Method Article

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

DOI:

10.3791/58538

⸱

November 5th, 2018

 ,  ,  , 
1Alberta RNA Research and Training Institute, Department of Chemistry and Biochemistry, University of Lethbridge, 2Department of Biochemistry, University of Alberta, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 4DiscoveryLab, Faculty of Medicine & Dentistry, University of Alberta

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko z udziałem białek z wieloma domenami globularnymi stanowią wyzwanie techniczne dla określenia, jak powstają takie kompleksy i jak są zorientowane/pozycjonowane domeny. W tym miejscu opisano protokół, który może wyjaśnić, które konkretne domeny pośredniczą w interakcjach w systemie wieloskładnikowym poprzez modelowanie ab initio. Podano metodę obliczania struktur roztworów makrocząsteczek i ich zespołów, która polega na integracji danych z rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS), chromatografii i struktur rozdzielczości atomowej w podejściu hybrydowym. Konkretnym przykładem jest kompleks pełnowymiarowego nidogenu-1, który składa białka macierzy zewnątrzkomórkowej i tworzy wydłużoną, zakrzywioną nanostrukturę. Jedna z jego domen kulistych przyłącza się do lamininy γ-1, która strukturyzuje błonę podstawną. Stanowi to podstawę do określenia dokładnych struktur elastycznych wielodomenowych kompleksów białkowych i jest możliwe dzięki źródłom synchrotronowym sprzężonym z automatyką, robotyką i systemami chromatografii wykluczającej rozmiary. Ta kombinacja pozwala na szybką analizę, w której wiele stanów oligomerycznych jest rozdzielanych tuż przed zebraniem danych SAXS. Analiza dostarcza informacji na temat promienia bezwładności, wymiaru cząstek, kształtu molekularnego i parowania międzydomenowego. Podano również protokół generowania modeli 3D kompleksów poprzez dopasowanie struktur białek składowych o wysokiej rozdzielczości.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zawierają skomplikowane sieci białek, które działają jak molekularne maszyny do wykonywania funkcji komórkowych, takich jak kaskady sygnalizacji i utrzymywanie integralności strukturalnej. Sposób, w jaki te różne składniki poruszają się i oddziałują w przestrzeni trójwymiarowej, daje początek specyficznym funkcjom makrocząsteczek. Znaczenie struktury, dynamiki i interakcji białek w określaniu funkcji spowodowało potrzebę stale rozwijających się, złożonych technik pomiaru tych właściwości. Spośród nich magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), krystalografia rentgenowska (XRC), a ostatnio mikroskopia krioelektronowa (CEM) dostarczają informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości. Jednak XRC i CEM dają struktury jednego z wielu stanów biomolekularnych i brakuje im informacji o dynamice struktury białka, podczas gdy określanie struktury 3D za pomocą NMR jest zwykle ograniczone do mniejszych białek globularnych. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tych ograniczeń jest wykorzystanie rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do generowania otoczek molekularnych dużych, wielodomenowych lub skompleksowanych układów oraz łączenia sztywnych struktur makromolekularnych o wysokiej rozdzielczości w celu wyjaśnienia globalnej architektury i dynamicznych cech.

SAXS tworzy niskorozdzielcze obwiedni kompleksów makromolekularnych o rozdzielczości około 10-20 A 1, dając wgląd nie tylko w strukturę, ale także w dynamiczne cechy, które wykazuje kompleks. Chociaż SAXS wykorzystuje promieniowanie rentgenowskie do odkrywania struktury molekularnej, różni się od XRC tym, że losowa orientacja izotropowa cząstek w roztworze nie prowadzi do dyfrakcji, ale raczej do rozpraszania, które nie może dać rozdzielczości atomowej. Zamiast tego generowana jest "otoczka" elektronowa makrocząsteczki, która reprezentuje średnią konformacji, które wykazuje makrocząsteczka. Informacje te mogą być wykorzystane do bezpośredniego dopasowania wcześniej rozwiązanych atomowych struktur rozdzielczych do wnioskowania o regionach elastyczności w organizacji pojedynczego białka lub podjednostki lub dynamiki w większym, wielobiałkowym kompleksie. Dane SAXS są zbierane w synchrotronach przy użyciu wysokoenergetycznych monochromatycznych promieni rentgenowskich lub z własnych źródeł, które oferują słabsze źródło promieniowania rentgenowskiego, wymagające raczej godzin niż sekund czasu ekspozycji próbki (Rysunek 1). Dane SAXS są często zbierane z kilku próbek za pomocą jednej konfiguracji eksperymentalnej i bufora, co wymaga dłuższego czasu na zebranie rundy użytecznych danych w systemie. Próbki powinny być zatem stabilne i nieagregujące przez co najmniej kilka godzin w oparciu o weryfikowalne metody kontroli jakości, takie jak dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) i/lub analityczna analiza ultrawirówkowa (AUC) w celu uzyskania wysokiej jakości danych SAXS2,3. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny opis SAXS, zasady jego stosowania, korzyści, ograniczenia i przygotowanie próbek, a także skupiamy się głównie na gromadzeniu i analizie danych, a także pokrótce dotykamy modelowania ab initio przy użyciu białek macierzy zewnątrzkomórkowej nidogenu-1 i lamininy γ-1 jako przykładu eksperymentalnego.

