Tutaj prezentujemy poklatkowy protokół morfometryczny, aby śledzić intensywność kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst podczas interwencji prewitryfikacyjnych i regeneracji po ociepleniu. Zastosowanie protokołu jest możliwe w laboratoriach zapłodnienia pozaustrojowego wyposażonych w mikroskopy poklatkowe i jest zalecane w opracowaniu optymalnej metody witryfikacji blastocyst.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Protokół morfometryczny do obiektywnej oceny zachowania blastocyst podczas etapów witryfikacji i ocieplania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten artykuł opisuje nieinwazyjną metodę morfometrii blastocyst opartą na mikrofotografii poklatkowej do dokładnego monitorowania objętości blastocysty zmieniającej się podczas poszczególnych faz przed i po witryfikacji. Metoda ta może być przydatna w poszukiwaniu najbardziej optymalnego czasu ekspozycji blastocysty na różne stężenia krioprotektantów poprzez obserwację kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst w różnych fazach przed i po witryfikacji. Dzięki tej metodologii można zoptymalizować protokół witryfikacji blastocyst. W celu lepszego wykazania przydatności tej metody morfometrycznej porównano dwa różne protokoły przygotowania blastocyst do witryfikacji; jeden z użyciem sztucznego blastocoelu zapadającego się, a drugi bez tej interwencji przed witryfikacją. Zmiany objętości obu blastocyst są śledzone za pomocą mikrofotografii poklatkowej i mierzone za pomocą narzędzi do edycji zdjęć. Pomiary wykonywane są co 20 sekund w fazach prewitryfikacji oraz co 5 minut w okresie po ociepleniu. Zmiany wymiarów blastocysty na jednostkę czasu są przedstawione graficznie na wykresach liniowych. Wyniki wskazują na długą fazę prewitryfikacji równowagi, w której nienaruszona blastocysta najpierw kurczy się, a następnie powoli ponownie wypełnia blastocoel, wchodząc w witryfikację z blastocoelem wypełnionym płynem. Sztucznie zapadnięta blastocysta pozostaje w stanie skurczenia przez całą fazę równowagi. W fazie witryfikacji również nie zmienia swojej objętości. Ponieważ morfometria blastocyst wykazuje stałą objętość sztucznie zapadniętych blastocyst na etapie prewitryfikacji, wydaje się, że etap ten może być krótszy. Opisany protokół dostarcza wielu dodatkowych parametrów porównawczych zachowania blastocysty w trakcie i po kriokonserwacji na podstawie szybkości i intensywności zmian objętości, liczby częściowych skurczów blastocoelu lub całkowitych zapadnięć blastocysty oraz czasu do całkowitej reekspansji blastocoelu lub czasu do wylęgu.
Wprowadzenie
Kriokonserwacja ludzkich embrionów preimplantacyjnych z programu zapłodnienia in vitro (IVF) jest obecnie rutynową praktyką w większości laboratoriów IVF. Metoda powolnego zamrażania zarodków zaczęła być stosowana klinicznie w 1985 roku, wraz z wprowadzeniem specjalnych krioprotektorów i zamrażarek sterowanych komputerowo, które umożliwiły kontrolowane chłodzenie zarodków do -7 °C, gdy zarodkowanie lodu (wysiew) zostało wywołane w otaczającym podłożu krioprotrotancyjnym1. Poprzez ciągłe chłodzenie kryształki lodu rosłyby, powodując hiperosmolalność pozostałej frakcji ciekłej, a w konsekwencji odwodnienie i kurczenie się komórek embrionalnych. W temperaturze -30 °C lub -80 °C zarodki byłyby zanurzane w ciekłym azocie w celu dłuższego przechowywania. To, co działo się z zarodkami lub oocytami podczas chłodzenia, można było obserwować tylko za pomocą specjalnie dostosowanych kriomikroskopów, co pomogło udoskonalić protokoły kriokonserwacji2. Zamrożenie blastocyst, stadium embrionalne o większej objętości i bardziej płynne, dawało mniej obiecujące wyniki kliniczne w tamtych czasach3.
