Artykuł metodologiczny

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58547

⸱

3 listopada 2018

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Old Dominion University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Streszczenie

Enzymy kinazy i pirofosfokinazy przenoszą ugrupowanie gamma fosforanu lub beta-gamma pirofosforanu z nukleotydowych prekursorów trifosforanu na substraty, aby wytworzyć produkty fosforylowane. Zastosowanie prekursorów NTP znakowanych γ-32-P pozwala na jednoczesne monitorowanie wykorzystania substratu i tworzenia produktu za pomocą radiografii. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) na płytkach celulozowych umożliwia szybkie rozdzielanie i czułe oznaczanie ilościowe substratu i produktu. Przedstawiono metodę wykorzystania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania aktywności pirofosfokinazy oczyszczonej syntetazy (p)ppGpp. Metoda ta była wcześniej stosowana do charakteryzowania aktywności cyklicznych syntetaz nukleotydowych i dinukleotydowych i jest szeroko odpowiednia do charakteryzowania aktywności dowolnego enzymu, który hydrolizuje wiązanie trifosforanu nukleotydu lub przenosi końcowy fosforan z donora fosforanu do innej cząsteczki.

Wprowadzenie

Enzymy kinazy i pirofosfokinazy (lub difosfokinazy) przenoszą fosforany z prekursorów trifosforanu nukleotydów (NTP) do cząsteczek substratu. Substraty mogą obejmować inne nukleotydy, aminokwasy lub białka, węglowodany i lipidy1. Analizy bioinformatyczne mogą czasami przewidywać pokrewny substrat lub substraty enzymu na podstawie podobieństwa do scharakteryzowanych enzymów, ale walidacja eksperymentalna jest nadal konieczna. Podobnie, powinowactwo enzymu do jego substratu (substratów) i szybkość, z jaką katalizuje reakcję przenoszenia fosforu, a także wpływ kofaktorów, inhibitorów lub innych efektorów enzymatycznych muszą być określone doświadczalnie. Aby uniknąć zubożenia prekursora ATP przez inne enzymy zużywające ATP obecne w cytoplazmie bakteryjnej, ilościowe testy aktywności wymagają oczyszczonego białka.

Oczyszczanie białek metodą chromatografii powinowactwa do metali zostało dokładnie omówione w literaturze2,3. Znaczniki histydyny składające się z sześciu kolejnych reszt histydyny dołączonych do N- lub C-końca rekombinowanego białka umożliwiają szybkie oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa do metali4,5,6. Sekwencje te są małe w porównaniu z białkami, które modyfikują i zazwyczaj mają minimalny wpływ na funkcję białka, chociaż czasami mogą zmieniać stabilność białka i/lub kinetykę enzymów7,8. Znaczniki histydyny na końcach N i C tego samego białka mogą mieć różne skutki, które są trudne do przewidzenia bez znajomości struktury danego białka. Znaczniki histydyny są zwykle włączane podczas klonowania rekombinowanego białka poprzez projektowanie starterów, które kodują sześć reszt histydyny, albo natychmiast 3' do kodonu start ATG, albo natychmiast 5' do kodonu stop otwartej ramki odczytu. Po amplifikacji gen zawierający heksahistydynę jest ligowany do wektora pod kontrolą indukowalnego promotora i ulega ekspresji, zwykle w laboratoryjnym szczepie E. coli. Białko rekombinacyjne można następnie wyizolować na żywicy powinowactwa zawierającej unieruchomione kationy dwuwartościowe (zwykle nikiel lub kobalt)9. Zanieczyszczenie natywnych białek wiążących metale może być usunięte przez miareczkowanie imidazolem, który konkurencyjnie wypiera związane białko2. Na koniec białko docelowe jest eluowane z kolumny o wyższych stężeniach imidazolu. Istnieje kilka komercyjnych źródeł immobilizowanych żywic kationowych metali, a producenci podają zalecenia dotyczące warunków buforowych i stężeń imidazolu. Po elucji białko może być analizowane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), dializowane lub natychmiast stosowane w testach funkcjonalnych.