Zasady, korzyści i ograniczenia SAXS:

Zasada przewodnia stojąca za SAXS jest stosunkowo prosta: roztwór monorozproszonego preparatu makromolekuł(ów) będącego przedmiotem zainteresowania umieszcza się w kapilarze i wystawia na działanie monochromatycznej wiązki promieniowania rentgenowskiego o wysokiej energii. Fotony powodują, że elektrony powłoki atomowej zaczynają oscylować, w wyniku czego emitowana jest fala sferyczna o tej samej energii i długości fali. Ponieważ każdy elektron będzie oscylował, zostanie osiągnięte stałe tło, a wynikowa gęstość elektronowa makrocząsteczki zostanie skontrastowana z tłem. Wynikowa intensywność rozpraszania jest zbierana w funkcji kąta rozpraszania, 2Θ (Rysunek 1).

Podczas gdy inne techniki, takie jak XRC, NMR i CEM, dostarczają informacji strukturalnych na poziomie atomowym, istnieje wiele korzyści dla SAXS, których inne techniki nie są w stanie zapewnić. SAXS może być wykonywany w prawie każdym buforze i nie wymaga specjalnego przygotowania próbki. Jest to szczególnie ważne w badaniu zachowania i struktury makrocząsteczek w różnych warunkach, takich jak obecność lub brak kationów jedno- lub dwuwartościowych lub zmiany pH4,5. SAXS ma możliwość dostarczania informacji o elastycznych regionach makrocząsteczki6, z czym inne wymienione techniki mogą mieć problemy. W związku z tym SAXS może być stosowany jako silna technika uzupełniająca, w której stabilne części makrocząsteczki są badane za pomocą XRC, NRM lub CEM, a cała makrocząsteczka lub kompleks jest analizowana w niskiej rozdzielczości za pomocą SAXS i łączona przy użyciu różnych narzędzi analitycznych, takich jak FoXSDock7 lub CRYSOL8. Ponieważ SAXS jest techniką rozwiązania, jest często używana do potwierdzenia, czy struktury statyczne, takie jak te uzyskane z XRC, są spójne w solution6. SAXS ma również tę zaletę, że jest techniką, która wymaga stosunkowo niewielkiej inwestycji w próbkę (zwykle 50-100 μl) i stosunkowo niewielkiej ilości czasu eksperymentu (30 min-1 h).

Największym ograniczeniem SAXS jest podatność na agregację i/lub degradację próbek, co może prowadzić do błędnych prognoz strukturalnych. Agregacja, nawet tak niska jak 5%, może rozpraszać światło w bardzo dużych ilościach, prowadząc do przeszacowania maksymalnego wymiaru cząstek (Dmax) i promienia bezwładności (Rg). Z drugiej strony, degradacja próbki może prowadzić do niedoszacowania właściwości molekularnych. Podatność ta wynika z faktu, że SAXS jest techniką uśredniania, co oznacza, że jednorodność próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Każda próbka, która ma być analizowana przez SAXS, powinna zatem zostać poddana wielu metodom oczyszczania i kontroli jednorodności, takim jak denaturacja i natywna elektroforeza żelowa, chromatografia wykluczania wielkości, dynamiczne rozpraszanie światła i ultrawirowanie analityczne. Często linie badawcze SAXS przeprowadzają próbki przez wysokosprawną chromatografię cieczową jako końcowy etap kontroli jakości przed SAXS (S-SAXS)3,9. Dane SAXS powinny być gromadzone przy wielu stężeniach, a Rg każdego zestawu danych powinno być porównywane, zapewniając ścisłe podobieństwo w celu uniknięcia interakcji międzycząsteczkowych i agregacji, co skutkuje przeszacowaniem wymiarów cząstek, co prowadzi do niedokładnej analizy i modelowania danych. Ponieważ rozpraszanie zależy zarówno od stężenia, jak i wielkości, mniejsze makrocząsteczki mogą wymagać bardziej szczegółowej optymalizacji zakresu stężeń. Wynika to z twierdzenia o wzajemności, w którym duże rozmiary rozpraszają się w kierunku małych kątów, a małe rozmiary w kierunku dużych kątów. Przejawia się to w zbieraniu danych, gdzie IO jest proporcjonalne do R6, gdzie R jest promieniem cząstki. Ostatnim ograniczeniem SAXS jest możliwość uszkodzenia próbki przez promieniowanie podczas ekspozycji, co może prowadzić do zniekształcenia danych. Dobrą praktyką jest porównywanie jakości próbki przed i po ekspozycji na próbkę SAXS, aby upewnić się, że tak się nie dzieje.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki SAXS i akwizycja danych

