Artykuł metodologiczny

Cyfrowa analiza barwienia immunologicznego białka oddziałującego ZW10 w tkankach płuc człowieka

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58551

⸱

1 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, 5Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

W tym artykule

Podsumowanie

Białko oddziałujące ZW10 (ZWINT) uczestniczy w punkcie kontrolnym wrzeciona mitotycznego i patogenezie raka. W tym miejscu przedstawiamy metodologię barwienia immunologicznego ZWINT w tkankach ludzkiego raka płuca, a następnie cyfrowe skanowanie całych preparatów i analizę obrazu. Ta metodologia może zapewnić wysokiej jakości obrazy cyfrowe i wiarygodne wyniki.

Streszczenie

Celem tego badania jest wprowadzenie metodologii barwienia immunologicznego tkanek płuc ludzkich, a następnie cyfrowego skanowania całego preparatu i analizy obrazu. Skanowanie cyfrowe to szybki sposób skanowania stosu slajdów i tworzenia obrazów cyfrowych o wysokiej jakości. Może dawać wyniki zgodne z konwencjonalną mikroskopią świetlną (CLM) przez patologów. Co więcej, dostępność obrazów cyfrowych sprawia, że ten sam slajd może być jednocześnie obserwowany przez wiele osób. Co więcej, cyfrowe obrazy preparatów mogą być przechowywane w bazie danych, co pozwala uniknąć długotrwałego niszczenia szkiełek. Ograniczenia tej techniki są następujące. Po pierwsze, potrzebna jest wysokiej jakości przygotowana tkanka, a oryginalna immunohistochemia (IHC) szkiełkuje bez żadnych uszkodzeń i nadmiaru pozostałości szczeliwa. Po drugie, obszary guza lub nienowotworowe powinny być określone przez doświadczonych patologów przed analizą za pomocą oprogramowania, aby uniknąć nieporozumień dotyczących guza lub obszarów nienowotworowych podczas oceniania. Po trzecie, operator musi kontrolować odwzorowanie kolorów w całym procesie digitalizacji w obrazowaniu całego slajdu.

Wprowadzenie

Białko oddziałujące ZW10 (ZWINT) jest niezbędnym składnikiem kompleksu kinetochorowego, który jest zaangażowany w punkt kontrolny wrzeciona mitotycznego1,2,3. Doniesiono, że wyczerpanie ZWINT prowadzi do nieprawidłowej przedwczesnej segregacji chromosomów1,2,3. Ostatnie badania sugerują, że ZWINT bierze udział w patogenezie wielu nowotworów poprzez promowanie proliferacji komórek nowotworowych4,5. Wcześniej informowaliśmy o nadekspresji ZWINT w raku płuc5. Powszechnie przyjmuje się, że analiza preparatów przez patologów przy użyciu CLM jest czasochłonna i nie jest ilościowa6,7,8. Co więcej, pogorszenie stanu przechowywanych szkiełek może uniemożliwić wycofanie wcześniej utworzonych szkiełek. Pojawiająca się metoda komputerowego, cyfrowego obrazowania całego preparatu (WSI) może przezwyciężyć te ograniczenia6,7,8.

W tym celu opisujemy metodologię barwienia immunologicznego ZWINT w tkankach ludzkiego raka płuc, połączoną z cyfrowym skanowaniem całego slajdu i analizą obrazu opartą na oprogramowaniu. Główną zaletą tej metodologii jest uzyskanie wyników zgodnych z CLM. Technologia ta może być szeroko stosowana w obszarach patologicznej oceny barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E) i IHC, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), mikromacierzy tkankowych (TMA) oraz odkrywania i opracowywania leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan i Szpitala Renmin Uniwersytetu Wuhan.