Przełomem w kriokonserwacji blastocysty było wprowadzenie metody witryfikacji, w której odwodnienie komórek odbywało się przed schłodzeniem za pomocą wysokich stężeń krioprotektantów4. Usunięcie płynu z blastocoelu przed witryfikacją można również osiągnąć poprzez mechaniczne otwarcie między dwiema komórkami trofektodermy5. Chociaż natychmiastowy wskaźnik przeżycia blastocysty po witryfikacji i ociepleniu wynosi ponad 90%, a wynik kliniczny po przeniesieniu zeszklonej/podgrzanej blastocysty do jamy macicy jest prawie porównywalny z wynikami po transferze świeżych zarodków, ta metoda kriokonserwacji nie została jeszcze ustandaryzowana6,7. Protokoły witryfikacji różnią się w zależności od (a) rodzaju i stężenia krioprotektantów, (b) liczby etapów prewitryfikacji, (c) czasu trwania poszczególnych etapów, (d) użycia sztucznego blastocoelu zapadającego się przed witryfikacją lub nie, (e) metod zapadania się, (f) etapu ekspansji blastocysty oraz (g) temperatury równowagi/witryfikacji, w której zarodki powinny być witryfikowane8. Ponieważ krioprotektanty mogą być toksyczne dla komórek, czas ekspozycji blastocyst na te roztwory musi być dobrze określony. Jednak niektórzy producenci pożywek do krioprezerwacji dopuszczają bardzo elastyczne protokoły.
Zainteresowanie naukowców zazwyczaj skupia się na badaniu zdolności do reekspansji blastocyst w celu znalezienia nowych biomarkerów z lepszym przewidywaniem implantacji6,9,10. To, w jaki sposób ludzkie blastocysty odwadniają się na różnych etapach dodawania krioprotektantów przed witryfikacją i co dzieje się z blastocystami po witryfikacji i ociepleniu, kiedy krioprotektanty muszą zostać usunięte z komórek oraz jak blastocysty nawadniają się i ponownie rozszerzają po ociepleniu, nie jest dobrze opisane ani zrozumiałe. Opracowanie metodologii obiektywnego i ilościowego monitorowania zachowania blastocyst podczas różnych etapów kriokonserwacji jest zatem uzasadnione.
Dzięki mikroskopom poklatkowym różnych producentów, możliwe jest teraz monitorowanie zachowania blastocysty w fazie przed i po witryfikacji. Dzięki zastosowaniu dodatkowych narzędzi komputerowych można również wykonywać pomiary ich wielkości (morfometria). Mierząc zmniejszanie się lub zwiększanie wielkości zarodka w danym momencie, możliwe jest obiektywizowanie oceny morfodynamiki zarodków podczas odwodnienia i ponownego nawodnienia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Krajową Komisję Etyki Medycznej w dniu 19 kwietnia 2016 r. (nr 0120–204/2016–2).
1. Konfiguracja systemu rejestracji mikroskopowej
- Wyłącz płytę grzewczą mikroskopu.
- Przed każdym zabiegiem zrób zdjęcie blastocysty pod mikroskopem odwróconym wyposażonym w kamerę. Pamiętaj, aby zwrócić uwagę na powiększenie, w jakim zarejestrowano blastocystę.
2. Selekcja i wstępne przygotowanie blastocyst do witryfikacji
- Do kriokonserwacji należy wybrać tylko w pełni rozwinięte blastocysty dnia 5 lub 6 z co najmniej kilkoma komórkami wewnętrznej masy komórkowej (ICM) i spójną trofektodermą.
- W przypadku blastocyst leczonych laserowo z zapadniętym blastocoelem należy poddać blastocystę krótkiemu impulsowi laserowemu (0,4 - 0,7 ms) o średnicy otworu w zakresie od 4,3 do 9,4 μm, stycznie skierowanej na osłonę przejrzystą i na połączenie dwóch sąsiednich komórek trofektodermalnych. Pozwól blastocyście całkowicie lub częściowo się zapadnąć przez 5 minut.
- W przypadku nieleczonych blastocyst z nienaruszonym blastocoelem nie należy wykonywać specjalnego zabiegu przed witryfikacją.
Uwaga: Te blastocysty są uważane za nienaruszone.
3. Przygotowanie krioprotektantu i szalki Petriego do fazy równowagi
- Za pomocą pipety do denudacji oocytów (średnica 135 μm) należy użyć pipety do aseptycznego napełnienia pożywki równoważącej (pożywki buforowanej M-199 HEPES z 7,5% DMSO, 7,5% glikolu etylenowego, 20% DSS) do otworów w obszarze mikrokropelek 9-dołkowej szalki Petriego specjalnie zaprojektowanej do mikroskopii poklatkowej i zapisu.