  1. Przygotowanie próbki:
    1. Eksperymenty SAXS wymagają jednorodnych, stabilnych i nieagregujących próbek białek; przed zebraniem danych należy obserwować stabilność i stan oligomeryczny za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (S), DLS i/lub AUC.
    2. Próbki poddane analizie (w tym przypadku nidogen-1 i laminina γ-1) analizie DLS i tricine SDS-PAGE w celu wizualizacji czystości próbki10.
      UWAGA: Próbki mogą obejmować zakres stężeń (1-4 mg / ml) w zależności od ich wielkości, zachowania roztworu, takiego jak samoasocjacja i agregacja wraz ze stabilnością; tutaj przygotowano pięć stężeń nidogenu-1 (139 kDa), trzy laminy γ-1 (109 kDa) i cztery oczyszczonego z S kompleksu równomolowego, jak opisano wcześniej10.
  2. Gromadzenie danych:
    1. Zbieraj dane SAXS za pomocą własnego systemu lub synchrotronu, zgodnie z wytycznymi producenta lub zakładu.
      UWAGA: Dane wykorzystane w tej pracy zostały zebrane za pomocą wewnętrznego systemu (patrz Tabela materiałów), który zawiera 3-otworkową kamerę wyposażoną w uszczelnioną tubę mikrofokusową + 002 (promieniowanie Cu Kα przy 1,54 A) i optykę konfokalną Max-Flux (CMF) działającą z mocą 40 W. System wyposażony jest również w wieloprzewodowy detektor 2D o długości fali 200 nm do zbierania danych. Jednak dzięki dostępności nowoczesnych synchrotronów we Francji, Niemczech, Wielkiej Brytanii, USA i innych krajach, które zapewniają dostęp do zestawu S-SAXS ułatwiającego oddzielenie monorozproszonego preparatu od możliwej agregacji/degradacji, obecnie rutynowo zbieramy dane w obiektach synchrotronowych. Niedawno opublikowany artykuł na temat DNA G-quadruplex11 jest przykładem strategii zbierania danych S-SAXS. W tym przypadku dane SAXS zebrano w zakresie 0,08 ≤ q ≤ 0,26 A przez 3 godziny dla nidogenu-1 (2,0, 2,5, 3,0, 3,5 i 4,0 mg/ml); laminina γ-1 (1,5, 2,0 i 2,5 mg/ml) i ich kompleks (0,8, 1,0, 1,25 i 1,5 mg/ml).
    2. Zmniejsz ilość danych dla bufora i próbek za pomocą oprogramowania do przetwarzania specyficznego dla systemu. Odejmij wkład bufora od danych białkowych za pomocą programu takiego jak PRIMUS/qt12 (Rysunek 2A).

2. Analiza danych

UWAGA: Obecnie istnieje kilka pakietów oprogramowania, które są przydatne do analizy danych SAXS: ScÅtter43 (do pobrania dostępny na www.bioisis.net), bioXtas RAW44, oraz ATSAS suite13. W tej sekcji omówiono ogólne czynności, które należy wykonać podczas analizowania surowych danych SAXS przy użyciu pakietu programów ATSAS, a konkretne kroki wykonano z pliku ATSAS 2.8.1 do pobrania. Można korzystać z innych programów, które zostaną pokrótce omówione później.