1. Przygotowanie slajdów IHC

  1. Utrwalić próbkę tkanki płucnej, zanurzając fragment ludzkiej tkanki płucnej (około 3 x 3 cm) w 4% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Odwodnić tkankę w 80%, 95% i 100% etanolu odpowiednio przez 15 minut, 20 minut i 20 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec zanurz chusteczkę w 100% ksylenie 3x po 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. W celu zatopienia zanurzyć tkankę w parafinie (63 °C) na 30 minut. Zmienić parafinę i ponownie zanurzyć tkankę na kolejne 45 minut. Na koniec należy ponownie zmienić parafinę i zanurzyć w niej tkankę na dodatkowy 1 h.
  4. Za pomocą mikrotomu obrotowego pokrój tkankę na odcinki o grubości 5 μm i umieść je na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną o pojemności 20 μg/ml.
  5. W celu odparafinowania umieścić szkiełka w piecu o temperaturze 65 °C na 2 godziny, a następnie zanurzyć skrawki w dimetylobenzenie na 15 minut, a następnie namoczyć w 100% ksylenie przez 15 minut.
  6. Nawilżaj szkiełka z sekcjami tkanek 2x przez 5 minut w 100% etanolu, a następnie poddaj je działaniu seryjnie rozcieńczanego etanolu przez 5 minut w 95% etanolu, 5 minut w 80% etanolu, 5 minut w 70% etanolu i 5 minut w 50% etanolu.
  7. Wykonaj naprawę antygenu.
    1. Rozcieńczyć płyn naprawczy z kwasem cytrynowym (20x) do 1x z podwójnie destylowanymH2O(ddH2O).
    2. Umieść szkiełka z sekcjami tkanek i 1x płynem naprawczym kwasu cytrynowego (300 ml) w pudełku naprawczym antygenu, a następnie podgrzej je w kuchence mikrofalowej z dużą mocą przez 2 minuty, a następnie podgrzej przy niskiej mocy, aby utrzymać wrzenie przez 6 minut.
    3. Pozwól sekcjom naturalnie ostygnąć do temperatury pokojowej.
    4. Zastąp płyn naprawczy kwasu cytrynowego 0,01 M PBS, umyj sekcje 3x, za każdym razem przez 5 minut, w wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej.
  8. Wyeliminuj endogenną peroksydazę.
    1. Rozcieńczyć 30% H2O2 do 3% za pomocą ddH2O, dodać do szkiełek (upewnić się, że pokrywa wszystkie tkanki) i inkubować szkiełka w mokrym pudełku w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      Uwaga: Mokre pudełko to plastikowe pudełko o wymiarach 10 x 15 cm, które może zawierać wodę.
    2. Umyj szkiełka 3x, za każdym razem przez 5 minut, 0,01 M PBS w wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej.
  9. Zablokuj niespecyficzny antygen.
    1. Rozcieńczyć skoncentrowaną normalną surowicę kozią do 10% surowicy koziej za pomocą PBS z 0,1% Tween 20 (PBST).
    2. Dodać 10% koziej surowicy do szkiełek i inkubować je w mokrym pudełku w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      Uwaga: Surowica kozia powinna pokrywać wszystkie tkanki w szkiełkach.
  10. Poplamić tkanki.
    1. Inkubować szkiełka z króliczym przeciwciałem anty-ludzkim anty-ZWINT (1:50) w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Umyj szkiełka 3 razy, za każdym razem przez 5 minut, 0,01 M PBST (1 ml 0,1% Tween 20 w 1,000 ml PBS) w wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować szkiełka z przeciwciałem drugorzędowym (system wykrywania przeciwciał przeciw królikom, 1:200) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Umyć szkiełka 3x, za każdym razem przez 5 minut, 0,01 M PBST w wytrząsarce obrotowej.
  11. Aby uwidocznić barwienie immunologiczne, dodaj szkiełka do 300 μl świeżej 3,3-diaminobenzydyny, a następnie umyj szkiełka wodą z kranu o temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Stopień zabarwienia jest monitorowany pod mikroskopem (powiększenie 10X - 40X).
  12. Przeciwplamić tkankę. Szkiełka należy barwić roztworem barwiącym hematoksylinę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie myć szkiełka wodą z kranu przez 15 minut
    Uwaga: Jądro pod mikroskopem wydaje się niebieskie (powiększenie 10X - 40X). Jeśli stopień zabarwienia na niebiesko jest silniejszy, można zastosować różnicowanie alkoholu solnego przez 3 - 5 sekund, a następnie spłukać tkankę z powrotem do niebieskiego koloru wodą z kranu przez 15 minut, aby ułatwić wyraźne zabarwienie tkanki.
  13. Odwadniać szkiełka przez 5 minut w 50% etanolu, 5 minut w 70% etanolu, 2x w 80% etanolu przez 5 minut, 5 minut w 95% etanolu, a na koniec 2x po 5 minut w 100% etanolu w temperaturze pokojowej.
  14. Aby uzyskać przezroczystość, zanurz skrawki tkanki w zbiorniku zawierającym 100% ksylenu na 15 minut i przenieś skrawki do innego zbiornika zawierającego 100% ksylenu na 15 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Do uszczelnienia weź 50 - 100 μl neutralnej gumy i dodaj 5% ksylenu do mieszanki (unikaj mieszania w bąbelkach). Dodać 15 μl wyżej wymienionej mieszaniny do skrawków tkanki płucnej. Uszczelnij folię szkłem nakrywkowym i delikatnie wyciśnij bąbelki.