Istnieje kilka metod pośredniego monitorowania aktywności kinazy poprzez sprzężenie hydrolizy wiązania fosforanowego ATP z drugą reakcją, która uwalnia lub wzbudza fluorofor lub generuje chemiluminescencję, ale te reakcje mają wiele ruchomych części i mogą być logistycznie trudne10. Najprostszym sposobem szczegółowego pomiaru aktywności transferu fosforu jest bezpośrednie monitorowanie transferu znakowanej radioaktywnie grupy fosforanowej z komercyjnie dostępnego prekursora γ-32-P NTP do nieznakowanego radioaktywnie substratu11,12,13. Mieszaniny substratów i produktów znakowanych radioaktywnie można rozdzielać i oznaczać ilościowo metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). TLC wykorzystuje zróżnicowaną ruchliwość substancji rozpuszczonych w danym rozpuszczalniku, umożliwiając rozpuszczalnikowi (fazie ciekłej) migrację poprzez działanie kapilarne po powierzchni (fazie stałej), na której mieszanina substancji rozpuszczonych została zaadsorbowana14. Substancje rozpuszczone, które są małe i/lub nie mają korzystnych oddziaływań z fazą stałą, będą migrować na większe odległości od swojej początkowej lokalizacji niż substancje rozpuszczone o większej masie cząsteczkowej lub dużym powinowactwie do ciała stałego. W celu zbadania transferu fosforu, ugrupowania fosforanowe zwiększają masę cząsteczkową cząsteczek, do których są dodawane, i dodają ujemny ładunek jonowy przy obojętnym lub kwaśnym pH11,12,14. Zmniejsza to ich ruchomość na podstawowej powierzchni, takiej jak celuloza PEI. Po rozwinięciu w kwaśnym buforze fosforanu potasu, mieszaniny mono-, di-, tri-, tetra- i pentafosforanu można łatwo rozdzielić na celulozie PEI, co pozwala na ilościowe określenie każdego gatunku (Rysunek 2, Rysunek 3). Takie testy można przeprowadzić przy użyciu lizatów komórkowych zawierających enzym będący przedmiotem zainteresowania, ale obejmuje to możliwość zubożenia substratu i/lub produktu przez aktywność innych kinaz, fosfataz i ogólnych ATPaz. W celu ilościowej oceny aktywności enzymu in vitro konieczne jest oczyszczenie enzymu będącego przedmiotem zainteresowania.

Tetrafosforan guanozyny (ppGpp) i pentafosforan guanozyny (ppGpp) są cząsteczkami sygnałowymi rybonukleotydu powstałymi w wyniku przeniesienia grupy pirofosforanowej z prekursora trifosforanu adenozyny (ATP) do, odpowiednio, substratu difosforanu guanozyny (GDP) lub tetrafosforanu guanozyny (GTP)15. Te pojedyncze sygnały rybonukleotydowe, znane zbiorczo jako (p)ppGpp, pośredniczą w ogólnokomórkowej odpowiedzi na stres środowiskowy, znanej jako odpowiedź rygorystyczna u różnych gatunków bakterii15,16. Dwie konserwatywne klasy enzymów katalizują powstawanie (p)ppGpp15,17 Enzymy homologu Rel/Spo (RSH) są "długimi" dwufunkcyjnymi syntetazą/hydrolazami (p)ppGpp, których nazwa pochodzi od ich podobieństwa do enzymów metabolicznych RelA i SpoT (p)ppGpp z Escherichia coli, które zawierają syntetazę, hydrolazę i domeny regulatorowe, podczas gdy małe enzymy syntetazy alarmonowej (SAS) są krótkimi monofunkcyjnymi syntetazami występującymi wyłącznie w Gram Pozytywne bakterie15,17,18. Bakteria Gram-dodatnia Clostridium difficile, tworząca przetrwalniki, koduje przypuszczalne geny RSH i SAS19. W tym miejscu przedstawiamy wstępne testy aktywności, które potwierdzają, że enzym RSH C. difficile jest katalitycznie aktywną syntetazą (p)ppGpp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Indukowalna nadekspresja białka z tagiem histydynowym