  1. Odejmowanie bufora
    UWAGA: Te kroki dotyczą tylko statycznych próbek SAXS.
    1. Wybierz opcję menu "OTWÓRZ" w PRIMUS/qt i wybierz interesujące Cię pliki danych. Należy pamiętać, że pliki danych muszą być w formacie ASCII, w którym pierwsza kolumna to oś wektora s, a druga kolumna to intensywność. Powtórz ten krok dla danych zebranych dla samego bufora, wstawiając te dane do tego samego menu.
    2. Wybierz "ODEJMIJ" w oknie Przetwarzanie danych, co spowoduje wygenerowanie odjętej krzywej rozpraszania reprezentującej tylko rozpraszanie od interesującej makrocząsteczki. Powtórz ten krok dla każdego stężenia.
  2. Analiza Guiniera
    1. Aby przeprowadzić analizę Guiniera, załaduj krzywą rozproszenia odjętą przez bufor do PRIMUS/qt, jak opisano wcześniej w kroku 2.1.1.
    2. Kliknij "Promień bezwładności", aby przejść do otwarcia kreatora Primus Guinier; zostanie wyświetlony wykres ln(I) vs q2.
    3. Aby uzyskać wstępny Rg użyj funkcji "AUTORG", która jest zewnętrznym modułem wbudowanym w PRIMUS/qt. Znajdź przycisk "Autorg" i kliknij go.
    4. Wprowadź wiele plików jednocześnie, podświetlając je wszystkie i wstawiając je do menu po prawej stronie, bardzo podobnie jak w 2.1.1.
    5. Użyj utworzonego wcześniej wykresu Guiniera, aby ocenić jakość danych; zielona linia pod wykresem Guiniera pokazuje wykres reszt reprezentujący liniowość dopasowania. Należy pamiętać, że nieliniowość w analizie Guiniera może być oznaką agregacji próbki i w tym przypadku nie należy przeprowadzać dalszej analizy.
      UWAGA: Liniowe dopasowanie Guiniera daje Rg z małym błędem (<5%) i sugeruje próbkę wysokiej jakości.
  3. Analiza Kratky
    1. Załaduj dane do wizualizacji w podobny sposób, jak opisano powyżej.
    2. Kliknij "ZAZNACZ POLE" obok nazwy pliku danych. Spowoduje to wykreślenie danych w osobnym oknie.
    3. Kliknij przycisk "DZIAŁKA", a następnie wybierz "Kartky Działka" w menu rozwijanym.
    4. Spowoduje to wykreślenie danych jako "q2 x L(q) vs q". Należy pamiętać, że białka kuliste wykazują pik Gaussa, podczas gdy białka niesfałdowane będą wyświetlać plateau zamiast piku i przypominać wykres hiperboliczny17.
  4. Scalanie danych
    1. Załaduj ponownie odjęte dane buforowe dla każdego stężenia w PRIMUS/qt, jak w kroku 2.1.1.
    2. Aby scalić dane, wystarczy kliknąć przycisk "SCAL" w oknie przetwarzania.
    3. Sprawdź każdą krzywą i liczbę w skali I, która odpowiada rozcieńczeniom wykonanym z oryginalnej próbki.
      UWAGA: Próbki o wyższym stężeniu wykazują mniej szumów w obszarze ogona krzywych.
  5. Dystrybucja P(r)
    1. Aby wygenerować wykres P(r), załaduj scalone krzywe danych do PRIMUS/qt, jak opisano wcześniej.
    2. Kliknij przycisk "Rozkład odległości", aby otworzyć nowe okno prezentujące połączone dane dotyczące natężenia światła rozproszonego w funkcji q i wykresu funkcji rozkładu para-odległość po prawej stronie.
      UWAGA: Informacje po prawej stronie przedstawiają ogólną jakość obliczeń funkcji rozkładu par i odległości.
    3. Dostosuj zakres scalonych danych, aby uniknąć znacznego szumu na końcu nieprzetworzonych danych.
    4. Pomiń punkty danych w pobliżu przystanku wiązki w obszarze niskiego q.
    5. Aby określić Dmax, zacznij od zakresu ~5-krotności Rg uzyskanego z analizy Guiniera. Stopniowo zmniejszaj tę wartość, aż wykres P(r) nie spadnie nagle do zera na osi Y i nie będzie miał długiego ogona przed zbliżeniem się do zera.
    6. Sprawdź, czy eksperymentalne liczby Rg/I0 (pochodzące z przybliżenia Guiniera) i P(r) Rg/I0 są podobne.
      UWAGA: W niektórych przypadkach wymagana jest również dalsza manipulacja zakresem danych, punktami danych i ALPHA (parametr regularyzacji, który informuje program o stosunku uwagi poświęconej gładkości rozkładu w porównaniu z dopasowaniem danych eksperymentalnych) 21 w celu uzyskania dobrej jakości wykresu P(r).

3. Modelowanie i uśrednianie ściegówinicjacyjnych A b

  1. Po połączeniu danych zebranych w wielu stężeniach lub zminimalizowaniu danych zebranych za pomocą S-SAXS oraz zweryfikowaniu wykresu Kratky'ego, wykresu P(r) i analizy Guiniera należy obliczyć niskorozdzielcze struktury makrocząsteczek i ich kompleksów. Ten potok może być używany do badania struktur roztworów i interakcji kwasów nukleinowych, białek i kompleksów kwasów nukleinowych-białko lub białko-białko10,11,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Jednym z najpopularniejszych programów jest DAMMIN, opracowany przez Svergun35 i będący częścią pakietu ATSAS13, który wykorzystuje symulowane protokoły wyżarzania ze wstępnymi informacjami wejściowymi na temat Rg i Dmax. Podejścia i zasady modelowania ab initio są szczegółowo opisane w innym miejscu18,36.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane powyżej podejście do analizy danych zostało wykorzystane do obliczenia maksimum Rg i D dla nidogenu-1, lamininy γ-1 i ich kompleksu za pomocą funkcji P(r). Uzyskaliśmy wartości Rg 7,20 (±0,10) nm, 8,10 (±0,20) nm i 10,9 (±0,4) nm odpowiednio dla nidogenu-1, lamininy γ-1 i ich kompleksu (Rysunek 2A-B). Ponadto uzyskano wartości Dmax wynoszące 24 nm, 26 nm i 35 nm dla nidogenu-1, lamininy γ-1 i ich kompleksu odpowiednio (Rysunek 2)10. Program DAMMIF wykorzystano do uzyskania niskorozdzielczych struktur nidogenu-1 i lamininy γ-1, co sugerowało, że oba białka przyjmują rozszerzony kształt w roztworze. Wartości X i NSD dla nidogenu-1 (~1 i 0,8) oraz lamininy γ-1 (odpowiednio ~0,9 i 0,8) również mieściły się w dopuszczalnym zakresie. Wyrównanie struktur o wysokiej rozdzielczości, dwóch domen nidogenu-1 i dwóch lamininy γ-1, na ich strukturach o niskiej rozdzielczości uzyskanych za pomocą SAXS pozwoliło na identyfikację ich regionów N- i C-końcowych10.