Uwaga: Denudacja oocytów to proces usuwania komórek wzgórka otaczającego oocyt. Użycie pipety do denudacji oocytów pomoże uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. - Pokryć obszar mikrokropel 30 μl pożywki równoważącej.
4. Transfer blastocysty w roztworze równowagi
- Zanurz poddaną działaniu lasera lub nienaruszoną blastocystę w pożywce równowagi na dnie obszaru mikrokropelek naczynia z mikrokroplami na 10 minut w temperaturze pokojowej (faza równowagi).
- Rozpocznij 10-minutowe odliczanie, gdy tylko blastocysta zostanie przeniesiona do pożywki równoważącej.
5. Rejestracja blastocysty w fazie równowagi
- Przenieś naczynie z mikrokropelkami z blastocystą do mikroskopu wyposażonego w kamerę. Użyj tego samego powiększenia, co poprzednio, aby zrobić zdjęcie tej samej blastocysty. Ustaw naczynie z mikrokroplami tak, aby blastocysta znajdowała się mniej więcej w środku nagrania.
- Rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do nagrywania mikroskopu. Zanotuj czas odliczania, w którym rozpoczyna się nagrywanie.
Uwaga: Zobacz reprezentatywne wyniki nagrań nienaruszonej (Rysunek 1, Wideo 1) i zapadniętej blastocysty (Rycina 2, Wideo 2) podczas 10-minutowej ekspozycji na roztwór równoważący .
6. Witryfikacja blastocysty
- Aseptyczne dozowanie kropli 50 μl roztworu witryfikacyjnego (pożywka buforowana przez M-199 HEPES z 15% DMSO, 15% glikolem etylenowym, 20% DSS, 0,5 M sacharozy) na szalce Petriego na 2 minuty przed zakończeniem odliczania.
- Zatrzymaj nagrywanie, gdy skończy się 10-minutowe odliczanie i szybko przenieś blastocystę do roztworu witryfikacyjnego na 30 sekund w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie odpipetować blastocystę co najmniej 1x w roztworze witryfikacyjnym.
- Użyj słomki do witryfikacji do załadowania blastocysty. Załadować, uszczelnić i zanurzyć słomkę do zeszklenia w ciekłym azocie (LN) w ciągu 80 s, nie dłużej niż 110 s po początkowym narażeniu na roztwór witryfikacyjny.
7. Edycja wideo zarejestrowanej blastocysty podczas fazy równowagi
- Zaimportuj nagrany plik wideo do oprogramowania do edycji wideo.
- Przesuń suwak osi czasu na 20 s. Zanotuj w tym momencie numer klatki.
Uwaga: Ta liczba zostanie użyta do zdziesiątkowania niepotrzebnych klatek wideo. Używane będą tylko ramki co 20 sekund. - Kliknij kartę Wideo, a następnie liczbę klatek na sekundę.... W obszarze Konwersja liczby klatek na sekundę zaznacz pole Dziesiątkuj według i wprowadź wcześniej zanotowany numer klatki. Potwierdź, klikając OK. Kliknij pozycję Plik→ Eksportuj → sekwencję obrazów.
- Wybierz JPEG jako format wyjściowy, ustaw katalog tak, aby zawierał zapisaną sekwencję obrazów, a następnie kliknij OK.
Uwaga: Spowoduje to utworzenie katalogu z maksymalnie 30 obrazami zarejestrowanej blastocysty w sekwencji podczas fazy równowagi witryfikacji.
8. Pomiary pola przekroju poprzecznego blastocysty na podstawie obrazów utworzonych podczas fazy równowagi
- Otwórz oprogramowanie do analizy wideo. Kliknij kartę Okno i wybierz opcję Oś czasu.
- W okienku Oś czasu kliknij znak paska filmu i wybierz Dodaj nośnik..., aby dodać obraz blastocysty przed fazą równowagi witryfikacji - i przed interwencją laserową, jeśli taka wystąpiła.
Uwaga: Ten obraz pokaże blastocystę w jej najbardziej rozszerzonym stanie, a jej pole przekroju poprzecznego posłuży jako odniesienie. - Dodaj sekwencję obrazu odpowiedniej blastocysty wygenerowaną wcześniej za pomocą oprogramowania do edycji wideo (fazy równowagi witryfikacji).