  1. Amplifikacja rsh z genomicznego DNA C. difficile R20291.
    1. Należy użyć polimerazy o wysokiej wierności i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Amplifikację C. difficile rsh należy przeprowadzić przy użyciu starterów
      rsh_F(CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) oraz
      rsh_R(CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), które wprowadzają znacznik heksahistydynowy na C-końcu.
      UWAGA: Miejsca cięcia KpnI i PstI w sekwencjach starterów zostały pogrubione.
    3. Wektor pMMBneo oraz produkt PCR rsh-his6 należy poddać trawieniu enzymami restrykcyjnymi Pstl i KpnI w temperaturze 37 °C przez 45 min.
    4. Zlinearyzowany wektor i fragmenty PCR należy oczyścić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie za pomocą zestawu do izolacji DNA z żelu.
    5. Należy zmierzyć absorbancję przy 280 nm (A280) wektora i amplifikowanego produktu PCR. Do wyznaczenia stężenia DNA każdego fragmentu należy użyć równania Wzór na stężenie DNA, [DNA]μg/mL = A260 × współczynnik rozcieńczenia × 50, stosowany w spektrofotometrii..
  2. Ligacja rsh do pMMBneo w celu ekspresji.
    1. Należy połączyć 25 ng trawionego wektora PMMBneo, 125 ng produktu genu rsh-his6 , 2 μL 10-krotnego buforu do ligacji oraz 1 μL ligazy DNA. Do uzupełnienia całkowitej objętości do 20 μL należy użyć wody wolnej od nukleaz. Inkubować w 16 °C przez 16 h.
      UWAGA: Efektywność ligacji zależy od wielkości fragmentu i musi być dostosowana do protokołów producenta.
    2. Produkt ligacji wektora należy wprowadzić do komórek E. coli DH5-α lub innego szczepu do utrzymywania plazmidów recA- . Transformowane komórki należy wyselekcjonować na płytkach LB z 100 μg/mL kanamycyny i inkubować przez 16–24 h w 37 °C.
    3. Z płytki (płytek) po transformacji należy pobrać cztery kolonie i każdą z nich wysiać na świeżą płytkę zawierającą 100 μg/mL kanamycyny w celu izolacji DNA. Nowe płytki inkubować w 37 °C przez 16–24 h i wybrać jeden izolat do późniejszej ekspresji białka.
    4. Aby potwierdzić prawidłową ligację nienaruszonej sekwencji kodującej białko rsh , należy pobrać kolonię wybranego izolatu do 20 μL wody, podgrzać w 95 °C przez 10 min i użyć jako matrycy do potwierdzającej reakcji PCR z użyciem tych samych starterów, których użyto do amplifikacji genu.
  3. Zweryfikowany plazmid należy wprowadzić zgodnie ze standardowymi protokołami transformacji plazmidów bakteryjnych E. coli do systemu E. coli BL21 w celu wysokowydajnej produkcji białka.
  4. Ekspresja RSH-His6 w E. coli.
    1. Należy wybrać pojedynczą kolonię E. coli BL21 transformowaną pMMBneo::rsh i zaszczepić 2 mL pożywki LB z 50 μg/mL kanamycyny. Inkubować w 37 °C przez 12–16 h przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
    2. W celu wzrostu komórek i ekspresji białka należy zaszczepić 500 mL pożywki LB zawierającej 50 μg/mL kanamycyny za pomocą 0,5 mL hodowli nocnej.
    3. Kulturę ekspresyjną inkubować w 37 °C i 250 rpm w inkubatorze z wytrząsaniem, aż gęstość komórek osiągnie OD600 0,167 w 37 °C.
    4. Należy obniżyć temperaturę w inkubatorze do 30 °C i odczekać 30 min, aż temperatura kultury spadnie.
    5. Ekspresję RSH należy indukować poprzez dodanie izopropyl-β-D-1-tiogalaktozydy (IPTG) do stężenia końcowego 0,5 mM. Indukcję przeprowadzać przez noc (przez 16–18 h) w 30 °C, wytrząsając z prędkością 250 rpm.
    6. Osad należy zebrać poprzez wirowanie przy 3 080 ×g przez 30 min w 4 °C.
      UWAGA: Osad można przechowywać przez noc w -20 °C w celu oczyszczenia białka docelowego następnego dnia bez zauważalnej utraty wydajności białka lub aktywności enzymatycznej.