Nidogen-1 został zidentyfikowany jako partner oddziałujący z lamininą γ-139,40, a miejsce interakcji zostało zmapowane za pomocą krystalografii rentgenowskiej do domen C-końcowych41. Jednak struktury o wysokiej rozdzielczości obejmowały tylko oddziałujące domeny, a nie pełnowymiarowy nidogen-1 lub całe ramię lamininy γ-1. Dlatego oczyściliśmy kompleks zawierający nidogen-1 (pełna długość) i ramię lamininy γ-1, aby zidentyfikować oddziałujące regiony, a także zbadać względną orientację N-końcowych domen obu białek. Dane SAXS dla kompleksu dały Rg 10,9 (±0,4) nm i D max 35 nm. Wykorzystaliśmy MONSA do uzyskania struktury całego kompleksu o niskiej rozdzielczości, co sugerowało, że w rzeczywistości tylko region C-końcowy obu białek uczestniczy w interakcjach pośredniczących, podczas gdy reszta domen jest daleko od siebie oddalona (Rysunek 3, Wideo 1).

figure-results-1
Rysunek 1. Schemat konfiguracji SAXS. Przygotowuje się monorozproszony preparat biomolekuł lub ich kompleksów, a następnie poddaje się go działaniu promieni rentgenowskich o wysokiej energii. W zależności od źródła (np. synchrotron w domu lub synchrotron), energia promieniowania rentgenowskiego i odległość między próbką a źródłem mogą się różnić. Wzorzec rozpraszania promieni rentgenowskich (który zależy od wielkości i kształtu biomolekuł) jest rejestrowany i uśredniany radialnie w celu uzyskania jednowymiarowego wykresu (1D), który zawiera informacje o intensywności rozproszonego światła w odniesieniu do kąta rozpraszania. Ponieważ cząsteczki buforowe również rozpraszają światło, wkłady tych cząsteczek są odejmowane w celu uzyskania wzoru rozpraszania interesujących biomolekuł. W synchrotronie, przed zebraniem danych SAXS, zwykle przeprowadza się również dodatkowy etap oczyszczania przy użyciu wykluczenia wielkości w linii/chromatografii wysokosprawnej (widok z góry). Ten etap ma kluczowe znaczenie dla usunięcia wszelkich zagregowanych i/lub zdegradowanych produktów, a także dla usunięcia wszelkich niezwiązanych biomolekuł z kompleksu. Wykres rozpraszania 1D jest przekształcany na wykres rozkładu par elektronów i odległości (wykres P(r)), który zapewnia promień bezwładności i maksymalny wymiar cząstek biomolekuł. Wykres ten jest używany jako plik wejściowy dla pakietów modelowania ab initio (tj. DAMMIN/DAMMIF) w celu uzyskania struktur biomolekuł o niskiej rozdzielczości lub innych pakietów (np. SASREF/CORAL), jeśli znana jest struktura o wysokiej rozdzielczości części biomolekuł lub poszczególnych biomolekuł kompleksu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. (A) Wykres natężenia światła rozproszonego w funkcji kąta rozproszenia (q=4πsinθ/λ, nm-1) sugerujący jakość biomolekuł (obszar niski) i kształt (obszar wysoki) biomolekuł. (B) Rozkład par elektronów i odległości P(r) wyznaczony na podstawie danych dotyczących rozpraszania sugeruje wydłużony kształt badanych biomolekuł (laminina γ-1, nidogen-1 i ich kompleks). (C) Wykres Kratky'ego sugerujący, że białka nidogenu-1 i lamininy γ-1 nie są sfałdowane. (D) Wykres Guiniera dla nidogenu-1, lamininy γ-1 i ich kompleksu, wskazujący obszar liniowy do wyznaczenia promienia bezwładności przy użyciu danych przy małym kącie rozpraszania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Niskorozdzielcza struktura kompleksu nidogen-1 i lamininy γ-1 uzyskana w wyniku analizy połączonych zbiorów danych za pomocą programu MONSA. Schemat kolorów jest taki sam jak Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Wideo 1. Niskorozdzielcza struktura kompleksu nidogen-1 i lamininy γ-1. Film ten został przygotowany przy użyciu firmy PYMOL w celu zobrazowania różnych cech konstrukcyjnych kompleksu. Struktura krystaliczna kompleksu laminina-nidogen (PDB ID: 1NPE) jest pokazana jako karykatury wstęgowe, podkreślające miejsca oddziaływania tego kompleksu. Schemat kolorów jest taki sam jak Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne etapy analizy danych SAXS opisane w sekcji protokołu tego artykułu obejmują odejmowanie bufora, analizę Guiniera, analizę Kratky'ego, scalanie danych i dystrybucję P(r). Modelowanie ab initio ściegu jest zbyt obszerne, aby można je było tutaj szczegółowo omówić, dlatego jest omówione tylko pokrótce.