- Przejdź do pozycji Image → Analysis → Wybierz pozycję Data Points → Custom (Wybierz punkty danych) , aby otworzyć okno Select data points (Wybierz punkty danych).
- Usuń zaznaczenie wszystkich punktów danych, a następnie wybierz tylko Obszar i potwierdź, klikając przycisk OK.
- Przesuń suwak osi czasu w oknie Oś czasu do pierwszego obrazu.
- Kliknij kartę Okno i wybierz polecenie Narzędzia.
Uwaga: Spowoduje to aktywację panelu Narzędzia po lewej stronie. - Wybierz narzędzie Szybkie zaznaczanie.
- Umieść znacznik narzędzia wewnątrz blastocysty tak, aby dotykał krawędzi blastocysty. Obrysuj blastocystę, umieszczając znacznik narzędzia na zewnętrznej krawędzi blastocysty, klikając i przytrzymując lewy przycisk myszy, a następnie przeciągając znacznik narzędzia wzdłuż zewnętrznej krawędzi blastocysty, aż zostanie zaznaczony cały obszar przekroju poprzecznego blastocysty.
Uwaga: Strefa przejrzysta nie jest częścią pomiaru, więc musi zostać wykluczona (Rysunek 5). - W oknie Oś czasu kliknij Dziennik pomiarów i naciśnij przycisk Rejestruj pomiary.
Uwaga: Spowoduje to zarejestrowanie wybranego obszaru. - Wróć do osi czasu, kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Odznacz.
- Przesuń suwak osi czasu na następny obraz i kliknij odpowiedni kafelek pod nim.
- Obrysuj blastocystę na nowym obrazie za pomocą narzędzia Szybkie zaznaczanie. Powtórz pomiar.
- Powtarzaj tę procedurę (kroki 8.9 - 8.13) obraz po obrazie, aż wszystkie pola przekroju poprzecznego obrazów zostaną zmierzone i zarejestrowane.
- Na koniec przejdź do Measurements Log, wybierz wszystkie pomiary pod zmienną Area i wyeksportuj je do pliku .txt.
Uwaga: Jednostkami pola przekroju poprzecznego są piksele kwadratowe.
9. Edycja pliku danych z zarejestrowanymi obszarami przekroju blastocysty na podstawie obrazów utworzonych podczas fazy równoważenia
- Przenieś dane zarejestrowanych pól przekroju poprzecznego blastocysty z pliku .txt do edytora arkuszy kalkulacyjnych.
- Użyj pierwszej wartości pola przekroju poprzecznego jako wartości odniesienia 1 i wyraź (przekształć) wszystkie inne wartości tak, aby stanowiły ułamek tej wartości odniesienia.
- Utwórz nową zmienną Area_r i wklej pod nią transkodowane wartości obszaru (z wyjątkiem wartości odniesienia).
- Obok zmiennej Area_r utwórz zmienną Time i dodaj pierwszą wartość time.
Uwaga: Pierwsza wartość czasu reprezentuje czas, który upłynął od momentu, w którym blastocysta została wystawiona na działanie roztworu równoważącego, do rozpoczęcia rejestracji pod mikroskopem wyposażonym w kamerę. - Oblicz każdą następną kolejną wartość czasu, dodając 20 s do poprzedniej wartości czasu.
Uwaga: Jest to przedział czasu używany do dziesiątkowania niepotrzebnych klatek wideo utworzonych podczas nagrywania.
10. Ocieplenie blastocysty
- Przygotuj podłoże do ocieplenia.
- Dzień przed podgrzaniem blastocysty należy aseptycznie dozować trzy krople pożywki regeneracyjnej o pojemności 150 μl w naczyniu z 4 dołkami. Należy również aseptycznie dozować pożywkę regeneracyjną w 9-dołkowym naczyniu z mikrokroplami, specjalnie zaprojektowanym do mikroskopii poklatkowej i rejestracji. Przykryć pożywkę odzysku olejem parafinowym i wstępnie inkubować w temperaturze 37 °C z 6% CO2 i 5% O2,
Uwaga: Pożywka regeneracyjna to pożywka hodowlana dla zarodków w stadium blastocysty z dodatkiem albuminy surowicy ludzkiej (HSA). HSA w pożywce regeneracyjnej powinna wynosić 12 mg/ml. Aby wypełnić otwory w naczyniu 9-dołkowym, użyj pipety do denudacji oocytów, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, a następnie pokryj obszar mikrokropelki 30 μl pożywki regeneracyjnej. - W dniu podgrzania blastocysty należy aseptycznie dozować 500 μl roztworu do rozmrażania (TS) do pojedynczego dołka w 4-dołkowym naczyniu i pozostawić do ogrzania do 37 °C w inkubatorze bez CO2 .
