecności 150 mM NaCl ze względu na złożone zachowanie VimRod. Wiarygodne, kompletne dane uzyskano po obniżeniu stężenia NaCl do 10 mM, co pozwoliło na dokładne obliczenieKD. W związku z tym zaleca się staranną optymalizację warunków roztworu i porównanie z testami uzupełniającymi w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Ponadto MST może być stosowany do ilościowego określania zależności od soli dla danej interakcji, ilościowego określania właściwości stechiometrycznych interakcji białek, monitorowania fałdowania białek i badania kinetyki enzymów17.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) oraz Alberta Prion Research Institute / Alberta Innovates Bio Solutions (201600018), przyznane granty M.O i Genome Canada oraz Canada Foundation for Innovation przyznane The Metabolomics Innovation Centre (TMIC) i NANUC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Monolith NT.115, zawiera oprogramowanie sterujące i analityczneNanoTemper TechnologiesMO-G008Przyrząd do termoforezy mikroskalowej
Zestaw do etykietowania His-Tag RED-Tris-NTANanoTemper TechnologiesMO-L008Barwnik RED-tris-NTA do
kapilarKapilary NanoTemperTechnologies MO-K022do MST
HisTrap HP, 5 mlGE Healthcare17524801Kolumna IMAC
Żywica HisPur Ni-NTA, 100 mlThermo Fisher Scientific88222Żywica IMAC
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare28989333SEC
kolumna proteaza TEVSigma AldrichT4455łupliwość jego znacznika z E-PRD
BL21(DE3) Kompetentny E. coliNew England BiolabsC2527Hkomórki do ekspresji białek
cOmcomplete Protease Inhibitor Cocktail Tabletki Bez EDTASigma Aldrich11873580001inhibitory proteazy do oczyszczania białek przez IMAC
TCEP, chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfinySigma AldrichC4706środek redukujący do oczyszczania białek
Odczynniki (HEPES, NaCl itp.)Sigma AldrichróżnePrzygotowanie pożywek i
Chlorek amonu (15N, 99%)Cambridge Isotope LaboratoriesZnakowanie izotopówNLM-467
D2O, tlenek deuteru (D, 99,8%)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-2259Przygotowanie próbki NMR
DSS, 2,2-dimetylo-2-silapentano-5-sulfonian sodu, 2,2-dimetylo-2-silapentan-5-sulfonian-D6 (D,98%)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-8206odniesienie do
precyzyjnych probówek NMR 5 mm, długich 7"SJM/DeuterotubesProbówki NMR BOROECO-5-7
Spektrometr NMR (14,1 Tesli)Akwizycja danych NMRprzez firmę Bruker
Sonda kriogeniczna TCI 5mm z-PFGAkwizycja danych NMRfirmę Bruker
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
Bruker TopSpin 4.0.1Przetwarzanie danych NMRprzez Bruker
MO. Kontrolujtechnologiezawarte w Monlith NT.115
MO. Analiza powinowactwaTechnologiezawarte w Monlith NT.115
MST Standard dla NMR przez NanoTemper NanoTemper

Bibliografia

  1. Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
  2. McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).
  3. Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
  4. Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
  5. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).
  6. Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
  7. Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , Humana Press. 27-48 (2003).
  8. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  9. Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
  10. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , In Press (2018).
  11. Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  12. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  13. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  14. Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).
  15. Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).
  16. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100(2010).
  17. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza oddzia ywa bia kowychglobularne bia ka filamentowetest wi zania wimentynydomena powt rze plakinperturbacja przesuni cia chemicznegoanaliza intensywno ci pikuwp yw warunk w roztworupomiar powinowactwa KD

Powiązane artykuły