2. Oczyszczanie białek metodą chromatografii powinowactwa do niklu

UWAGA: Po sklarowaniu lizatu komórkowego należy niezwłocznie przystąpić do poniższych etapów oczyszczania białka. Przechowywanie sklarowanego lizatu w temperaturze 4 °C przez noc przed późniejszym oczyszczaniem białka obniża wydajność białka.

  1. Oczyścić białko, wykorzystując 1 mL żywicy z kwasem nitrylooctowym i niklem (Ni-NTA) w kolumnie grawitacyjnej.
    1. Dzień przed użyciem równoważyć kolumnę przez noc w temperaturze 4 °C przy użyciu 2 mL buforu równoważącego (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 0,5 mg/mL lizozymu, 5 mM MgCl2, 10 mM imidazolu, 0,25 mM DTT, 5 mM fluorurek fenylometanosulfonylowy (PMSF), 10% glicerolu).
    2. Następnego dnia doprowadzić kolumnę z temperatury 4 °C do temperatury pokojowej (RT) przed nałożeniem oczyszczonego lizatu i pozostawić ją na ok. 2–3 h.
      UWAGA: Doprowadzenie kolumny do równowagi termicznej jest kluczowe, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza wewnątrz kolumny.
    3. Resuspendować osad otrzymany w kroku 1.3.6 w buforze do lizy (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 10% glicerolu, 0,5 mg/mL lizozymu, 10 mM imidazolu, 0,25 mM DTT i 5 mM PMSF).
    4. Sonicować komórki na lodzie w 8 interwałach po 10 s, z 30-sekundowymi przerwami między impulsami.
    5. Oczyścić lizat poprzez wirowanie w mikrocentryfudze przy 3 080 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C.
    6. Przygotować lizat, dodając równą objętość buforu do lizy, a następnie nałożyć przygotowany oczyszczony lizat na kolumnę i zebrać frakcję nieprzwiązaną.
    7. Ponownie nałożyć frakcję nieprzwiązaną z oczyszczonego lizatu na kolumnę i zebrać wtórną frakcję nieprzwiązaną.
    8. Przemyć kolumnę buforem do przemywania 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 30 mM imidazolu, 10% glicerolu). Zebrać frakcję przemywową.
      UWAGA: Dodatek 5 mM MgCl2 do buforów do przemywania i elucji jest ważny dla aktywności enzymatycznej oczyszczonego białka.
    9. Przemyć kolumnę buforem do przemywania 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4 i 50 mM imidazolu). Zebrać frakcję przemywową.
    10. Nałożyć 2 mL buforu do elucji (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10% glicerolu i 75 mM imidazolu). Zebrać eluat w dwóch frakcjach po 1 mL każda.
      UWAGA: Po tym kroku kolumnę można przechowywać w buforze równoważącym w temperaturze 4 °C, jeśli to samo białko ma być oczyszczane w kolejnym badaniu. Kolumnę można wykorzystać do 3 razy, jeśli jest przechowywana prawidłowo.
  2. Ocenić czystość frakcji z kolumny za pomocą SDS-PAGE.
    1. Aby jakościowo ocenić oczyszczanie białka, nałożyć alikwoty 20 μL wszystkich frakcji z kolumny na żel poliakryloamidowy 4%/10% i prowadzić elektroforezę przez 60 min przy 170 V.
    2. Barwić żel 0,1% błękitem Coomassie w temperaturze pokojowej przez 5 h, delikatnie kołysząc na wytrząsarce laboratoryjnej.
    3. Odbarwić żel w 40% metanolu i 10% lodowatym kwasie octowym przez noc w temperaturze pokojowej, kołysząc na wytrząsarce laboratoryjnej.
      UWAGA: Reprezentatywny żel przedstawiono na Rysunku 1.
  3. Dializować drugą frakcję eluatu przez noc w temperaturze 4 °C.
    1. Dializować przeciwko buforowi do dializy (15,7 mM Tris-HCl (pH 7,6), 471,9 mM NaCl, 15,69 mM MgCl2, 1,57 mM DTT, 1,5 mM PMSF i 15,7% glicerolu) w stosunku 200:1, używając urządzenia do dializy o pojemności 1 mL z progiem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 20 kDa.
    2. Określić stężenie zdializowanej próbki białka poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm, korzystając z obliczonego molowego współczynnika ekstynkcji 82085 M-1cm-1 20.
    3. Przechowywać alikwoty 5 μL zdializowanej próbki białka w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

