Protokół morfometryczny do obiektywnej oceny zachowania blastocyst podczas etapów witryfikacji i ocieplania

Summary

Tutaj prezentujemy poklatkowy protokół morfometryczny, aby śledzić intensywność kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst podczas interwencji prewitryfikacyjnych i regeneracji po ociepleniu. Zastosowanie protokołu jest możliwe w laboratoriach zapłodnienia pozaustrojowego wyposażonych w mikroskopy poklatkowe i jest zalecane w opracowaniu optymalnej metody witryfikacji blastocyst.

Abstract

Ten artykuł opisuje nieinwazyjną metodę morfometrii blastocyst opartą na mikrofotografii poklatkowej do dokładnego monitorowania objętości blastocysty zmieniającej się podczas poszczególnych faz przed i po witryfikacji. Metoda ta może być przydatna w poszukiwaniu najbardziej optymalnego czasu ekspozycji blastocysty na różne stężenia krioprotektantów poprzez obserwację kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst w różnych fazach przed i po witryfikacji. Dzięki tej metodologii można zoptymalizować protokół witryfikacji blastocyst. W celu lepszego wykazania przydatności tej metody morfometrycznej porównano dwa różne protokoły przygotowania blastocyst do witryfikacji; jeden z użyciem sztucznego blastocoelu zapadającego się, a drugi bez tej interwencji przed witryfikacją. Zmiany objętości obu blastocyst są śledzone za pomocą mikrofotografii poklatkowej i mierzone za pomocą narzędzi do edycji zdjęć. Pomiary wykonywane są co 20 sekund w fazach prewitryfikacji oraz co 5 minut w okresie po ociepleniu. Zmiany wymiarów blastocysty na jednostkę czasu są przedstawione graficznie na wykresach liniowych. Wyniki wskazują na długą fazę prewitryfikacji równowagi, w której nienaruszona blastocysta najpierw kurczy się, a następnie powoli ponownie wypełnia blastocoel, wchodząc w witryfikację z blastocoelem wypełnionym płynem. Sztucznie zapadnięta blastocysta pozostaje w stanie skurczenia przez całą fazę równowagi. W fazie witryfikacji również nie zmienia swojej objętości. Ponieważ morfometria blastocyst wykazuje stałą objętość sztucznie zapadniętych blastocyst na etapie prewitryfikacji, wydaje się, że etap ten może być krótszy. Opisany protokół dostarcza wielu dodatkowych parametrów porównawczych zachowania blastocysty w trakcie i po kriokonserwacji na podstawie szybkości i intensywności zmian objętości, liczby częściowych skurczów blastocoelu lub całkowitych zapadnięć blastocysty oraz czasu do całkowitej reekspansji blastocoelu lub czasu do wylęgu.

Introduction

Kriokonserwacja ludzkich embrionów preimplantacyjnych z programu zapłodnienia in vitro (IVF) jest obecnie rutynową praktyką w większości laboratoriów IVF. Metoda powolnego zamrażania zarodków zaczęła być stosowana klinicznie w 1985 roku, wraz z wprowadzeniem specjalnych krioprotektorów i zamrażarek sterowanych komputerowo, które umożliwiły kontrolowane chłodzenie zarodków do -7 °C, gdy zarodkowanie lodu (wysiew) zostało wywołane w otaczającym podłożu krioprotrotancyjnym¹. Poprzez ciągłe chłodzenie kryształki lodu rosłyby, powodując hiperosmolalność pozostałej frakcji ciekłej, a w konsekwencji odwodnienie i kurczenie się komórek embrion....

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Krajową Komisję Etyki Medycznej w dniu 19 kwietnia 2016 r. (nr 0120–204/2016–2).

1. Konfiguracja systemu rejestracji mikroskopowej

1. Wyłącz płytę grzewczą mikroskopu.
2. Przed każdym zabiegiem zrób zdjęcie blastocysty pod mikroskopem odwróconym wyposażonym w kamerę. Pamiętaj, aby zwrócić uwagę na powiększenie, w jakim zarejestrowano blastocystę.