W synchrotronach (np. DESY w Niemczech, DIAMOND w Wielkiej Brytanii i ESRF we Francji) możliwe jest zbieranie danych SAXS dla bardzo małego ułamka (~kilka μL) każdej próbki, ponieważ frakcje są eluowane z kolumny s, która jest podłączona w linii (patrz rysunek 1). Elastycznie rozproszone dane SAXS są uśredniane radialnie przy użyciu pakietów dostarczonych przez producenta przyrządu lub przez synchrotron, zanim będzie można odjąć bufor. Otrzymane dane 1D reprezentują ilość rozproszonego światła (In I(q)) na osi Y i kącie rozpraszania (q=4πsinθ/λ, gdzie λ jest długością fali padającego promieniowania rentgenowskiego) i są przedstawione na rysunku 1. Program PRIMUS/qt12 służy do bezpośredniego odejmowania tła ze względu na bufor i jest opisany w rozdziale 1.1. Inne programy, takie jak; ScÅtter43 (do pobrania dostępny pod adresem www.bioisis.net) z samouczkiem dostępnym pod adresem https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, oraz bioXtas RAW44 (dostępny pod adresem https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) mogą być wykorzystywane jako alternatywa dla pakietu ATSAS.

Analiza Guiniera dostarcza informacji na temat agregacji i jednorodności próbki, a także dostarcza promienia bezwładności (Rg) dla makrocząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w oparciu o dane SAXS z obszaru niskiego s 14. Wykres jest konstruowany za pomocą PRIMUS/qt dla danych SAXS uzyskanych z każdego stężenia, a następnie dopasowuje się krzywą z maksymalnym zakresem do 1,30 dla q x Rg. Monorozproszone przygotowanie próbki powinno dać liniowy wykres Guiniera w tym obszarze (rysunek 2D), podczas gdy agregacja daje nieliniowy wykres Guiniera15,16. Jeśli analiza Guiniera jest liniowa, stopień "rozwinięcia" interesującej makrocząsteczki można zaobserwować za pomocą wykresu Kratky'ego, który jest przydatny przy podejmowaniu decyzji, czy wykonać modelowanie ciała sztywnego, czy skonstruować zespoły modeli o niskiej rozdzielczości. Białko kuliste pojawi się na wykresie Kratky'ego jako mające krzywą w kształcie dzwonu, podczas gdy rozszerzone cząsteczki lub niesfałdowane peptydy będą wydawać się stabilizować lub nawet zwiększać w większym zakresie q i nie będą miały kształtu dzwonu (ryc. 2C).

Uzyskanie Rg z analizy Guiniera uwzględnia tylko punkty danych z obszaru niskiego q wykresu punktowego 1D (rysunek 2D), jednak możliwe jest użycie prawie całego zestawu danych do wykonania pośredniej transformacji Fouriera w celu przekształcenia informacji o przestrzeni odwrotnej ln(I(q)) w porównaniu z (q) na funkcję rozkładu odległości w przestrzeni rzeczywistej (P(r)), która dostarcza informacji o D max i Rg (Rysunek 2B) Kształt wykresu P(r) przedstawia konformację całkowitą roztworu makrocząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania18,19. Konwersja danych z przestrzeni wzajemnej na dane w przestrzeni rzeczywistej jest krytycznym krokiem, ale szczegółowy opis nie wchodzi w zakres tego artykułu. Dlatego zapoznaj się z artykułem Svergun20, aby zrozumieć każdy parametr.

Po przetworzeniu danych odjętych przez bufor w poszczególnych stężeniach za pomocą analizy Guiniera ze stałą wartością Rg, a następnie zbadaniu ich wzorca fałdowania za pomocą analizy Kratky'ego, dane te można połączyć. Połączone dane dla nidogenu-1, lamininy γ-1 i ich kompleksu zostały przetworzone w sposób opisany powyżej, a wynikowe wykresy P(r) przedstawiono na rysunku 2B. Idealnie byłoby, gdyby należało również obliczyć funkcję rozkładu par odległości P(r) dla każdego stężenia, aby określić, czy dane SAXS zebrane dla każdego stężenia zapewniają podobne wartości Rg i Dmax . Jeśli Rg i Dmax pozostają podobne w szerokim zakresie stężeń, użytkownik powinien kontynuować. Należy zauważyć, że w zależności od sygnału, dane mogą zostać obcięte przed scaleniem danych. Dzieje się tak często, gdy stężenia i/lub masa cząsteczkowa badanych makrocząsteczek są niskie.