3. Analiza aktywności białka metodą chromatografii cienkowarstwowej

  1. Przygotowanie płytki do chromatografii cienkowarstwowej.
    1. Przed przeprowadzeniem reakcji należy przygotować płytki z celulozy z polietylenoiminą (PEI), płucząc je wodą dejonizowaną. Płytki należy umieścić w szklanej komorze z wodą podwójnie destylowaną do głębokości ok. 0.5 cm.
    2. Należy odczekać, aż woda przemieści się do górnej krawędzi płytki.
      UWAGA: Płukanie płytek nie jest ściśle wymagane, gdyż można ich używać bez tego etapu, jednak płukanie zwiększa klarowność uzyskanych obrazów. Płukanie płytek w dwóch prostopadłych kierunkach dodatkowo zapewnia, że wszelkie zanieczyszczenia obecne w żywicy zostaną odizolowane w jednym rogu płytki (Rysunek 2).
    3. Płytki należy wyjąć ze szklanej komory i pozostawić na stojaku laboratoryjnym do wyschnięcia przez noc (12–18 h).
    4. Na wysuszonych płytkach należy zaznaczyć miękkim ołówkiem linię 2.0 cm od jednej z krawędzi, aby wskazać miejsca naniesienia próbek do TLC. W przypadku próbek o objętości 2 μL należy nanosić je w odstępach nie mniejszych niż 1.0 cm (Rysunek 2).
      UWAGA: Pozwala to na wyraźne oddzielenie sąsiednich plamek, co jest krytyczne dla kwantyfikacji sygnału. O ile żywica celulozowa nie zostanie zarysowana, niewielkie oznaczenia ołówkiem na powierzchni nie będą zakłócać migracji rozpuszczalnika.
    5. Planując eksperymenty, należy zawsze pozostawić jedną plamkę na każdej płytce nieużywaną.
      UWAGA: Zapewni to ślepą ścieżkę do kwantyfikacji próbek (Rysunek 2). Płytka TLC o długości 20 cm pomieści 19 plamek.
  2. Analiza aktywności enzymatycznej
    1. Należy przygotować 5-krotny bufor zawierający 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM octanu amonu, 10 mM KCl, 1 mM DTT oraz 0.6 mM ATP.
      UWAGA: Mieszaninę tę można przygotować w dużych ilościach i zamrozić w alikwotach po 10 μL do późniejszego użycia. Nie należy poddawać mieszaniny wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania.
    2. Należy przygotować poszczególne reakcje zawierające 3 μM RSH, 1x bufor, 0.6 mM GDP, 1.2 mM MgCl2. Do każdych 10 μL reakcji należy dodać 1.0 μCi γ-32P-ATP i dopełnić objętość reakcji do pożądanej wartości wodą wolną od nukleaz. RSH należy dodać po wymieszaniu pozostałych składników, ponieważ dodanie RSH do mieszaniny zawierającej nukleotydy inicjuje analizę aktywności enzymatycznej.
      UWAGA: Końcowa objętość reakcji będzie zależeć od liczby pobieranych punktów czasowych. Aby pobierać 2 μL na punkt czasowy, należy przygotować 10 μL mieszaniny reakcyjnej na każde 4 punkty czasowe.
    3. W celu kontroli hydrolizy ATP wywołanej zanieczyszczeniem nukleazami, należy przygotować reakcję o objętości 10 μL niezawierającą białka i inkubować ją równolegle. Próbki o objętości 2 μL należy nanieść w czasie t = 0 oraz na koniec eksperymentu, aby upewnić się, że ATP nie uległo hydrolizie wobec braku białka.
    4. Natychmiast po dodaniu RSH należy pobrać 2 μL i nanieść je na oznakowaną płytkę PEI-celulozową jako próbkę dla t = 0 min.
    5. Reakcję należy inkubować w temperaturze 37 °C, pobierając alikwoty 2 μL w wybranych punktach czasowych.
      UWAGA: Aktywność enzymatyczna ustanie w momencie adsorpcji próbki na płytce celulozowej. Przed rozwojem należy odczekać 10–30 min po naniesieniu ostatniej plamki na płytkę, aby zapewnić całkowitą adsorpcję i wyschnięcie próbki.
  3. Chromatografia cienkowarstwowa
    1. Komorę chromatograficzną należy napełnić 1.5 M KH2PO4 (pH 3.64) do głębokości 0.5 cm.
      UWAGA: Wymagana objętość zależy od wymiarów zbiornika chromatograficznego. Każdy szklany pojemnik z płaskim dnem, wystarczająco szeroki, aby umożliwić włożenie płytki TLC bez jej zginania, może służyć jako komora do rozwoju po dodaniu pokrywy. Płytkę TLC można pociąć na węższe paski czystą żyletką, co umożliwia rozwój w szklanym zlewce przykrytej folią plastikową.