2. Automatyczne skanowanie slajdów IHC na całej powierzchni

  1. Pozostaw uszczelnione szkiełka do wyschnięcia na 12 godzin w temperaturze pokojowej, aby je wysuszyć.
  2. Wybierz opcję Jasne pole ręcznie i przejdź do interfejsu skanowania ręcznego.
  3. Popraw nazwy slajdów i wybierz ścieżkę przechowywania obrazów.
  4. Ustaw obszar skanowania i wybierz opcję Skanuj próbki przy użyciu progów ustawionych przez użytkownika. Próg wynosi około 50 przy wartości rozszerzalności obszaru skanowania 200 μm.
  5. Ustaw wartość ostrości skanowania, wybierz ostrość automatycznie — w zakresie od 1050 do 2650 — a na koniec wybierz tryb jednowarstwowy.
  6. Załaduj slajdy IHC na stację roboczą i rozpocznij automatyczne skanowanie.
    Uwaga: Upewnij się, że prowadnice nie są uszkodzone. Utrzymuj szkiełka w czystości i półprzezroczyste oraz unikaj kurzu, konfetti i nadmiaru pozostałości szczeliwa na slajdach. Szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe powinny być pozbawione śladów. Nie czyścić szkiełek ksylenem. Rozmiar szkiełek podano w tabeli 1.
  7. Automatycznie skanuj cały wycinek tkanki na szkiełku z powiększeniem 20x, 40x lub 100x.
  8. Zbierz i zapisz obrazy po zakończeniu skanowania całego slajdu.

3. Analiza slajdów za pomocą oprogramowania do obrazowania

  1. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu histopatologicznego i wybierz opcję Komputer lokalny.
  2. Otwórz plik, w którym przechowywane są dane skanowania.
  3. Wybierz odpowiedni poziom powiększenia z zakresu od 2X do 40X.
  4. Dostosuj kolor, aby ustawić optymalny kontrast za pomocą opcji Przełącz regulację koloru.
  5. Ręcznie zakreśl i nazwij interesujące Cię części na każdym obrazie.
    Uwaga: Na przykład możesz zakreślić jeden obszar i nazwać go obszarem guza
    6. .
  6. Wybierz Wtyczki i kontrola jakości. W tym momencie pojawi się kreator scenariuszy.
  7. Wybierz opcję Density quant (Kwantowa gęstość) i dostosuj pasek wykrywania.
    Uwaga: Ten proces należy wykonać ostrożnie. Pasek tolerancji niebieskiego służy do regulacji koloru jądra komórkowego. Pasek tolerancji brązu służy do dostosowywania nasycenia koloru wypełnienia na obrazie. Wyniki obrazów po korektach powinny być zgodne z oryginalnymi odpowiednikami.
  8. Dostosuj poziomy punktacji, aby intensywność barwienia zakreślonych obszarów była zbliżona do intensywności oryginalnych obrazów.
    Uwaga: Ciemnobrązowy oznacza silny pozytyw, brązowawo-żółty jest umiarkowanie pozytywny, jasnożółty jest słabo pozytywny, a biały jest negatywny.
  9. Zapisz i nazwij model jako plik. Zastosuj model do innych slajdów i wybierz opcję Wybrana adnotacja".
  10. Pozwól oprogramowaniu automatycznie obliczyć wskaźnik H dla zakreślonych obszarów na obrazie.