Analiza kształtu w niskiej rozdzielczości za pomocą DAMMIN może być wykonywana w różnych trybach (np. Szybki, Wolny, Ekspert itp.). Tryb szybki jest idealnym pierwszym krokiem do oceny, czy wykres P(r) zapewnia modele dobrej jakości. Zazwyczaj należy uzyskać co najmniej 10 modeli dla każdego wykresu P(r), aby sprawdzić, czy uzyskuje się powtarzalne wyniki pod względem struktury o niskiej rozdzielczości, z parametrem niskiej dobroci dopasowania zwanym χ (wartość 0,5-1,0 jest uważana za dobrą na podstawie naszych obszernych prac), wartością opisującą zgodność między eksperymentalnie zebranymi danymi SAXS a danymi pochodzącymi z modelu. Na potrzeby publikacji zazwyczaj używamy trybu Slow lub Expert i obliczamy co najmniej 15 modeli. Oprócz DAMMINA alternatywą jest również jego szybsza wersja, DAMMIF37, a także GASBOR38. Ponadto do badania kompleksów białko-białko lub białko-kwas nukleinowy możliwe jest wykorzystanie programu MONSA35, który umożliwia jednoczesne dopasowanie poszczególnych danych SAXS zarówno dla makrocząsteczek, jak i ich kompleksu. Aby uzyskać więcej informacji na temat obliczeń modelu o wysokiej rozdzielczości, a także w badaniach interakcji RNA-białko, zapoznaj się z niedawnym artykułem Patela i wsp.3.

SAXS jest teoretycznie prostą, ale niewątpliwie wysoce komplementarną metodą w stosunku do innych narzędzi biologii strukturalnej i daje w rezultacie dane strukturalne o niskiej rozdzielczości, które mogą być wykorzystywane samodzielnie lub w połączeniu z technikami o wysokiej rozdzielczości do wyjaśnienia informacji o strukturze i dynamice makromolekularnej. Tak długo, jak można uzyskać monodyspersyjny preparat makrocząsteczek i ich kompleksów, SAXS może być wykorzystywany do badania struktury w roztworze i interakcji dowolnego typu makrocząsteczek biologicznych. W przypadku omawianego tutaj kompleksu godne uwagi jest to, że mniej niż 10% całkowitej dostępnej powierzchni azotu-1 i lamininy γ-1 jest zakopane w tym kompleksie, podczas gdy reszta domen obu białek jest swobodnie dostępna do interakcji z innymi białkami w macierzy zewnątrzkomórkowej, aby zachować jej sztywność strukturalną (ryc. 3). Uzyskanie takich informacji dla kompleksu o wartości ~240 kDa byłoby bardzo trudne przy użyciu innych technik biologii strukturalnej, takich jak krystalografia rentgenowska, NMR i mikroskopia kriogeniczna.