    2. Dolną krawędź płytki należy zanurzyć w rozpuszczalniku. Należy pozwolić rozpuszczalnikowi przemieścić się do górnej krawędzi płytki (~90 min).
      UWAGA: Chociaż migracja rozpuszczalnika zatrzyma się na górze płytki, a próbki nie zostaną utracone ani nie zleją się podczas dłuższego zanurzenia, płytek nie powinno się pozostawiać w rozpuszczalniku przez noc. Zanurzenie dłuższe niż 4 h może spowodować oddzielenie się żywicy od podłoża płytki i doprowadzić do utraty sygnału.
    3. Płytkę należy wyjąć ze zbiornika chromatograficznego i umieścić na laboratoryjnym stojaku do suszenia.
    4. Płytkę należy pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez noc.
      UWAGA: Suszenie można przyspieszyć za pomocą suszarki do włosów. Stopień wysuszenia można ocenić po kolorze żywicy, która ciemnieje, gdy jest mokra, i wraca do koloru nieużywanej płytki po całkowitym wyschnięciu.
    5. Po wyschnięciu płytkę należy owinąć folią plastikową, aby uniknąć przeniesienia materiału radioaktywnego na kasetę obrazującą, a następnie przeanalizować za pomocą autoradiografii (Rysunek 3).
  4. Analiza danych
    1. Płytkę PEI-celulozową z rozdzielonymi reakcjami należy naświetlać kasetą do fosforimagera przez 4 h w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Jest to czas ekspozycji wystarczający do uzyskania bardzo wyraźnego obrazu przy zastosowaniu wskazanych stężeń świeżego γ-32P-ATP. W przypadku użycia mniejszych ilości substratu znakowanego radioaktywnie czas ekspozycji można zwiększyć do 12–16 h.
    2. Kasetę należy obrazować za pomocą fosforimagera.
    3. Korzystając z oprogramowania do obrazowania z graficznym interfejsem użytkownika, należy wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI), wybierając opcję Draw Rectangle i używając myszy do narysowania prostokątnych ROI wokół całej jednej ścieżki oraz plamek ATP i ppGpp znajdujących się w tej ścieżce (Rysunek 3).
    4. Należy użyć poleceń Select, Copy, and Paste (lub odpowiednich poleceń w zależności od używanego oprogramowania), aby narysować identyczne ROI w pozostałych ścieżkach, co zapewni pomiar sygnału w identycznych obszarach każdej ścieżki. Należy uwzględnić ROI z nieużywanej ścieżki, aby służyły jako tło.
    5. Używając poleceń Analyze | Tools | ROI Manager | Add w oprogramowaniu obrazującym, należy zaznaczyć wszystkie ROI narysowane na płytce PEI-celulozowej.
    6. Używając poleceń Analyze | Set Measurements | Measure, należy określić intensywność sygnału w każdym ROI i wyeksportować pomiary do arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 3). Od sygnałów eksperymentalnych należy odjąć wartości ROI tła.
    7. Należy obliczyć, jaki procent sygnału po odjęciu tła w każdej ścieżce przypada na ATP i ppGpp, korzystając z wzorów Wzór na obliczenie ATP ppGpp; analiza biochemiczna; równanie; metoda wyznaczania procentowego.
      UWAGA: ROI można wyznaczać i kwantyfikować przy użyciu komercyjnego oprogramowania kompatybilnego z fosforimagerem lub bezpłatnego oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy metodę oczyszczania powinowactwem syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile oraz ocenę jej aktywności enzymatycznej. Rysunek 1 demonstruje oczyszczanie białka uzyskane za pomocą chromatografii powinowactwa do metali. Druga frakcja elucji (E2) z tego procesu oczyszczania została poddana dializie i wykorzystana do testu aktywności enzymatycznej. Rysunek 2 szczegółowo opisuje kroki niezbędne do przygotowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy oczyszczanie znakowanego Hisem RSH z C. difficile i przedstawiamy metodę kwantyfikacji aktywności za pomocą znakowanej radioaktywnie chromatografii cienkowarstwowej. Metoda ta była wcześniej stosowana do oceny aktywności enzymów cyklazy diguanylanowej C. difficile, a także syntetazy (p)ppGpp, cyklazy nukleotydowej, kinazy i enzymów fosfodiesterazy z innych organizmów 11,12,13,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez NIAID 1K22AI118929-01. EBP było wspierane przez Summer Research Fellowship Program Grant z Office of Research at Old Dominion University, Norfolk, Virginia, USA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