4. Kwantyfikacja wyników za pomocą systemu punktacji H9,10

  1. Oblicz procentowy udział barwienia immunologicznego i intensywność barwienia (0: negatywny, 1+: słaby, 2+: umiarkowany, 3+: silny).
  2. Użyj systemu punktacji (H-score), aby obliczyć patologiczne nachylenie guza i sąsiednich obszarów nienowotworowych.
    Uwaga: Wynik H = (% komórek o słabej intensywności x 1) + (% komórek o umiarkowanej intensywności x 2) + (% komórek o dużej intensywności x 3). Dlatego maksymalny wynik H wynosi 300, jeśli 100% komórek jest oznaczanych ilościowo z dużą intensywnością.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Za pomocą IHC zmierzyliśmy poziomy ekspresji ZWINT w 28 parach próbek niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) (tkankach nowotworowych i sąsiednich tkankach nienowotworowych), w tym w 14 przypadkach raka плоскоkomórkowego (SCC) i 14 przypadkach gruczolakoraka (ADC). Cyfrowe skanowanie całych preparatów dostarczyło obrazów cyfrowych wysokiej jakości (Rycina 1A). Wyniki wykazały, że H-score w raku płuca był znacząco wyższy niż w sąsiednich tkankach nienowotworow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Skanowanie całych preparatów staje się gorącym tematem ze względu na solidne skanowanie i produkcję wysokiej jakości obrazów do celów klinicznych i badawczych 11,12,13. Obrazy mogą być tworzone przez mikroskopy skaningowe w ciągu kilku minut 11,12,13. Stosując tę metodologię, uzyskaliśmy wysokiej jakości obrazy dla szkiełek ZWINT IHC i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez Narodową Fundację Naturalną Chin (nr 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 i 81501352) oraz Fundację Naturalną Prowincji Hubei (Chiny) (nr 2017CFB631). Autorzy wyrażają uznanie dla Guo Qin, Chang Min, Li Hui i ich kolegów z Wuhan Google Biological Technology Co., LTD za ich wsparcie techniczne. Autorzy dziękują również Muhammadowi Jamalowi za redakcję językową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pannoramic MIDI3D HISTECHKat: PMIDI-040709Zautomatyzowany cyfrowy skaner slajdów z niezwykłym zestawem funkcji: pojemność 12 slajdów, skanowanie fluorescencyjne i wiele innych.
QuantCenter3D HISTECHPobrane z oficjalnej strony internetowej firmyFramework dla aplikacji do analizy obrazu firmy 3DHISTCH.
LEICA RM2235Leica MicrosystemsCat: 14050038604Zwiększona precyzja nowych akcesoriów zwiększy wygodę zbliżania się do noża, a także orientacji próbki.
Królicze przeciwciało anty-ludzkie anty-ZWINTAbcamKot: ab197794Analiza immunohistochemiczna ZWINT w ludzkiej tkance płucnej.
Przeciwciało wtórne przeciw królikowiWuhan Goodbio TechnologyCat:GB23303-1Przeciwciało drugorzędowe do barwienia IHC.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiWuhan Goodbio TechnologyCat:G0002Roztwór zawierający bufor fosforanowy.
OLYMPUS CX23OLYMPUSCat:6M87620Mikroskop do wykrywania H& Prowadnice E lub IHC.
Odczynnik chemiczny DimethylbenzeneShanghai LingfengKategoria: 1330-20-7Bezbarwny, łatwopalny płyn stosowany jako rozpuszczalnik i środek klarujący w przygotowywaniu skrawków tkanek do badań mikroskopowych.
Roztwór do barwienia hematoksylinyWuhan Servicetechnologia bioKot: G1039Jest powszechnie stosowany do badań histologicznych, często barwi jądra komórek na niebiesko.
Tween 20BaitgCat:2005-64-5Jest to niejonowy środek powierzchniowo czynny typu polisorbatowego powstały w wyniku etoksylacji sorbitanu przed dodaniem kwasu laurynowego. Jest stosowany jako środek odstraszający i emulgujący w zastosowaniach farmakologicznych.
Płyn naprawczy z kwasem cytrynowymTechnologia Wuhan ServicebioCat: G1202Is służy do naprawy antygenu po utrwaleniu podczas procedury IHC.
LEICA ASP200sLeicaCat: 14048043626Został zaprojektowany do rutynowych i badawczych badań histopatologicznych do 200 kaset.
LEICA Arcadia H Leica Cat: 14039354103Jest to podgrzewana stacja do zatapiania parafiny, która pozwala na prostą obsługę i precyzyjną kontrolę, co skutkuje lepszą jakością, płynnym przepływem pracy i niezawodnością.
LEICA Arcadia CLeicaCat: 14039354102Jest to zimna płyta mieszcząca ponad 60/65 kaset na dużej powierzchni roboczej. Został zaprojektowany z adaptacyjnym modułem sterującym środowiskiem, aby zapewnić, że temperatura robocza jest zawsze stabilizowana na poziomie -6°C.
Oprogramowanie CaseViewer3DHISTECH

Bibliografia

  1. Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
  2. Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
  3. Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
  4. Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
  5. Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
  6. Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
  7. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
  8. Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
  9. Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
  10. Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106(2018).
  11. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
  12. Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
  13. Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
  14. Hofman, F. M., Taylor, C. R. Immunohistochemistry. Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).
  15. Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  16. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
  17. Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
  18. Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
  19. Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
  20. Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
  21. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Skanowanie ca ych preparat wcyfrowa analiza obrazuprzygotowanie tkanekodmaskowywanie antygen wznakowanie przeciwcia amibarwienie DABprzeciwbarwienie hematoksylinobliczanie wyniku APEekspresja ZWINT

Powiązane artykuły