- W temperaturze pokojowej należy w sposób aseptyczny dozować jedną kroplę roztworu rozcieńczającego (DS) o pojemności 50 μl i dwie krople roztworu myjącego (WS) o objętości 50 μl na sterylnej szalce Petriego. Przykryj krople DS oraz WS1 i WS2 olejem parafinowym.
Uwaga: Zamiast szalki Petriego można również użyć szalki 4-dołkowej.
- Dzień przed podgrzaniem blastocysty należy aseptycznie dozować trzy krople pożywki regeneracyjnej o pojemności 150 μl w naczyniu z 4 dołkami. Należy również aseptycznie dozować pożywkę regeneracyjną w 9-dołkowym naczyniu z mikrokroplami, specjalnie zaprojektowanym do mikroskopii poklatkowej i rejestracji. Przykryć pożywkę odzysku olejem parafinowym i wstępnie inkubować w temperaturze 37 °C z 6% CO2 i 5% O2,
- Ogrzej blastocystę.
- Zidentyfikuj słomkę HSV z zeszkloną blastocystą, która ma zostać usunięta z magazynu LN i szybko przenieś słomkę do przenośnego zbiornika wypełnionego LN w ramach przygotowań do procedury ocieplania.
- Podnieś słomkę za pomocą kleszczy, tylko na tyle, aby odsłonić kolorowy pręt manipulacyjny. Użyj samoregulującego się ściągacza izolacji, aby przeciąć słomę na wysokości kolorowego pręta manipulacyjnego.
- Chwyć pręt manipulacyjny i wyjmij go ze słomy szybkim, ale kontrolowanym ruchem, a następnie natychmiast zanurz zakrzywioną szpatułkę pręta manipulacyjnego w TS o temperaturze 37 °C.
- Delikatnie zakręć prętem manipulacyjnym, aby odłączyć blastocystę i pozostaw ją na łącznie 1 minutę w TS.
- W temperaturze pokojowej przenieś blastocystę kolejno do DS, WS1 i WS2 przez 4 minuty w każdym pożywce.
- Po procedurze rozgrzewania przenieś blastocystę do 4-dołkowego naczynia z pożywką regeneracyjną i umyj ją we wszystkich trzech kroplach, delikatnie pipetując.
Uwaga: Mycie odbywa się w ciągu około 1 minuty. - Przenieś blastocystę do poklatkowego naczynia 9-dołkowego z pożywką regeneracyjną. Umieścić 9-dołkową szalkę pod kamerą poklatkową w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 6% CO2 i 5% O2 ).
Uwaga: Procedura podgrzewania, która jest kontynuowana po umieszczeniu 9-dołkowej czaszy pod kamerą poklatkową w inkubatorze, trwa około 17 minut.
11. Nagranie poklatkowe ponownego rozprężania blastocysty podczas rekonwalescencji po ociepleniu
- Uruchom oprogramowanie do nagrywania poklatkowego.
- Wybierz kamerę nagrywającą.
- Naciśnij przycisk trybu na żywo.
- Umieść kursor myszy na obrazie i użyj przycisku przewijania, aby go powiększyć. Kliknij i przytrzymaj lewy przycisk myszy i przesuń kursor, aby umieścić studnię z blastocystą na środku ekranu.
- W obszarze Ostrość użyj zielonych strzałek góra-dół, aby ustawić ostrość płaszczyzny nagrywania blastocysty. W obszarze Intensywność światła ustaw intensywność światła.
- Kliknij przycisk Parametry mikroskopu, aby ustawić Czas ekspozycji i Gamma.
- Naciśnij Zamknij tryb na żywo.
- Naciśnij przycisk Rozpocznij projekt i wprowadź dane projektu, wybierz rodzaj naczynia hodowlanego (3 x 3 lub 4 x 4) i odznacz wszystkie pozycje oprócz tej, która ma być nagrywana.
- Ustaw czas robienia zdjęcia, aby robić zdjęcie co 5 minut.