2. Selekcja i wstępne przygotowanie blastocyst do witryfikacji

1. Do kriokonserwacji należy wybrać tylko w pełni rozwinięte blastocysty dnia 5 lub 6 z co najmniej kilkoma komórkami ....

Results

W demonstracji pokazaliśmy morfodynamikę blastocyst tylko w jednej fazie prewitryfikacji i jednej po ociepleniu. Różnica w objętości blastocysty pod koniec fazy równowagi i na początku regeneracji w pożywce hodowlanej wykazała intensywność kurczenia się zarodka, która jest w rzeczywistości intensywnością konserwacji zarodka przed krystalizacją lodu.

Jak można zauważyć z Rysunek 1 i Wideo 1

Discussion

Protokół obserwacji morfodynamiki blastocyst w trakcie i po kriokonserwacji można również przeprowadzić przy użyciu podobnych przyrządów i narzędzi programowych innych producentów. Systemy poklatkowe dostosowane do embriologii pozwalają na ciągłe monitorowanie rozwoju zarodka. Celem pracy było wprowadzenie kwantyfikacji zachowania blastocyst podczas przygotowania blastocyst do witryfikacji oraz po ich ociepleniu. Dokonano tego poprzez obiektywny pomiar zmian w morfologii w skali czasowej. Uzyskane wyniki tych pomiarów mo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop odwrócony Eclipse TE2000-U	Nikon, Japonia	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Dania	/
Aparat cyfrowy DC1	Research Instruments, Origio, Dania	/
Aparat cyfrowy DC2	Research Instruments, Origio, Dania	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Dania	/	oprogramowanie do nagrywania mikroskopu
Inkubator z 6% CO2, 5%	O2 Spoiwo, Niemcy	/
Mikroskop Primo Vision	Vitrolife, Szwecja	16600
Oprogramowanie Primo Vision Capture	Vitrolife, Szwecja	16608	oprogramowanie do nagrywania poklatkowego
Adobe Photoshop CS6 Extended Adobe	Systems Incorporated, USA/		oprogramowanie do analizy wideo
VirtualDub	Avery Lee	/	oprogramowanie do edycji wideo
Microsoft Office Excell	Microsoft, USA/		edytor arkuszy kalkulacyjnych
Naczynie hodowlane PrimoVision	Vitrolife, Szwecja	16604
G2-plus podłoże	Vitrolife, Szwecja	10132	pożywka hodowlana dla zarodków w stadium blastocysty
Albuminy surowicy ludzkiej	Vitrolife, Szwecja	10064
Olej parafinowy	Vitrolife, Szwecja	10029
Pożywka roztworu równowagowego	Irvine Scientific, Irlandia	90131
Pożywka z roztworem do witryfikacji	Irvine Scientific, Irlandia	90132
Pożywka z roztworem do rozmrażania	Irvine Scientific, Irlandia	90134
Podłoże roztworu do rozcieńczania	Irvine Scientific, Irlandia	90135
Medium z roztworem do mycia	Irvine Scientific, Irlandia	90136
Słomki do witryfikacji HSV	CryoBio System, Francja	025246, 025249, 025250, 025248
Naczynie z ciekłym azotem	/
kriozytorem Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Niemcy	229286
Zbiornik kriogeniczny	Cryotherm, Niemcy
Kleszcze		/
Nożyczki	/	/
Pipet do manipulacji blastocystami	Gynetics, Belgia	ID275/10	średnica 275 &mikro; m
Pipeta do denudacji oocytów	Vitromed, Niemcy	V-DEN-135	średnica 135 &mikro; m
Pipettor EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Cyfrowy zegar interwałowy Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, USA/		oprogramowanie do analizy statystycznej
Samonastawny ściągacz izolacji	Knipex, Niemcy	1262180