indukowalna nadekspresja białka znakowanego histydyną
Phusion polimerazaNew England Biolabs (NEB)M0530L
QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żelu DNAQiagen20021
Enzym restrykcyjny KpnINEBR0142S
Enzym restrykcyjny PstINEBR0140S
Ligaza DNA T4NEBM0202
NEB® 5-alfa kompetentny E. coli ( Wysoka wydajność)NEBC2987I
BL21 (DE3) Kompetentny E. coliNEBC2527I
Wirówka IPTGSigma-Aldrich10724815001
JXN-26 z wirnikiem JLA 10.500Beckman Coulter Avanti-Microwirówka
z wirnikiem D3024/D3024RScilogex-MaxQ
SHKE6000 InkubatorThermoScientific-Procesor
ultradźwiękowySonicsVC-750
Oczyszczanie białek metodą chromatografii powinowactwa do niklu
Ni-NTAżywica G Biosciences786-940/941
Pierce Jednorazowe kolumny grawitacyjne, 10 mlThermo Scientific29924
1 ml urządzenia do dializy Spectra/ Por float-A-lyzer G2 (MWCO: 20 kD)SpectrumG235033
Mini-proteuszowa komórka elektroforetycznaBioRad1658004
Badanie aktywności białek metodą chromatografii cienkowarstwowej
Chromatograf cienkowarstwowy (TLC) Zbiornik rozwojowyGeneral Glass Blowing Company80-3
Płyty polietyleninowe (PEI)-celulozowe (20 cm x 20 cm, 100 μ m grubości) z poliestrowym nośnikiemSigma-AldrichZ122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml ołów, 100 μ CiPerkin ElmerNEG002A
5'-trifosforan adenozyny (ATP) 100 mMBio Basic CanadaAB0311
Sól disodowa guanozyno-5'-difosforanu (GDP)Alfa AesarAAJ61646MC/E
Przechowywanie ekranu fosforowegoGE Healthcare Nauki przyrodniczeBAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 luminoimagerGE Healthcare Nauki przyrodnicze-

Bibliografia

  1. Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6(2005).
  2. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
  3. Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
  4. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  5. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
  6. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  7. Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
  8. Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
  9. Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
  10. Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
  11. Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
  12. Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
  13. Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
  14. Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
  15. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical? Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  16. Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
  17. Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
  18. Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
  19. Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
  20. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  21. Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
  22. Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
  23. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
  24. Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
  25. US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Syntetaza pppGppchromatografia cienkowarstwowaoczyszczanie bia ekpomiar aktywno ci enzymatycznejenzymy fosfotransferazyautoradiografiaaktywno kinazy bia kowejsynteza cyklicznego diguanylanusubstrat promieniotw rczy

Powiązane artykuły