Odkrywanie struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub NMR jest z natury czasochłonnym procesem. To wąskie gardło w określaniu struktury jest jednym z obszarów, w którym SAXS pokazuje swoją siłę jako technika konstrukcyjna; Akwizycja danych dla pojedynczego eksperymentu SAXS może zająć mniej niż godzinę, a dzięki usprawnionemu oprogramowaniu analitycznemu analiza może być przeprowadzona szybko i wydajnie. SAXS ma potencjał, aby znacznie zwiększyć wydajność badań strukturalnych jako samodzielna technika, ponieważ oferuje model struktury makromolekularnej o niskiej rozdzielczości, zanim dostępne będą dane o wysokiej rozdzielczości. Barierą dla innych technik strukturalnych jest wymóg wysoce czystej, skoncentrowanej próbki do pozyskiwania danych, co wymaga wysokiego poziomu ekspresji białek i stabilności w długim okresie czasu. Podczas gdy próbki SAXS również muszą być czyste i skoncentrowane, objętość próbki wynosi około 100 μl, co sprawia, że SAXS jest stosunkowo niedrogą metodą analizy w porównaniu z innymi technikami strukturalnymi. Co więcej, SAXS w połączeniu z chromatografią wykluczającą wielkość staje się coraz bardziej powszechny, co zapewnia dodatkowy etap kontroli jakości. W ostatnim czasie poczyniono znaczne postępy w łączeniu danych NMR i SAXS przy użyciu metody optymalizacji zespołowej (EOM)45,46 w celu wyjaśnienia elastycznych systemów. W niedawnym artykule Mertensa i Sverguna47 autorzy opisują wiele niedawnych przykładów EOM SAXS w połączeniu z NMR, wraz z wieloma innymi przykładami danych SAXS używanych w połączeniu z NMR. Nieustannie dokonuje się postęp w dziedzinie SAXS i opracowywane są nowe techniki SAXS, które mogą być stosowane w połączeniu z innymi technikami konstrukcyjnymi, a nie tylko jako ich uzupełnienie. W związku z tym uważamy, że zapotrzebowanie na SAXS będzie rosło z czasem, zwłaszcza w połączeniu z NMR w celu scharakteryzowania systemów dynamicznych, w których funkcje są definiowane przez elastyczność.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do zadeklarowania.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został wsparty przez NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) oraz Alberta Prion Research Institute / Alberta Innovates Bio Solutions (201600018) granty przyznane M.O. TRP jest kanadyjskim kierownikiem badań w dziedzinie biofizyki RNA i białek (201704) i potwierdza grant NSERC Discovery (RGPIN-2017-04003). TM jest finansowany z grantu NSERC Discovery dla TRP.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HEK 293 Linia komórkowa EBNADostępność w laboratorium-Linia komórkowa używana do nadekspresji białek
Ni Sepharose Wysokowydajna żywica do oczyszczania białek znakowana histydynąGE Healthcare17524801Żywica do oczyszczania białek Affinity
Superdex 200 Increase 10/300GE Healthcare28990944Kolumna SEC
i Auml; KTA Pure FPLCGEHealthcare-FPLCSystem
NanodropNanodrop-Spectrophotometer
Podstawowe odczynniki (NaCl, Tris-HCl itp.)
S-MAX3000Rigaku-SAXSSystem kamer otworkowych
Zetasizer Nano-SMalvern InstrumentsLtd-Dynamicznyinstrument rozpraszania światła
0,1 i mikro; m FiltrMilliporeJVWP04700Używany do zagęszczania próbki przed DLS
Zestaw do cięcia trombinyabcamab207000Rozszczepienie trombiny w celu usunięcia jego znacznika
Strep-Tactin Sepharose ColumnIBA2-1201-010Strep-Tag Oczyszczanie powinowactwa
D-desthiobiotinSigma-Aldrich533-48-2Elucja białka Strep Tag
Oprogramowanie
SAXGUIRigaku-Gromadzenie danych dla SAXS i redukcji danych
ATSAS SuitFranke et al., 2017-SAXSData Analysis Software Software pakiet programów
PRIMUSKonarev et al., 2003-BufferSubtraction
GNOMSvergun, 1992-Rg, Dmax i p(r)
DAMMIFFranke i Svergun, 2009-Ab initio obliczenia modelu
DAMAVERVolkov i Svergun, 2003-Uśrednioneobliczenia konformacji rozwiązania
MONSASvergun, 1999-Jednoczesnedopasowanie modelu dla złożonego
GASBORSvergun et al., 2001-Alternatywne obliczenia modelu ab initio
Oprogramowanie DTS V6.20Malvern InstrumentsLtd-DLSdostarczyło oprogramowanie przyrządu
PyMOLSchrödinger, LLC.-The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data BankBerman et al., 2000-PDBID: 1NPE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 654-660 (2002).">Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 654-660 (2002).
  2. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).">Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).">Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  4. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins. 41 (3), 415-427 (2000).">Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins. 41 (3), 415-427 (2000).
  5. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemistry. 38 (45), 15009-15016 (1999).">Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemistry. 38 (45), 15009-15016 (1999).
  6. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).">Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).">Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. CRYSOL - a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 768-773 (1995).">Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 768-773 (1995).
  9. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).">Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).">Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. , (2018).">Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).">Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).">Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  14. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281 (8), 1974-1987 (2014).">Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281 (8), 1974-1987 (2014).
  15. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).">Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  16. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36 (2), 147-227 (2003).">Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36 (2), 147-227 (2003).
  17. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).">Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  18. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (2), 429-437 (2013).">Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (2), 429-437 (2013).
  19. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).">Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  20. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29 (7), 565-572 (2010).">Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29 (7), 565-572 (2010).
  21. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31 (2), 135-140 (2012).">Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31 (2), 135-140 (2012).
  22. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19 (3), New York, N.Y. 333-344 (2013).">Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19 (3), New York, N.Y. 333-344 (2013).
  23. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35014-35027 (2013).">Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35014-35027 (2013).
  24. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185 (1), 48-57 (2014).">Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185 (1), 48-57 (2014).
  25. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4504-4514 (2014).">Bacik, J. -P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4504-4514 (2014).
  26. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9 (3), e92545(2014).">Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9 (3), e92545(2014).
  27. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2630-2643 (2015).">Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2630-2643 (2015).
  28. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190 (2), 236-249 (2015).">Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190 (2), 236-249 (2015).
  29. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10 (12), (2015).">Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10 (12), (2015).
  30. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474 (18), 3121-3135 (2017).">Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474 (18), 3121-3135 (2017).
  31. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12 (10), (2017).">Dzananovic, E., Astha, null, Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12 (10), (2017).
  32. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113 (12), 2609-2620 (2017).">Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113 (12), 2609-2620 (2017).
  33. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. , (2018).">Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. , (2018).
  34. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).">Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  35. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 37-54 (2013).">Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 37-54 (2013).
  36. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).">Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34 (1), 33-41 (2001).">Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34 (1), 33-41 (2001).
  38. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (Pt 2), 342-346 (2009).">Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80 (6), 2946-2953 (2001).">Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80 (6), 2946-2953 (2001).
  40. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 658-668 (1996).">Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 658-668 (1996).
  41. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 644-657 (1996).">Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 644-657 (1996).
  42. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424 (6951), 969-974 (2003).">Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -H., Wang, J. -H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424 (6951), 969-974 (2003).
  43. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).">Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).">Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).">Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).">Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).">Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Angle X ray ScatteringSAXS Data AnalysisProtein Protein InteractionsMultidomain Protein ComplexesRadius Gyration AnalysisGuinier AnalysisKratky Plot AnalysisDistance Distribution PlotATSAS Program SuiteSynchrotron Radiation Sources

Related Articles