- Rozpocznij nagrywanie, naciskając przycisk Zatwierdź. Nagrywaj co najmniej 150 minut.
- Zatrzymaj nagrywanie, naciskając przycisk Zatrzymaj projekt.
Uwaga: Zobacz reprezentatywne wyniki rejestracji nienaruszonej (Ryc. 3) i zapadniętej blastocysty (Rycina 4) podczas okresu rekonwalescencji po ociepleniu.
12. Edycja wideo zarejestrowanej blastocysty podczas reekspansji po ociepleniu
- Przejdź do folderu projektu i znajdź nagrane obrazy o rozmiarze około 80 KB.
- Utwórz kolejny folder i przenieś do niego te obrazy. Zmień nazwy obrazów w liczbach zgodnie z czasem utworzenia. Zaimportuj je do oprogramowania do edycji wideo jako sekwencję obrazów.
- Przejdź do zakładki Wideo → Filtr → Dodaj i wybierz Filtr przekształcenia o wartości null.
- Kliknij przycisk Kadrowanie po prawej stronie i przytnij obraz, pozostawiając widoczne tylko pole z nagraną blastocystą. Potwierdź przyciskiem OK i ponownie przyciskiem OK.
- Kliknij Plik→ Eksportuj → Sekwencja obrazów. Wybierz JPEG jako format wyjściowy, ustaw katalog tak, aby zawierał zapisaną sekwencję obrazów, a następnie kliknij OK.
Uwaga: Spowoduje to utworzenie obrazów o zmienionym rozmiarze (przyciętych) przygotowanych do dalszych pomiarów w oprogramowaniu do analizy wideo.
13. Ustawienie skali pomiarowej w oprogramowaniu do analizy wideo dla obrazów utworzonych za pomocą oprogramowania do nagrywania poklatkowego
- Uruchom Analyzer oprogramowania do nagrywania poklatkowego.
- Otwórz projekt z nagraną blastocystą.
- Kliknij przycisk Analizuj na polu z zarejestrowanym blastocyst.
Uwaga: Otworzy się nowe okno Analizuj. Kliknij przycisk Pomiar, aby wyświetlić narzędzie pomiarowe. - Użyj narzędzia pomiarowego, aby zmierzyć szerokość całego obrazu.
- Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i zapisz go. We właściwościach sprawdź szerokość obrazu w pikselach.
- Podziel rzeczywistą szerokość obrazu przez jego szerokość w pikselach.
Uwaga: Spowoduje to obliczenie rzeczywistej długości pojedynczego piksela na tym obrazie. - Uruchom oprogramowanie do analizy wideo.
- Kliknij kartę Okno i wybierz opcję Oś czasu.
- W okienku Oś czasu kliknij znak paska filmu i wybierz Dodaj nośnik..., aby dodać sekwencję obrazów ponownie rozszerzającej się blastocysty po ociepleniu.
- Kliknij opcję Image → Analysis (Analiza obrazu ), → Ustaw skalę pomiaru → Niestandardową, aby otworzyć okno Measurement Scale (Skala pomiaru). W polu Długość piksela wprowadź wartość 1; w polu Długość logiczna wprowadź wcześniej obliczoną rzeczywistą długość piksela (krok 13.6); W polu Jednostki logiczne wprowadź μm. Zapisz ustawienie wstępne.
14. Pomiary pola przekroju poprzecznego blastocysty na podstawie obrazów utworzonych podczas reekspansji po ociepleniu
- Po ustawieniu skali pomiaru i zaimportowaniu sekwencji obrazów zmierz pola przekroju poprzecznego blastocysty w taki sam sposób, jak opisano w kroku 8, z tą różnicą, że zmierzone pola przekroju poprzecznego w tych pomiarach mają jednostki w μm2.
15. Edycja pliku danych z zarejestrowanymi obszarami przekroju poprzecznego blastocysty na podstawie obrazów utworzonych podczas reekspansji po ociepleniu
- Przenieś dane zarejestrowanych pól przekroju poprzecznego blastocysty z pliku .txt do edytora arkuszy kalkulacyjnych.
- Utwórz zmienną Time obok zmiennej Area i dodaj pierwszą wartość time.
Uwaga: W tym przypadku pierwsza wartość czasu jest ustawiona na 0 minut, co oznacza początek nagrywania poklatkowego. Każda następna kolejna wartość czasu jest obliczana przez dodanie 5 minut do poprzedniej wartości czasu. Pięć minut to odstęp czasu używany między dwoma kolejnymi nagraniami poklatkowymi.
16. Tworzenie diagramu liniowego
- Zaimportuj plik danych arkusza kalkulacyjnego w oprogramowaniu do analizy statystycznej w celu utworzenia wykresu czasowego zmian pola przekroju poprzecznego blastocysty w czasie podczas fazy równowagi witryfikacji lub reekspansji po ociepleniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W ramach prezentacji przedstawiliśmy morfodynamikę blastocysty jedynie w jednej fazie przed witryfikacją oraz jednej fazie po odgrzewaniu. Różnica w objętości blastocysty na koniec fazy równoważenia i na początku regeneracji w pożywce hodowlanej ukazała intensywność kurczenia się zarodka, która w rzeczywistości odzwierciedla stopień ochrony zarodka przed krystalizacją lodu.
Jak można zauważyć z Rycina 1
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół obserwacji morfodynamiki blastocyst w trakcie i po kriokonserwacji można również przeprowadzić przy użyciu podobnych przyrządów i narzędzi programowych innych producentów. Systemy poklatkowe dostosowane do embriologii pozwalają na ciągłe monitorowanie rozwoju zarodka. Celem pracy było wprowadzenie kwantyfikacji zachowania blastocyst podczas przygotowania blastocyst do witryfikacji oraz po ich ociepleniu. Dokonano tego poprzez obiektywny pomiar zmian w morfologii w skali czasowej. Uzyskane wyniki tych pomiarów mo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest częścią programu badawczego P3-0327 i projektu badawczego J3-7177, założonego przez Słoweńską Fundację Badawczą.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop odwrócony Eclipse TE2000-U | Nikon, Japonia | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Dania | / | |
| Aparat cyfrowy DC1 | Research Instruments, Origio, Dania | / | |
| Aparat cyfrowy DC2 | Research Instruments, Origio, Dania | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Dania | / | oprogramowanie do nagrywania mikroskopu |
| Inkubator z 6% CO2, 5% | O2 Spoiwo, Niemcy | / | |
| Mikroskop Primo Vision | Vitrolife, Szwecja | 16600 | |
| Oprogramowanie Primo Vision Capture | Vitrolife, Szwecja | 16608 | oprogramowanie do nagrywania poklatkowego |
| Adobe Photoshop CS6 Extended Adobe | Systems Incorporated, USA/ | oprogramowanie do analizy wideo | |
| VirtualDub | Avery Lee | / | oprogramowanie do edycji wideo |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA/ | edytor arkuszy kalkulacyjnych | |
| Naczynie hodowlane PrimoVision | Vitrolife, Szwecja | 16604 | |
| G2-plus podłoże | Vitrolife, Szwecja | 10132 | pożywka hodowlana dla zarodków w stadium blastocysty |
| Albuminy surowicy ludzkiej | Vitrolife, Szwecja | 10064 | |
| Olej parafinowy | Vitrolife, Szwecja | 10029 | |
| Pożywka roztworu równowagowego | Irvine Scientific, Irlandia | 90131 | |
| Pożywka z roztworem do witryfikacji | Irvine Scientific, Irlandia | 90132 | |
| Pożywka z roztworem do rozmrażania | Irvine Scientific, Irlandia | 90134 | |
| Podłoże roztworu do rozcieńczania | Irvine Scientific, Irlandia | 90135 | |
| Medium z roztworem do mycia | Irvine Scientific, Irlandia | 90136 | |
| Słomki do witryfikacji HSV | CryoBio System, Francja | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Naczynie z ciekłym azotem | / | ||
| kriozytorem Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Niemcy | 229286 | |
| Zbiornik kriogeniczny | Cryotherm, Niemcy | ||
| Kleszcze | / | ||
| Nożyczki | / | / | |
| Pipet do manipulacji blastocystami | Gynetics, Belgia | ID275/10 | średnica 275 &mikro; m |
| Pipeta do denudacji oocytów | Vitromed, Niemcy | V-DEN-135 | średnica 135 &mikro; m |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Cyfrowy zegar interwałowy Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA/ | oprogramowanie do analizy statystycznej | |
| Samonastawny ściągacz izolacji | Knipex, Niemcy | 1262180 |
Bibliografia
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647(1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99(2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
